CD34Count Kit

CD34Count Kit
Nr kat. K2370
Wydanie 2.
Do identyfikacji i wyliczania komórek CD34+ w próbkach mobilizowanej krwi ludzkiej i próbkach
z leukaferezy.
Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 50 podwójnych testów.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 1/14
Spis treści
Strona
Przeznaczenie .............................................................................................................................. 3
Streszczenie i informacje ogólne .................................................................................................. 3
Zasady procedury......................................................................................................................... 3
Odczynniki.................................................................................................................................... 4
Dostarczane materiały ............................................................................................................. 4
Materiały wymagane, ale niedostarczane................................................................................. 4
Przygotowanie odczynników......................................................................................................... 5
Środki ostroŜności ........................................................................................................................ 5
Przechowywanie........................................................................................................................... 6
Pobieranie i przygotowanie próbek ............................................................................................... 6
Procedura barwienia..................................................................................................................... 7
Barwienie komórek i dodawanie kulek kontrolnych .................................................................. 7
Wskazówka, pipetowanie odwrotne z „mokrą końcówką”......................................................... 7
Kontrola jakości ............................................................................................................................ 8
Próbka kontrolna...................................................................................................................... 8
Kontrola jakości na podstawie czasu........................................................................................ 8
Testy podwójne........................................................................................................................ 8
Akwizycja danych ......................................................................................................................... 8
Konfiguracja akwizycji dla zestawu CD34Count Kit.................................................................. 9
Analiza danych ........................................................................................................................... 11
Wyniki......................................................................................................................................... 12
Przypisanie wartości ................................................................................................................... 12
Ograniczenia metody.................................................................................................................. 12
Rozwiązywanie problemów......................................................................................................... 13
Urządzenie pomiarowe ............................................................................................................... 13
Piśmiennictwo............................................................................................................................. 14
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 2/14
Przeznaczenie
Do diagnostyki in vitro z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Zestaw CD34Count Kit jest
testem przeznaczonym do diagnostyki in vitro, słuŜącym do identyfikacji i wyliczania
CD34-dodatnich (CD34+) krwiotwórczych komórek macierzystych w próbkach mobilizowanej
ludzkiej krwi obwodowej i próbkach z leukaferezy.
Streszczenie i informacje ogólne
Krwiotwórcze komórki progenitorowe (KKP) mogą być mobilizowane ze szpiku kostnego do krwi
obwodowej (KO) przy uŜyciu środków cytotoksycznych, cytokin lub kombinacji obu tych metod.
Mobilizacja taka umoŜliwia zebranie (metodą aferezy) krwiotwórczych komórek progenitorowych w
ilościach wystarczających do przeszczepu (1, 2). W ostatnim dziesięcioleciu wyraźnie wzrosło
zainteresowanie wykorzystaniem komórek macierzystych krwi obwodowej (KMKO) do
przeszczepów, a w przypadku przeszczepów autologicznych krew obwodowa jest teraz
preferowanym źródłem KKP, zastępując w tej roli szpik kostny. Tradycyjnie prognozy co do
potencjału regeneracyjnego opierano na bezwzględnej liczbie komórek jednojądrzastych w szpiku
w stosunku do masy ciała biorcy. Jednak metoda ta jest niewystarczająca w przypadku próbek
KMKO, poniewaŜ charakteryzują się one róŜną zawartością KKP. Pod koniec lat 80. XX w.
ostatecznie ustalono, Ŝe niemal cała aktywność komórek zdolnych do tworzenia kolonii oraz
potencjał regeneracyjny próbek szpiku lub krwi obwodowej skupia się w niewielkiej populacji
komórek zawierających antygen CD34 (3). CD34 to antygen powierzchniowy, który w przypadku
komórek krwiotwórczych występuje wyłącznie we wczesnych progenitorach wszystkich linii
komórkowych (1, 2). A zatem KKP CD34+ wykazują zdolność do przywracania hematopoezy wielu
linii komórkowych u pacjentów z uszkodzeniami szpiku. Wykazano (1, 2), Ŝe liczba komórek
CD34+ ustalona metodą cytometrii przepływowej przypadająca na kilogram masy ciała biorcy jest
najbardziej uŜytecznym wskaźnikiem zdolności przeszczepionych komórek macierzystych krwi
obwodowej (KMKO) do przywracania hematopoezy.
Sutherland i in. (5) opracowali dla stowarzyszenia „International Society for Hematotherapy and
Graft Engineering” (ISHAGE, Międzynarodowe Stowarzyszenie Hematoterapii i InŜynierii
Przeszczepów) zestaw wytycznych klinicznych upraszczających i standaryzujących zasady
wyliczania komórek CD34+. Zestaw CD34Count Kit jest zgodny z tymi wytycznymi i zawiera
przeciwciała skierowane przeciwko CD45/FITC oraz przeciwko CD34/RPE, umoŜliwia zatem
identyfikację leukocytów (CD45+) oraz weryfikację „prawdziwych” komórek CD34+ na podstawie
słabej fluorescencji CD45 i słabszego rozproszenia bocznego (CD45dim, SSClow). Dodanie kulek
CytoCount™ do zawiesiny komórkowej pozwala na określenie stęŜenia komórek CD34+ na
jednostkę objętości oryginalnej próbki (tj. bezwzględnej liczby komórek CD34+) w ramach jednego
badania metodą cytometrii przepływowej (technika jednoplatformowa) (1-3). W technice
jednoplatformowej występuje mniej źródeł zmienności niŜ w powszechnie uŜywanej wcześniej
technice dwuplatformowej, a badania wieloośrodkowe wykazały, Ŝe zapewnia ona lepszy
współczynnik zmienności, zaś ryzyko wygenerowania błędnych wyników jest niŜsze (4).
