(11) PL/EP 2535716 PL/EP 253 5716 T3

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
18.09.2008 12183760.3
(19) PL
(11) PL/EP
(13)
(51)
2535716
T3
Int.Cl.
G01N 33/574 (2006.01)
A61K 31/00 (2006.01)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
(54)
(97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
02.11.2016 Europejski Biuletyn Patentowy 2016/44
EP 2535716 B1
G01N 33/50 (2006.01)
Tytuł wynalazku:
Marker nowotworowy i cel terapeutyczny
(30)
(43)
Pierwszeństwo:
18.09.2007 GB 0718167
Zgłoszenie ogłoszono:
19.12.2012 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2012/51
(45)
O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.06.2017 Wiadomości Urzędu Patentowego 2017/06
(73)
Uprawniony z patentu:
Cancer Research Technology Limited, London, GB
PL/EP 2535716 T3
(72)
Twórca(y) wynalazku:
VIOLET SLETTENAAR, London, GB
JULIA WILSON, London, GB
YAOHE WANG, London, GB
TIZIANA SCHIOPPA, London, GB
FRANCES BALKWILL, London, GB
(74)
Pełnomocnik:
rzecz. pat. Agnieszka Marszałek
SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA
BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J.
Skr. poczt. 6
00-956 Warszawa 10
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący
udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za
sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
SGS-9814VAL
EP 2 535 716 B1
Opis
5
10
15
20
25
30
35
40
45
DZIEDZINA WYNALAZKU
[0001] Wynalazek dotyczy onkologii i sposobów in vitro diagnozy nowotworu, stratyfikacji,
stopnia zaawansowania choroby oraz określenia odpowiedzi na leczenie. Dziedzina wynalazku zatem dotyczy markerów o wartości predykcyjnej lub klinicznej w diagnozie nowotworu.
TŁO WYNALAZKU
[0002] Receptory chemokin i ich ligandy kierują ruchem komórek w normalnej homeostazie
tkankowej i w chorobie, wpływając na ruchliwość, inwazyjność i przeżycie komórek [1]. W
zapaleniu i w nowotworze, chemokiny w chorych tkankach przyczyniają się do toczenia,
wiązania i inwazji leukocytów z naczyń krwionośnych przez błonę podstawną komórek
śródbłonka i do miąższu [2].
[0003] CCR4 jest jednym z 18 znanych receptorów chemokin. Receptory chemokin na ogół
ulegają ekspresji na komórkach immunologicznych i w mikrośrodowisku nowotworu liczne
receptory i ich ligandy są obecne w nacieku komórek immunologicznych.
[0004] W wielu nowotworach, komórki złośliwe również eksprymują pewne receptory chemokin, przy czym te receptory zazwyczaj nie występują na ich normalnych odpowiednikach.
Uważa się, że przerzutowe komórki nowotworowe uzyskują cechy leukocytów eksprymujących receptor chemokin i wykorzystują chemokiny, aby wspomagać ich migrację do i przeżycie w miejscach odległych od guza pierwotnego [3, 4, 5]. Niewłaściwa obecność na komórkach nowotworowych receptorów chemokin, które mają zazwyczaj wysoce ograniczony
wzór ekspresji, dalej wspiera hipotezę, że te specyficzne receptory chemokin mogą pomagać
komórkom rozprzestrzeniać się i/lub przeżywać w różnych miejscach przerzutowych [8]. W
rakach, czerniakach i złośliwych stanach hematologicznych, ekspresja receptorów chemokin,
szczególnie CXCR4 i CCR7, na komórkach złośliwych w zaawansowanej chorobie koreluje
ze zwiększonym przerzutowaniem do węzłów chłonnych, większym szerzeniem się choroby,
krótszym czasem przeżycia bez choroby i/lub przeżycia całkowitego [6, 7, 8]. CXCR5 normalnie ogranicza się do komórek B
[0005] i niektórych podtypów komórek T, lecz jest również eksprymowany przez komórki
raka trzustki, w których bierze udział w tworzeniu przerzutów do wątroby; a wątroba jest
przy tym miejscem wytwarzania liganda CXCR5, CXCL13 [9]. Komórki czerniaka, które
wytworzyły przerzuty do jelita eksprymują CCR9 [10]. W homeostazie, ligand CCR9,
CCL25, rekrutuje rzadkie podzbiory komórek T do jelita. W raku trzustki zaobserwowano
ekspresję CCR6 [38] [39]. Doniesiono również o ekspresji CCR6 w ludzkim raku nerki, razem z CCR3 i CXCR2 [40].
