Ekspresja genów heterogenicznych w drożdżach Pichia pastoris

Ekspresja genów heterogenicznych
w drożdżach Pichia pastoris
Ekspresja genów heterogenicznych w
drożdżach Pichia pastoris
 Drożdże
Pichia pastoris
należą do drożdży
metanolotroficznych tj.
zdolnych do
wykorzystywania
metanolu jako jedynego
źródła węgla
Ekspresja genów heterogenicznych w
drożdżach Pichia pastoris


Pierwszą reakcją na drodze asymilacji metanolu przez drożdże
Pichia pastoris jest reakcja utleniania metanolu do formaldehydu i
H2O2 katalizowana przez enzymy oksydazę alkoholową 1
(AOX1) i oksydazę alkoholową 2 (AOX2)
CH3 OH
HCOH + H2O2
AOX1 (szybka utylizacja metanolu)
AOX2 (wolna utylizacja metanolu)

Białko AOX1 może stanowić aż do 30% wszystkich białek
komórkowych Pichia pastoris podczas wzrostu tych drożdży na
pożywce zawierającej metanol.
Pichia pastoris
Ze względu na podobieństwo do S. cerevisiae istnieje możliwość
zastosowania opracowanych protokołów
 W przeciwieństwie do większości komercyjnych systemów
ekspresji genów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, systemy
ekspresji genów w Pichia pastoris opierają się na integracji
DNA wektora plazmidowego z DNA genomowym tych
drożdży, uzyskane szczepy rekombinantowe Pichia pastoris są
znacznie bardziej stabilne niż szczepy rekombinantowe
Saccharomyces cerevisiae
 Obecność promotora genu alkoholowej oksydazy – 5% mRNA
w komórce

Pichia pastoris – ekspresja genów

W konstrukcji systemów ekspresyjnych Pichia pastoris można
wykorzystać „elementy konstrukcyjne” wykorzystywane w
konstrukcji wektorów ekspresyjnych z Saccharomyces cerevisiae
np. gen URA3 wykorzystywany jako marker selekcyjny w
auksotroficznych szczepach drożdży Saccharomyces cerevisiae
niezdolnych do produkcji uracylu może być użyty w tej samej
roli w układach ekspresyjnych dla analogicznych szczepów
drożdży Pichia pastoris
Pichia pastoris – ekspresja genów
Gen/marker selekcyjny
wektora plazmidowego z
Saccharomyces cerevisiae
Szczep auksotrofowy
Pichia pastoris
HIS4
His-
LEU2
Leu-
ARG4
Arg-
TRP1
Trp-
URA3
Ura-
Pichia pastoris
Możliwość prowadzenia hodowli do wysokiego OD
(10 gr/litr – 1 gr/litr)
 Poziom ekspresji genów heterogenicznych jest z
reguły od 10- do 100- razy wyższy niż w drożdżach
Saccharomyces cerevisiae
 Tanie pożywki



zabezpieczone przed kontaminacją (obecność metanolu,
niskie pH)
Brak konieczności dodawania witamin
Pichia pastoris

Możliwość sekrecji produkowanych białek do pożywki



Niewielka ilość białek gospodarza
Prosty skład pożywek
Modyfikacje posttranslacyjne




Mostki disiarczkowe
O- glikozylacja (b. rzadko w S. cerevisiae)
N-glikozylacja
Odcinanie sekwencji sygnalnej do transportu na zewnątrz
(pre-pro)
Pichia pastoris - wady

Tworzenie nowych szczepów P. pastoris trudniejsze niż
E. coli





10 µg DNA na transformację
Brak możliwości przechowywania komóek kompetentnych
Wolne tempo wzrostu (po transformacji 2-3 dni)
Powolna ekspresja białek (do 1 tygodnia)
Niewielka ilość „domen fuzyjnych” komercyjnie
dostępnych
Pichia pastoris - klonowanie

Wiele dostępnych wektorów, ale tylko kilka z nich ma
następujące cechy:






Ori E. coli
Kaseta selekcyjna dla E. coli
Kaseta selekcyjna dla P. pastoris
Możliwość multikopijnej integracji
Silny indukowalny promotor (AOX1)
MCS w ramce odczytu z sekwencją sygnalną
pPIC9k
pPICZα
Wektory ekspresyjne Pichia pastoris
Plazmidy wahadłowe
 Zawierają bakteryjne ori
replikacji np. ori pBR322
(pPIC3.5) lub ori pUC
(pPICZ A,B,C)

Wektory ekspresyjne Pichia pastoris
Plazmidy wahadłowe
 Zawierają geny oporności
na ampicylinę, (markery
selekcyjne w E. coli) albo gen
oporności na antybiotyk
zeocynę (uniwersalny
marker selekcyjny w E. coli i
Pichia pastoris)

Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia
pastoris

W wektorach
plazmidowych serii pHIL
i pPIC ekspresja genów
heterogenicznych
odbywa się spod silnego
promotora PAOX1 genu
AOX1 kodującego
oksydazę alkoholową
metanolu AOX1
Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL
Pichia pastoris

Ekspresja spod promotora PAOX1 jest regulowana przez obecność
glukozy, glicerolu i metanolu w pożywce
glukoza (represja) – konieczność odwirowania
hodowli (m.in. z bioreaktorów np. 200 l)
glicerol (represja, ale łatwiejsza indukcja)
metanol (indukcja)
Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL
Pichia pastoris

W wektorach
plazmidowych serii pHIL
i pPIC ekspresja genów
heterogenicznych jest
hamowana przez
terminator genu AOX1:
3’AOX1(TT)
Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL Pichia
pastoris


W wektorach plazmidowych serii
pHIL i wektorach pPIC3.5K oraz
pPIC9K rolę eukariotycznego
markera selekcyjnego pełni gen
kodujący dehydrogenazę
histydynylową HIS4
W wektorach pPICZ A(B,C)
oraz pPICZalfa A(B,C,E)
stosowany jest „uniwersalny”
marker selekcyjny: gen kodujący
oporność na antybiotyk zeocynę
Wektory ekspresyjne serii pPIC i pHIL
Pichia pastoris
Ekspresja genu
oporności na zeocynę
zachodzi w komórkach:
 E. coli spod promotora
PEM7
 Pichia pastoris spod
promotora PTEF1(ten
promotor działa we
wszystkich drożdżach)

Expression of beta-galactosidase form pPICZ
Szczepy Pichia pastoris
Z wektorami plazmidowymi serii pHIL, pPIC są
najczęściej wykorzystywane dwa szczepy Pichia
pastoris tj.:
 Pichia pastoris GS115
 Pichia pastoris KM71

Oba szczepy są mutantami auksotrofowymi Hisniezdolnymi do syntezy endogennej histydyny na
skutek mutacji w genie HIS4 kodującym
dehydrogenazę histydynylową
Szczep Pichia pastoris GS115



Szczep Pichia pastoris GS115 opisywany jest jako
mutant fenotypowy His-, Mut+
Szczepy Pichia pastoris Mut+ są to szczepy, które
posiadają taką samą zdolność do wykorzystywania
metanolu jako źródło węgla jak dzikie szczepy Pichia
pastoris (Methanol utilization plus strain)
Szczepy te posiadają dzikie kopie genów AOX1 i
AOX2 kodujących obie „wersje” oksydazy
alkoholowej Pichia pastoris
Szczep Pichia pastoris KM71

Szczep Pichia pastoris KM71 opisywany jest jako mutant
fenotypowy His-, MutS, Arg+

Szczepy Pichia pastoris MutS są to szczepy, które ze względu na
dezaktywację genu AOX1 rosną znacznie wolniej niż szczepy
dzikie na pożywce zawierającej metanol jako jedyne źródło
węgla tzw: (Methanol utilization slow strain)

Szczep KM71 powstał poprzez insercję genu AOX1, w celu
przerwania jego ciągłości, genu liazy argininobursztynianowej
ARG4 (aox1::ARG4), która nadała szczepowi wyjściowemu
KM71 o fenotypie His-, Mut+, Arg- fenotyp His-, MutS, Arg+
Integracja DNA wektora z DNA genomowym

1.
2.
3.
Niezależnie od tego czy jako szczep gospodarza dla
rekombinantowego wektora np. pPIC3.5K użyjemy szczepu
GS115 czy też KM71 integracja DNA tego plazmidu z DNA
genomowym tych szczepów Pichia pastoris może zajść na
drodze rekombinacji homologicznej w obrębie:
genu AOX1 szczepu GS115 lub genu aox1:ARG4 szczepu KM71
defektywnego genu his4
w obu powyższych przypadkach może również dojść do
wielokrotnej rekombinacji homologicznej więcej niż jednej
kopii DNA plazmidu z DNA genomowym gospodarza
Integracja DNA plazmidowego w obrębie genu
AOX1 szczepu GS115 i genu aox1: ARG4
szczepu KM71

Selekcja rekombinantów odbywa się na płytkach ze złożem nie
zawierającym histydyny
Wielokrotna rekombinacja homologiczna DNA
plazmidowego z DNA genomowym szczepów
Pichia pastoris

Rekombinacja wielokrotna może zachodzić w przypadku od 110% komórek rekombinantowych szczepów Pichia pastoris
uzyskanych po transformacji DNA plazmidu
rekombinantowego
Integracja plazmidowego DNA z
genomem Pichia pastoris poprzez
podwójny „crossing over”