Dodanie opcjonalnego barwnika DNA, 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD), równieŜ wchodzącego w
skład zestawu, umoŜliwia wykluczenie martwych komórek z analizy (1, 2). Barwnik 7-AAD
dyfunduje wyłącznie do martwych komórek i tylko takie komórki barwi, poniewaŜ ich błona
komórkowa nie jest nienaruszona.
Zasady procedury
Zestaw CD34Count Kit opracowano z myślą o stworzeniu optymalnej metody wyliczania komórek
CD34+ zgodnie z wytycznymi ISHAGE dotyczącymi techniki jednoplatformowej (1, 2, 5).
Test jest zdublowany i polega na wybarwieniu próbki dwubarwnym odczynnikiem zawierającym
przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD45/FITC oraz przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD34/RPE.
Po wybarwieniu próbki erytrocyty są poddawane lizie przy uŜyciu odczynnika na bazie chlorku
amonu, zaś jeśli poŜądana jest ocena Ŝywotności komórek, do próbki dodawany jest (opcjonalny)
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 3/14
barwnik 7-AAD. Do próbki pełniącej rolę wewnętrznej populacji odniesienia dodawane są
fluorescencyjne kulki kontrolne (CytoCount™).
W trakcie analizy istnieje moŜliwość ustalenia bezwzględnego stęŜenia komórek CD34+ w próbce;
naleŜy w tym celu podzielić liczbę zdarzeń CD34 przez liczbę zdarzeń wywołanych przez kulki
fluorescencyjne, a następnie pomnoŜyć przez stęŜenie kulek w materiale CytoCount™.
W wytycznych ISHAGE wskazane jest uŜycie strategii ograniczeń dwuwartościowych w celu
zdefiniowania rzeczywistych komórek progenitorowych wykazujących potencjał regeneracyjny.
Realizuje się to poprzez wybarwienie kontrastowe komórek CD34+ przeciwciałem skierowanym
przeciwko CD45/FITC, co pozwala na wyeliminowanie z analizy zanieczyszczeń i zdarzeń
związanych z barwieniem nieswoistym (1, 2). Co waŜne, rozwiązanie takie pozwala takŜe na
rozróŜnienie między KKP, które wykazują stosunkowo słabą ekspresję białka CD45 na
powierzchni błony, a limfocytami i monocytami, które wykazują silną ekspresję. Niezłośliwe
krwiotwórcze komórki macierzyste CD34+ i prekursory tworzą wyodrębnione zgrupowania na
wykresach — podobnie jak limfocyty, monocyty i granulocyty, tworzące wyodrębnione
zgrupowania na dwuwymiarowych wykresach CD45 / rozproszenie boczne (SSC). Dodanie kulek
referencyjnych w znanym stęŜeniu umoŜliwia obliczenie bezwzględnego stęŜenia komórek CD34+
w oryginalnej próbce, tj. określenie liczby komórek CD34+ w µL próbki.
Wykluczenie komórek martwych z wyliczenia komórek CD34+ jest opcjonalne; uzyskuje się je
poprzez dodanie barwnika DNA, 7-AAD, który umoŜliwia rozróŜnienie komórek Ŝywych od
niezdolnych do Ŝycia. Barwnik 7-AAD wzbudza się przy długości fali 488 nm i ma maksimum emisji
przy 660 nm. Dodanie barwnika 7-AAD jest szczególnie zalecane podczas analizy próbek z
leukaferezy przechowywanych przez czas dłuŜszy niŜ cztery godziny lub rozmroŜonych.
Odczynniki
Dostarczane materiały
Fiolka 1
Monoclonal Mouse Anti-Human CD45/FITC, Clone T29/33 +
Monoclonal Mouse Anti-Human CD34/RPE, Clone BIRMA-K3
1 mL, gotowy do uŜycia
Fiolka 2
Fiolka 3
Fiolka 4
EasyLyse™
2 x 5 mL, stęŜony 20x
Odczynnik powodujący lizę erytrocytów, na bazie chlorku amonu
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)
1 mL (0,01% wagowo-objętościowo), gotowy do uŜycia
Do barwienia w celu oceny Ŝywotności
CytoCount™
17 mL, gotowy do uŜycia po odtworzeniu zawiesiny
Kulki kontrolne
Materiały wymagane, ale niedostarczane
1.
2.
3.
4.
5.
Probówki polistyrenowe 12 x 75 mm.