[0006] Wykazuje to, że wiadomo, że ekspresja kilku receptorów chemokin jest zwiększona
w nowotworowych komórkach nabłonkowych w późnym etapie powstawania raka, w tym
CXCR4, i uważa się, że odgrywają one rolę w inwazji i przerzutowaniu. Z kolei, odnośnie
CCR4, wcześniej doniesiono jedynie, że jego ekspresja jest zwiększona w niektórych nowotworach krwi, szczególnie w chłoniakach z komórek T.
[0007] Jak opisano powyżej, CXCR4 powszechnie występuje na komórkach złośliwych w
wielu zaawansowanych ludzkich nowotworach. Dodatkowo, Woerner i in. stwierdzili, że
CXCR4 był również obecny we wczesnych etapach choroby w glejaku [20]. Jednak, stosując
fosfo-specyficzne przeciwciało anty-CXCR4, stwierdzili oni, że w mniej złośliwych zmianach 1 stopnia, poziom aktywacji receptora był znacznie niższy.
[0008] Chociaż ogólnie doniesiono, że ekspresja receptora chemokin komórki złośliwej jest
związana z zaawansowaną chorobą, istnieje również kilka innych doniesień w dziedzinie o
ekspresji receptora chemokin na komórkach złośliwych we wczesnych i przedinwazyjnych
stadiach nowotworu, lecz wszystkie dotyczą CXCR4. W dużym badaniu testu macierzowego
2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tkanki (ponad 2000 próbek) raka sutka, cytoplazmatyczną/błonową ekspresję CXCR4 odnotowano w 67% raków przewodowych in situ, DCIS [21]. Zostało to potwierdzone w badaniu
Schmid i in., którzy pokazali, że zarówno CXCR4 i jego ligand CXCL12 ulegały ekspresji w
DCIS [22]. Twórcy wynalazku stwierdzili również CXCR4 na komórkach nabłonkowych
nieinwazyjnych guzów nowotworowych jajnika o granicznej złośliwości (Kulbe i in., manuskrypt w przygotowaniu) i to również zgłaszali Pils i in. [23].
[0009] Nie są dostępne dane dotyczące ekspresji innych receptorów chemokin na komórkach
nabłonkowych we wczesnych nowotworach, lecz istnieją dowody, że szlaki onkogenezy
mogą indukować ekspresję receptora chemokin na komórkach nabłonkowych. Onkogen
RET/PTC1 jest konieczny i wystarczający do transformacji złośliwej pierwotnych tyreocytów [24]. Onkogen ten indukuje program prozapalny w tyreocytach, który obejmuje indukowanie funkcjonalnego CXCR4. Pęcherzykowy mięśniakomięsak prążkowany jest wysoce
agresywnym nowotworem cechującym się powtarzającą się fuzją genu PAX3 i PAX7FKHR. Transfer PAX3-FKHR do zarodkowych komórek mięśniakomięsaka prążkowanego
również aktywuje ekspresję CXCR4 [Libura, 2002 #9346].
[0010] We wszystkich tych badaniach wnioskiem jest, że nabycie pewnych receptorów chemokin przez komórki złośliwe wydaje się być względnie późnym zdarzeniem w postępie
zezłośliwienia i w przypadku CCR4, nie doniesiono o ekspresji na jakimkolwiek etapie rozwoju guza litego.
[0011] Ekspresja CCR4 na ogół ogranicza się do układu immunologicznego i jest znana jako
marker komórek Th2 i T regulatorowych. W środowisku nowotworu, komórki te działając
hamują dojrzewanie cytotoksycznych komórek T i komórek dendrytycznych, hamując w ten
sposób przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne. Dodatkowo, wykazano, że
CCR4 ulega ekspresji w hematologicznych stanach złośliwych, w tym przez wysoki udział
chłoniaków z komórek T dorosłych (ATL) i był znaczącym czynnikiem prognostycznym
związanym z przerzutowaniem do skóry [35], [41]. Jako taki, CCR4 jest przedmiotem zainteresowania jako cel terapeutyczny w ATL [37], [42]. Ekspresja CCR4 przez białaczkę z
komórek T dorosłych jest związana z przerzutami do skóry; jego ligandy CCL17 i CCL22 są
wytwarzane przez komórki złośliwe i mikrośrodowisko nowotworu skóry [36]. Ishida i in.
opracowali terapeutyczne przeciwciało monoklonalne anty-CCR4 do leczenia chłoniaka z
komórek T dorosłych, które indukuje aktywność ADCC przeciwko komórkom nowotworowym i może również działać na immunosupresyjne złośliwe komórki Treg występujące w tej
chorobie [37].
[0012] Jedynym doniesieniem w literaturze akademickiej dotyczącym CCR4-dodatniej linii
komórkowej guza litego jest linia komórkowa SBC-5 ludzkiego raka płuca [34]. Komórki te
migrują w kierunku gradientów CCL22 i w przerzutach nowotworowych do kości heteroprzeszczepów SBC-5, występowała bliska lokalizacja osteoklastów eksprymujących CCL22
wspólnie z komórkami SBC-5 eksprymującymi CCR4. Nie ma doniesień dotyczących ekspresji CCR4 w komórkach ludzkich guzów pierwotnych.