W przypadku szczepu Pichia pastoris GS117 prowadzi to do
utraty przez ten szczep cechy fenotypowej Mut+ na Muts
(ułatwiona selekcja rekombinantów)
Integracja DNA wektora z DNA genomowym

UWAGA !!!
Ze względu na transformację Pichia pastoris
zlinearyzowanym DNA plazmidu rekombinantowego
dominuje integracja z DNA genomowym poprzez
podwójny „crossing over”
Ekspresja wewnątrzkomórkowa i
zewnątrzkomórkowa w komórkach Pichia
pastoris
Wektory plazmidowe używane do ekspresji genów
heterologicznych w Pichia pastoris możemy podzielić na
dwie grupy:
 Wektory kierujące eksprymowane białko do cytoplazmy
 Wektory kierujące eksprymowane białko do pożywki

Ekspresja wewnątrzkomórkowa i
zewnątrzkomórkowa w komórkach Pichia
pastoris
W celu „transportu” białek z komórek Pichia pastoris do
pożywki należy je wyposażyć w specyficzną sekwencję
sygnalną na N-końcu, w tym celu można użyć:
- sekwencję sygnalną białka obecną w „natywnej sekwencji
nukleotydowej” genu je kodującego
- sekwencję sygnalną rozpoznawaną przez Pichia pastoris np.
sekwencja -faktora z Saccharomyces cerevisiae
 Kierowanie eksprymowanego w Pichia pastoris białka do
pożywki ułatwia proces oczyszczania białka
rekombinowanego - Pichia pastoris produkuje niewiele białek
zewnątrzkomórkowo

Wektory ekspresyjne Pichia pastoris serii
pGAP


Do wektorów tej serii należą wektory plazmidowe
pGAP A, B, i C oraz pGAPα A,B i C
Wektory te różnią się od wektorów serii pHIL i serii
pPIC wykorzystaniem silnego konstytutywnego
promotora PGAP Pichia pastoris do ekspresji genów
heterogenicznych oraz integracją z DNA
genomowym Pichia pastoris w loci GAP
Wektory ekspresyjne
Pichia pastoris serii pGAP
PGAP promotor
PGAP promotor w
komórkach Pichia
pastoris jest
odpowiedzialny za
ekspresję genu
kodującego
dehydrogenazę
aldehydu-3fosfoglicerolu

Integracja DNA plazmidowego wektorów serii
pGAP z DNA genomowym Pichia pastoris
Możliwa jest także wielokrotna integracja
Szczepy Pichia pastoris

Z wektorami plazmidowymi serii pGAP najczęściej
wykorzystywane są dwa szczepy


Pichia pastoris GS115
Pichia pastoris KM71
Szczepy Pichia pastoris
Ze względu na obecność uniwersalnego markera
selekcyjnego w wektorach plazmidowych serii pGAP
(genu oporności na antybiotyk zeocynę) istnieje
możliwość jego stosowania do ekspresji w „dzikich”
szczepach Pichia pastoris tj.:
 Pichia pastoris X-33

Z pozostałych serii plazmidów tylko wektory pPICZ
A,B,C i pPICZ A,B,C,E mogą wykorzystać ten szczep
jako gospodarza
Uwagi

Produkcję białek rekombinowanych w Pichia pastoris
powinno prowadzić się w odpowiednich
bioreaktorach (pełne wykorzystanie „potencjału
ekspresyjnego P. pastoris)

Glikozylacja białek posiadających w swej sekwencji
motyw Asn-X-Ser/Thr, może prowadzić do utraty
aktywności enzymatycznej lub właściwości
strukturalnej (epitopy antygenowe) eksprymowanego
białka heterogenicznego w Pichia pastoris
Pichia pastoris – ekspresja genów
Możliwość uzyskania dużej biomasy (100 - 200 g z litra hodowli)
P. pastoris – ekspresja w kolbach




Jedna kolonia do 50 ml pożywki minimalnej z
glicerolem (24-48 h)
Przenieść komórki do 200 ml (24-48h, OD=10)
Przenieść komórki do 1 litra pożywki z metanolem
(0,5%)
Po pierwszym dniu od indukcji dodawać 0,5%
metanolu na kolejne 1-2 dni
Hansenula polymorpha
Hansenula polymorpha
http://www.artes-biotechnology.com/expres/hansenula/hansenula01.jsp
Hansenula polymorpha






Stabilność szczepów
Multikopijnosć wektorów (do 120 na komórkę)
Możliwość koekspresji trzech różnych genów
Dosępne wektory nbez genów kodujących oporność
na antybiotyki
Promotor FMD – glicerol jest induktorem
Promotor MOX – metanol jest induktorem
Inne systemy - Artes

Arxula adeninivorans

Aspergillus sojae

Sordaria macrospora