Pipeta skalibrowana do objętości 10 µL i 100 µL.
Mieszadło do krwi lub mieszadło rotacyjne do odtwarzania zawiesiny kulek CytoCount™.
Woda dejonizowana lub destylowana.
Mieszadło wirowe.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 4/14
6.
7.
8.
9.
Dozownik lub pipetor (2 mL) do odmierzenia 2 mL odczynnika EasyLyse™.
Bufor fosforanowy (PBS) do ewentualnego rozcieńczenia próbki.
Sheat Fluid.
Próbki kontrolne CD34+.
Przygotowanie odczynników
1. Rozcieńczyć wymaganą ilość odczynnika EasyLyse™, fiolka 2, 1+19 wodą dejonizowaną o
temperaturze pokojowej. Zamiast tego moŜna wymieszać zawartość jednej buteleczki (5 mL)
EasyLyse™ z 95 mL wody dejonizowanej o temperaturze pokojowej. Odczynnik do lizy nie moŜe
być uŜywany z wodą wodociągową.
2. Wyjąć fiolkę 4, CytoCount™, z chłodziarki (2–8 °C). Upewni ć się, Ŝe nakrętka jest szczelnie
zamknięta, aby uniknąć wycieku płynu, i dobrze zamieszać, aby w pełni odtworzyć zawiesinę
kulek. NaleŜy unikać mieszania za pomocą mieszadła wirowego, poniewaŜ stwarzałoby to
ryzyko wprowadzenia pęcherzyków powietrza i w efekcie zmniejszenia rzeczywistej objętości
pipetowanej zawiesiny kulek. Zaleca się umieszczenie zawiesiny kulek w mieszadle rotacyjnym
na 5–60 minut, aby uniknąć opadnięcia kulek, zanim zawiesina będzie potrzebna. Przed
uŜyciem odczynnika CytoCount™ naleŜy odczekać, aŜ ogrzeje się on do temperatury
pokojowej.
Środki ostroŜności
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
Fiolka 1, przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD45/FITC + przeciwciała przeciwko ludzkiemu
CD34/RPE, zawiera materiał pochodzenia zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku kaŜdego
produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie
procedury postępowania.
Nie zamraŜać Ŝadnego z odczynników ani nie wystawiać odczynników na bezpośrednie
działanie światła.
Fiolka 3, 7-AAD, zawiera barwnik wiąŜący kwasy nukleinowe. StęŜenie barwnika w roztworze
wynosi 0,01%, dlatego roztwór nie wymaga oznakowania właściwego dla substancji
niebezpiecznych. Nie określono właściwości toksykologicznych tego barwnika.
StęŜenie kulek w fiolce 4, CytoCount™, jest róŜne w kaŜdej partii. StęŜenie kulek (C) i
odchylenie standardowe (S) jest podane na fiolce jako liczba kulek na µL.
Fiolki 1, 2, 3 i 4 zawierają azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w
czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest
sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z
ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po
usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w
kanalizacji.
Fiolka 4, CytoCount™, powinna być przechowywana w pozycji pionowej i szczelnie
zamknięta, aby zapobiec wyciekowi płynu. Przed uŜyciem kulek CytoCount™ naleŜy
starannie odtworzyć ich zawiesinę. Gwałtowne mieszanie kulek CytoCount™ w mieszadle
wirowym moŜe powodować przedostanie się do płynu pęcherzyków powietrza, a w
konsekwencji zmniejszyć faktyczną objętość pipetowanej zawiesiny kulek CytoCount™.
Zalecane jest delikatne mieszanie (np. w mieszadle rotacyjnym lub mieszadle do probówek).
NaleŜy uwaŜać, aby nie rozlać nawet minimalnej ilości odczynnika CytoCount™ przed
odtworzeniem zawiesiny, gdyŜ w przeciwnym razie liczba kulek będzie nieprawidłowa.
W razie stwierdzenia wycieku z fiolki 4, CytoCount™, w otrzymanym zestawie nie naleŜy
uŜywać kulek. NaleŜy skontaktować się z działem technicznym firmy Dako w celu wymiany
fiolki 4.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 5/14
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Kluczowe znaczenie ma uŜywanie tej samej skalibrowanej pipety oraz techniki pipetowania
odwrotnego z „mokrą końcówką” zarówno do próbki, jak i do kulek CytoCount™. WaŜne jest
dokładne odmierzenie pipetowanej objętości kulek CytoCount™ oraz próbki. Objętości
odczynnika zawierającego przeciwciała oraz odczynnika do lizy nie mają newralgicznego
znaczenia przy określaniu bezwzględnej liczby komórek CD34+; istotny jest natomiast
stosunek objętości próbki do objętości kulek.
Zaleca się ustawienie wartości progowej na FL1 (515-545 nm), poniewaŜ zminimalizuje to
ryzyko pominięcia zdarzeń skojarzonych z kulkami CytoCount™ podczas akwizycji. NaleŜy
uwaŜać, by nie wykluczyć Ŝadnych zdarzeń CD34+ w wyniku ustawienia zbyt wysokiego
progu FL1. Zob. sekcja Rozwiązywanie problemów.
Testy nie wykazały przenoszenia materiału między róŜnymi próbkami. Zaleca się jednak
przeprowadzenie walidacji cytometru przepływowego pod kątem efektu przenoszenia
materiału między próbkami. Aby uniknąć przenoszenia materiału z próbki o wysokim
stęŜeniu komórek CD34+ do próbki o niŜszym stęŜeniu, moŜna między próbkami przepuścić
przez cytometr przepływowy bufor fosforanowy.
Jeśli uŜywany jest barwnik 7-AAD znakujący komórki martwe, kluczowe znaczenie ma
wybranie optymalnych ustawień kompensacji, poniewaŜ sygnał z kanału RPE nakłada się na
sygnał z kanału 7-AAD. W najbardziej niekorzystnym przypadku zdarzenia CD34+ będą
eliminowane, jeśli wpadną w ograniczenie wykluczające komórki martwe w kanale 7-AAD /
rozpraszanie boczne (SSC).
Barwnik 7-AAD wzbudza się przy długości fali 488 nm i ma maksimum emisji przy 660 nm
(FL3 lub FL4, zaleŜnie od typu cytometru). Z tego względu barwnika nie moŜna uŜywać w
systemach z jednym laserem z innymi fluorochromami emitującymi fale o długości >600 nm,
takimi jak PerCP lub RPE-Cy5.
Zgłaszano przypadki agregacji kulek kontrolnych (4). Kulki CytoCount™ charakteryzują się
szczególnie małym odsetkiem zlepień (poniŜej 3%), co ułatwia definiowanie ograniczeń.
W razie zaobserwowania większej liczby zlepionych kulek CytoCount™ i powstania
wątpliwości co do jakości produktu, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Przechowywanie
Zestaw naleŜy przechowywać w ciemnym miejscu, w temperaturze 2–8 °C. Nie naleŜy uŜywać
odczynników po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu zestawu. JeŜeli odczynniki są
przechowywane w warunkach innych niŜ podane w ulotce dołączonej do opakowania, UŜytkownik
powinien je zweryfikować.
EasyLyse™, odczynnik w fiolce 2, jest stabilny przez 6 miesięcy od otwarcia fiolki. Po
rozcieńczeniu odczynnik do lizy jest stabilny przez 20 dni w temperaturze 2–24 °C.
Wszystkie odczynniki naleŜy przechowywać w pozycji pionowej.
Pobieranie i przygotowanie próbek
Krew obwodową naleŜy pobrać aseptycznie, poprzez wkłucie doŜylne, do sterylnej probówki do
pobierania krwi K3EDTA. Do kaŜdego testu potrzebne jest 200 µL krwi (100 µL na probówkę).
Podczas pobierania próbki naleŜy postępować wg instrukcji producenta probówki. Próbki z
leukaferezy naleŜy pobierać zgodnie z instrukcjami producenta przyrządu do leukaferezy.
Krew ze środkiem zapobiegającym koagulacji naleŜy przechowywać w temperaturze pokojowej
(20 do 25 °C) do czasu wykonania barwienia.
Próbki krwi obwodowej naleŜy wybarwić przed upływem 24 godzin od pobrania. W przypadku
próbek z leukaferezy zaleca się przeprowadzenie barwienia równolegle z obróbką produktu
leukaferezy.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 6/14
We wszystkich próbkach, które mają być testowane, naleŜy zbadać liczbę leukocytów. Jeśli liczba
7
leukocytów jest wyŜsza niŜ 10 /mL, naleŜy rozcieńczyć próbkę buforem fosforanowym do około
7
10 leukocytów/mL. Zapisać współczynnik rozcieńczenia, gdyŜ potrzebny będzie do obliczenia
ostatecznej bezwzględnej liczby komórek CD34+ w oryginalnej próbce.
Nie uŜywać komórek wstępnie utrwalonych.
Procedura barwienia
Barwienie komórek i dodawanie kulek kontrolnych
Rozcieńczyć oryginalną próbkę buforem fosforanowym do około 107 leukocytów na mL.
Zanotować dokładny współczynnik rozcieńczenia. W większości przypadków rozcieńczenie
będzie konieczne tylko dla próbek z leukaferezy.
2.
Na kaŜdej próbce naleŜy wykonać test podwójny. Dlatego dla kaŜdej próbki naleŜy oznaczyć
dwie probówki.
3.
Za pomocą pipety przenieść po 100 µL próbki do kaŜdej probówki. Zastosować technikę
pipetowania odwrotnego (zob. punkt Wskazówka, pipetowanie odwrotne z „mokrą
końcówką”).
4.
Dodać 10 µL odczynnika z fiolki 1 (przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD45/FITC +
przeciwciała przeciwko ludzkiemu CD34/RPE) do kaŜdej probówki i wymieszać w
mieszalniku wirowym. Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze 2–8 °C lub przez
15–30 minut w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
5.
Dodać 2 mL rozcieńczonego odczynnika do lizy (fiolka 2, EasyLyse™ rozcieńczony 20 x).
Natychmiast po dodaniu środka do lizy wymieszać próbkę w mieszadle wirowym.
6.
Inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7.
Jeśli poŜądane jest określenie Ŝywotności komórek, dodać do kaŜdej próbki 10 µL barwnika
z fiolki 3 (7-AAD) i wymieszać. W przeciwnym razie przejść do kroku 8. Przed akwizycją
inkubować z barwnikiem 7-AAD przez co najmniej 5 minut.
8.
Odtworzyć zawiesinę w fiolce 4 (CytoCount™) za pomocą mieszadła rotacyjnego, zgodnie
z opisem w sekcji Przygotowanie odczynników. Dodać 100 µL do próbki wybarwionej i
poddanej lizie. Do pipetowania próbki i kulek CytoCount™ naleŜy uŜywać tej samej
skalibrowanej pipety i stosować technikę pipetowania odwrotnego z „mokrą końcówką” (4)
(zob. punkt Wskazówka, pipetowanie odwrotne z „mokrą końcówką”).
9.
Przed akwizycją przez 3 sekundy delikatnie mieszać kulki z próbką za pomocą mieszadła
wirowego, aby uzyskać równomierny rozkład kulek CytoCount™ w próbce.
10. Akwizycja próbki musi odbyć się przed upływem 45 minut od dodania odczynnika do lizy
(krok 5).
11. Przeprowadzić akwizycję zdarzeń skojarzonych z co najmniej 60 000 leukocytów, 1000 kulek
CytoCount™ i co najmniej 100 komórkami CD34+ (4). Zob. Konfiguracja akwizycji dla
zestawu CD34Count Kit.
Wskazówka, pipetowanie odwrotne z „mokrą końcówką”
1.
Do dozowania próbki i kulek naleŜy uŜywać tej samej pipety. Do kaŜdego odczynnika uŜywać
czystej końcówki pipety. Zastosowanie tej samej techniki do dozowania próbek i kulek zapewni
lepszą powtarzalność wyników.
Próbka
1. Nacisnąć tłoczek do drugiego oporu, zanurzyć końcówkę w płynie i zassać próbkę. Następnie
nacisnąć tłoczek do pierwszego oporu, aby wstrzyknąć próbkę. Końcówka pipety powinna teraz
zawierać nadmiar płynu.
2. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, trzymając końcówkę pipety zanurzoną w próbce.
3. Końcówka pipety jest teraz gotowa do uŜycia. Nacisnąć tłoczek do drugiego oporu, zanurzyć
końcówkę w płynie i zassać próbkę. OstroŜnie wyjąć końcówkę pipety z próbki i delikatnie
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 7/14
wytrzeć końcówkę pipety bibułką, aby usunąć nadmiar płynu, uwaŜając przy tym, by nie dotknąć
otworu końcówki i przypadkiem nie usunąć próbki z wnętrza końcówki.
4. W miarę moŜliwości utrzymywać pipetę pionowo. Sprawdzić, czy w końcówce nie ma
pęcherzyków powietrza. W razie stwierdzenia pęcherzyków wstrzyknąć płyn z powrotem do
probówki z próbką i powtórzyć procedurę.
5. Nacisnąć tłoczek do pierwszego oporu, wstrzykując dawkę próbki; po wstrzyknięciu w
końcówce pipety powinna być widoczna pozostałość płynu. Nie dotykać ścianek probówki
podczas wyjmowania końcówki.
Kulki
6. Przygotować pipetę z zawiesiną kulek CytoCount™ z probówki 4, postępując tak samo, jak z
próbką (kroki 1–3).
7. W celu wstrzyknięcia zawiesiny kulek umieścić końcówkę pipety przy ścianie probówki w
pobliŜu powierzchni próbki; lekkie nachylenie probówki i pipety ułatwi wykonanie tej czynności.
Nacisnąć tłoczek do pierwszego oporu, wstrzykując dawkę zawiesiny; po wstrzyknięciu w
końcówce pipety powinna być widoczna pozostałość płynu.
8. W celu pipetowania większej ilości zawiesiny kulek umieścić końcówkę w fiolce CytoCount™ i
zassać więcej zawiesiny, nie wstrzykując resztki płynu pozostałej w końcówce po pierwszym
pipetowaniu.
9. Jeśli końcówka nie zetknęła się jeszcze z próbką, naleŜy wstrzyknąć płyn pozostały w końcówce
do fiolki CytoCount™. Jeśli pozostały płyn będzie wylewany do kanalizacji, odczynnika moŜe nie
wystarczyć na 50 testów.
Kontrola jakości
Próbka kontrolna
Zaleca się uwzględnienie w teście dodatniej próbki kontrolnej, co pozwoli na zweryfikowanie
poprawności konfiguracji wyliczania komórek CD34+.
Zdecydowanie zalecane jest przystąpienie do zewnętrznego programu oceny jakości.
Kontrola jakości na podstawie czasu
W badaniach jednoplatformowych w charakterze wewnętrznego wskaźnika jakości moŜna
wykorzystać czas akwizycji. Badania wykazały, Ŝe w większości cytometrów przepływowych liczba
kulek zarejestrowanych w określonym czasie pozostaje zasadniczo stała. Dlatego dla kaŜdej
nowej partii kulek uŜytkownik moŜe ustalić przedział liczby kulek o szerokości ± 2 odchylenia
standardowe względem średniej liczby rejestrowanej w zadanym czasie. KaŜda próbka, w której
liczba zarejestrowanych kulek nie mieści się w tym przedziale, moŜe być skutkiem błędu
pipetowania i wymagać ponownego wybarwienia (6).
Testy podwójne
NaleŜy wykonać podwójny test kaŜdej próbki. RóŜnica wartości uzyskanych z obu egzemplarzy
próbki nie powinna przekraczać 15%. Jeśli róŜnica jest większa, test na próbce naleŜy powtórzyć.
RóŜnicę między wartościami z dwóch egzemplarzy (X i Y) oblicza się wg poniŜszego wzoru:
|X-Y||
(X+Y)/2
x 100%
Akwizycja danych
NaleŜy skonfigurować cytometr do akwizycji trójbarwnej zgodnie z instrukcjami jego producenta.
Konfiguracja powinna obejmować ustawianie lub kontrolę napięcia lampy fotopowielacza (PMT)
oraz czułości przyrządu, a takŜe kompensację, jeśli uŜywana będzie kompensacja sprzętowa.
Konfigurację akwizycji w cytometrach przepływowych FACSCalibur (Beckton Dickinson) i Coulter
XL (Beckman Coulter) przedstawili Sutherland et al. (1) oraz Gratama et al. (2).
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 8/14
Konfiguracja akwizycji dla zestawu CD34Count Kit
Akwizycja danych moŜe odbywać się z zastosowaniem kompensacji sprzętowej lub bez
kompensacji — w tym drugim przypadku niezbędna jest kompensacja podczas analizy danych.
Informacje na temat ustawień kompensacji moŜna znaleźć w ogólnych wskazówkach dotyczących
cytometrii przepływowej.
PoniŜszy protokół przeznaczony jest zarówno do akwizycji, jak i do analizy.
1. Wygenerować następujące dwuwymiarowe prezentacje danych (wykresy punktowe) i ustawić
regiony zgodnie z ilustracjami:
Wykres A: CD45 FITC — SSC-H (region 1 i region 5)
Wykres B: CD34 RPE — SSC-H (region 2)
Wykres C: CD45 FITC — SSC-H (region 3)
Wykres D: FSC-H — SSC-H (region 4)
Wykres E: 7-AAD — SSC-H (region 8)
Wykres F: CD45 FITC — CD34 RPE (region 6 i region 9)
Wykres G: Czas — FSC-H z ograniczeniem do zdarzeń CytoCount™ (region 7)
Wykres H: FSC-H — SSC-H
2. Utworzyć następujące warunki ograniczeń (bramki; kolor jest opcjonalny):
Ograniczenie G7 nosi nazwę „Stem Cells” (Komórki macierzyste) i dodawane jest do kreatora
ograniczeń w celu wyróŜnienia kolorem zdarzeń dodatnich CD34+. Ograniczenie wyróŜniające
zdarzenia kolorem jest bardzo przydatne podczas konfiguracji akwizycji oraz analizy.
3. Zastosować ograniczenia do wykresów w następujący sposób:
Wykres A: G1
Wykres B: G2
Wykres C: G3
Wykres D: G4
Wykres E: Bez ograniczenia
Wykres F: Bez ograniczenia
Wykres G: G6
Wykres H: Bez ograniczenia
4. Ustawić wartość progową na FL-1 w taki sposób, by wykluczane były wszystkie zdarzenia
CD45-ujemne. Zaleca się ustawienie progu wartości FL-1, poniewaŜ zminimalizuje to ryzyko
wykluczenia kulek CytoCount™. Ustawienie progu parametru FSC równieŜ moŜe być celowe,
naleŜy jednak uwaŜać, by nie wykluczyć Ŝadnych zdarzeń skojarzonych z kulkami. Zob. sekcja
Rozwiązywanie problemów.
5. Załadować pierwszą próbkę i wyregulować wzmocnienie fotopowielacza dla parametrów FSC i
SSC w taki sposób, by wszystkie populacje na Wykresie H mieściły się na skali. Jeśli ustawiono
próg parametru FSC, naleŜy upewnić się, Ŝe zdarzenia CytoCount™ wypadają nad progiem.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 9/14
6. Wyregulować fotopowielacz dla CD45/FITC. Populacja limfocytów powinna mieścić się w
trzeciej dekadzie (Wykres A). Upewnić się, Ŝe nie są wykluczane Ŝadne komórki CD45+ o
słabej fluorescencji. W razie wątpliwości naleŜy albo obniŜyć próg FL1, albo zwiększyć
wzmocnienie fotopowielacza dla parametru FL1. Po zmianie ustawień fotopowielacza konieczne
moŜe być skorygowanie ustawień kompensacji.
Wykres A
Wykres B
Wykres C
7. Wyregulować fotopowielacz dla CD34/RPE. Większość zdarzeń ujemnych powinna przypadać
między pierwszą a drugą dekadą (Wykres B).
8. Wyregulować fotopowielacz dla 7-AAD. Większość zdarzeń ujemnych powinna mieścić się w
pierwszej dekadzie (Wykres E).
9. Zastosować region 6 z Wykresu F na Wykresie G. Jeśli ustawiono próg parametru FSC, naleŜy
na wykresie G sprawdzić, czy ustawienie to nie spowodowało wykluczenia zdarzeń CytoCount™
(zob. sekcja Rozwiązywanie problemów).
Wykres D
Wykres E
Wykres F
10. Zaleca się zastosowanie ograniczenia wykluczającego na Wykresie H. Ograniczenie to
powinno obejmować zdarzenia skojarzone z niskimi wartościami SSC i FSC (Region 9).
W trakcie akwizycji zdarzenia wykluczane przez to ograniczenie powinny być odrzucane.
Uzyskuje się to poprzez zastosowanie filtru ograniczającego (ograniczenia wykluczającego) do
tych zdarzeń lub odrzucanie zdarzeń z regionu R9 w oknie akwizycji. Jeśli w charakterze progu
uŜywana jest wartość FSC, ograniczenie wykluczające nie jest istotne.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 10/14
11. Upewnić się, Ŝe podczas akwizycji jako jeden z parametrów rejestrowany jest czas.
Wykres G
Wykres H
Cytometr jest teraz gotowy do rozpoczęcia akwizycji.
12. Przeprowadzić akwizycję co najmniej 60 000 zdarzeń związanych z leukocytami, 1000 zdarzeń
CytoCount™ oraz 100 zdarzeń CD34+. Kryterium zatrzymania moŜna skojarzyć tylko z jedną z
tych liczb. W przypadku próbek o niskim stęŜeniu CD34+ kryterium zatrzymania będzie liczba
100 zdarzeń CD34+, natomiast w przypadku próbek o wysokim stęŜeniu CD34+ kryterium
zatrzymania będzie liczba 60 000 leukocytów. Wskazane jest zarejestrowanie moŜliwe duŜej
liczby zdarzeń, gdyŜ pozwoli to z większą dokładnością określić liczbę komórek CD34+.
Analiza danych
Podczas analizy naleŜy postępować wg tego samego protokołu, co podczas akwizycji.
1. Do danych uzyskanych bez kompensacji sprzętowej zastosować kompensację zgodnie
z instrukcjami wyświetlanymi przez oprogramowanie. Szczególnie istotna jest kompensacja
zachodzenia kanału RPE na kanał barwnika 7-AAD (zob. Środki ostroŜności).
2. Dla regionu 4 (komórki) naleŜy wyświetlić statystykę przedstawiającą komórki progenitorowe
CD34+, a dla regionu 7 (kulki) — liczbę kulek. Jeśli potrzebna jest liczba zarejestrowanych
Ŝywych komórek CD45-dodatnich, to naleŜy wyświetlić równieŜ statystykę dla regionu 1 (G2).
3. Zaimportować plik danych z akwizycji (plik FCS) i rozmieścić regiony.
4. Na Wykresie D zastosować ograniczenie G5 i umieścić region 4 w taki sposób, by obejmował
tylko najmniejsze limfocyty (rysunek 1(a)).
5. Teraz zastosować ograniczenie G4 na Wykresie D, nie zmieniając połoŜenia regionu 4
(rysunek 1(b)).
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 11/14
a
b
Rysunek 1. (a): Region 4 jest umieszczony w taki sposób, by obejmował zdarzenia większe od
najmniejszych limfocytów oraz zdarzenia o niskiej wartości SSC. (b): Po ustawieniu regionu 4 na
Ŝywych limfocytach do wykresu zastosowano ograniczenie G4, aby uwidocznić zdarzenia
spełniające wymogi określone w wytycznych ISHAGE.
Wyniki
Obliczenie bezwzględnej liczby komórek CD34+ na µ L oryginalnej próbki:
Bezwzględną liczbę komórek CD34+ naleŜy obliczyć z poniŜszego wzoru:
Komórki CD34+ /µL =
Zliczona liczba komórek CD34+ (R4) x StęŜenie CytoCount™*
x Współczynnik rozcieńcz.
Zliczona liczba kulek (R7)
*Ta wartość (C) podana jest na etykiecie fiolki 4: C= Liczba kulek/µL.
W przedstawionym przykładzie (Wykresy od A do H) bezwzględna liczba komórek CD34+
obliczona zostanie z następującego wzoru:
216 x 1006
x 1 = 66 komórek CD34+ /µL
3276
Ostateczny wynik będzie średnią z dwóch testów. Firma Dako zaleca, by test uznawać za waŜny,
jeśli róŜnica między tymi dwoma wartościami nie przekracza 15%, w przeciwnym razie próbkę
naleŜy przeanalizować ponownie (zob. sekcja Kontrola jakości).
Przypisanie wartości
StęŜenie kulek (C) i odpowiednie odchylenie standardowe (S) jest podane na etykiecie fiolki 4 jako
liczba/µL. Liczba ta ustalana jest za pomocą przyrządu Coulter Particle Counter Z1. Odchylenie
standardowe stęŜenia kulek ma niewielki wpływ na łączną niepewność wyniku analizy.
Ograniczenia metody
1. Ze względu na zmienność próbek biologicznych wyniki analizy niektórych próbek mogą być
nieprawidłowe. Wszystkie wykresy punktowe powinna krytycznie ocenić osoba z
doświadczeniem w stosowaniu cytometrii przepływowej. Skutkiem nieprawidłowego, zbyt
wysokiego wyniku moŜe być sporządzenie wlewu zawierającego mniej komórek CD34+ niŜ
wynosi zalecana ilość graniczna.
2. Wyniki uzyskane przy uŜyciu zestawu CD34Count Kit powinny być interpretowane w kontekście
innych informacji klinicznych oraz wyników dodatkowych procedur diagnostycznych.
3. Próbki krwi naleŜy przechowywać w temperaturze pokojowej (20 do 25 °C).
4. Nie uŜywać utrwalonych i przechowywanych próbek pochodzących od pacjentów.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 12/14
5. Liczba leukocytów w próbce nie powinna przekraczać 107/mL, a liczba komórek CD34 nie
powinna być wyŜsza niŜ 2000 komórek/µL.
Rozwiązywanie problemów
Problem
Rozwiązanie
Niektóre kulki nie są rejestrowane, poniewaŜ
ustawiono za wysoką wartość progową FSC-H.
Ponownie przeanalizować próbkę przy
niŜszym progu FSC-H. Zaleca się jednak
ustawienie progu parametru FL1.
Źle: Na wykresie FSC-H nie są rejestrowane Ŝadne
zdarzenia wypadające poniŜej głównej populacji
kulek. Niektóre kulki CytoCount™ zostały
wykluczone podczas akwizycji.
Dobrze: Widoczne są kulki mniejsze niŜ
główna populacja. Kulki CytoCount™ nie
są wykluczane.
Część populacji CD34+ została wykluczona,
poniewaŜ ustawiono za wysoki próg FL1.
Ponownie przeanalizować próbkę przy
niŜszym progu FL1.
Próbka kontroli jakości poza zakresem.
Sprawdzić konfigurację cytometru i
akwizycji, następnie ponownie
przeanalizować próbkę kontroli jakości.
Jeśli próbka kontroli jakości nadal nie
mieści się w zakresie, skontaktować się ze
specjalistą odpowiedzialnym za obsługę
techniczną cytometru.
Definiowanie regionów jest utrudnione.
Powiększyć wykresy punktowe i
przemieścić region.
Urządzenie pomiarowe
Zestaw CD34Count Kit jest przeznaczony do stosowania w cytometrach przepływowych. Cytometr
przepływowy musi być wyposaŜony w sprzęt komputerowy i oprogramowanie oraz w laser 488 nm.
Cytometr przepływowy musi umoŜliwiać detekcję fluorescencji o następujących długościach fal:
515–545 nm (FL1), 562–607 nm (FL2) i >650 nm (FL3 lub FL4, w zaleŜności od urządzenia). Musi
takŜe istnieć moŜliwość detekcji rozpraszania w przód i rozpraszania bocznego. Urządzenie musi
umoŜliwiać określenie wartości progowej parametru FL1 albo rozpraszania bocznego.
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 13/14
NaleŜy zastosować ustawienia kontroli jakości zalecane przez producenta urządzenia.
Konfiguracja powinna obejmować ustawienie lub sprawdzenie napięć fotopowielacza, kompensacji
fluorescencji i czułości urządzenia.
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Sutherland DR, Keeney M, Gratama JW. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and
progenitor cells. Current Protocols in Cytometry. New York: John Wiley & Sons; 2003. p.
6.4.1-23.
Gratama JW, Keeney M, Sutherland DR. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and
progenitor cells. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; 1999. p.
6.4.1-22.
Keeney M, Gratama JW, Sutherland DR. Critical role of flow cytometry in evaluating
peripheral blood hematopoietic stem cell grafts. Cytometry 2004;58A:72-5.
Brando B, Barnett D, Janossy G, Mandy F, Autran B, Rothe G, et al. Cytofluorometric
methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood (review). Cytometry
2000;42:327-46.
Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I. The ISHAGE guidelines for
CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother 1996;5:213-26.
Bergeron M, Lustyik G, Phaneuf S, Ding T, Nicholson JKA, Janossy G, et al. Stability of
currently used cytometers facilitates the identification of pipetting errors and their volumetric
operation: “time” can tell all. Cytometry 2003;52B:37-40.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
Numer serii
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Chronić przed słońcem (patrz
sekcja nt. przechowywania)
ZuŜyć przed
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Producent:
Dako Denmark A/S
Produktionsvej 42
DK-2600 Glostrup
Denmark/ Danemark/ Dänemark
Tel.+45 44 85 95 00
Faks +45 44 85 95 95
www.dako.com
(111448-003)
K2370/PL/JLA/2010.10.15 s 14/14