[0013] W WO05106471 (BAYER HEALTHCARE AG) ujawniono sposoby badania przesiewowego środków o potencjalnym zastosowaniu w leczeniu szerokiego zakresu chorób,
szczególnie obejmującego zaburzenia sercowo-naczyniowe, choroby przewodu pokarmowego i wątroby, choroby zapalne, choroby metaboliczne, zaburzenia hematologiczne, zaburzenia nowotworowe, zaburzenia neurologiczne, choroby dróg oddechowych i zaburzenia rozmnażania u ssaka. Sposób badania przesiewowego określa stopień wiązania środków kandydatów z CCR4 lub ich inne cechy. Istnieje również opis badania przesiewowego szerokiego
zakresu ludzkich komórek i tkanek pod względem ich poziomu ekspresji CCR4 w stosunku
do ekspresji genu konstytutywnego. Komórki i tkanki uzyskano z różnych źródeł i zaledwie
kilka wyodrębnionych było nowotworowymi komórkami/tkankami; np. komórki raka tarczycy, jelita krętego, HeLa, Jurkat, raka płuca i sutka. Wyniki dla względnej ekspresji CCR4
nie pokazują odróżnialnego wzoru związanego z którąkolwiek szczególną chorobą. Rzeczywiście, pośród badanych komórek nowotworowych, np. tarczycy i jelita krętego, występo-
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
wały niskie poziomy względnej ekspresji CCR4 i inne komórki nienowotworowe wykazywały wyższe poziomy względnej ekspresji CCR4.
[0014] W WO9623068 (GLAXO GROUP LIMITED) ujawniono receptor chemokin zdolny
do wiązania się z białkiem chemotaktycznym monocytów 1 (MCP-1/CCL2), białkiem zapalnym makrofagów 1α (MIP1α/CCL3) i/lub 'RANTES' (regulowany po aktywacji, eksprymowany w normalnych komórkach T i wydzielany/CCL5). Ujawniono nukleotyd i sekwencję aminokwasową dla CCR4 (CC-CKR-4/K5.5. K5.5 i CC-CKR-4 są alternatywnymi nazwami dla CCR4). Odkryto ekspresję CCR4 we względnie ograniczonym zakresie w normalnych tkankach ludzkich i w zakresie próbek komórek T. Istnieje również ogólne ujawnienie testów przesiewowych dla środków zdolnych do aktywowania limfocytów T lub blokujących wiązanie ligandów MCP-1, MIP-1α i/lub RANTES do receptora chemokin. Istnieje
pewna sugestia, że środki czynne uzyskane w badaniu przesiewowym mogą być użyteczne
na przykład w leczeniu alergii.
[0015] W WO0041724A1 (LELAND STANFORD/LEUKOSITE) zaproponowano modulację układowego ruchu komórek T pamięci przez podawanie środków modulujących CCR4.
Ma to na celu leczenie zapalnej choroby skóry. Substancje zdolne do modulowania wiązania
CCR4 do jego ligandów zastosowano w badaniach in vitro, aby pokazać jak naruszona jest
migracja komórek T.
[0016] Znane są przeciwciała reaktywne wobec CCR4. W WO0164754 (Kyowa Hakko
Kogyo) ujawniono rekombinowane przeciwciało lub jego fragment rzekomo reaktywne specyficznie z domeną zewnątrzkomórkową CCR4. Ujawniono również sekwencję polipeptydową takiego przeciwciała. Ujawniono również przeciwciało, które reaguje z komórkami
CCR4-dodatnimi i jest cytotoksyczne lub powoduje cytotoksyczność komórkową zależną od
przeciwciał (ADCC). Przeciwciała te zaproponowano do stosowania w leczeniu chorób immunologicznych, w których pośredniczą Th2, lub nowotworu krwi, szczególnie białaczki.
[0017] W WO05035582 (Kyowa Hakko Kogyo) ujawniono przeciwciało zdolne do specyficznego wiązania CCR4 i ujawniono również przeciwciało CCR4, które ma złożoną Nglikozylację w regionie Fc. Ujawniono również przeciwciała dla zewnątrzkomórkowych
domen CCR4.
[0018] W WO03018635 (Kyowa Hakko Kogyo) ujawniono „ludzkie przeciwciała i fragmenty z przeszczepionymi CDR”. Ujawniono specyficzny CDR (region determinujący
komplementarność), który wiąże się specyficznie z CCR4. Zaproponowano przeciwciała do
stosowania w diagnozowaniu i leczeniu chorób immunologicznych, w których pośredniczą
Th2, lub nowotworach, takich jak nowotwory krwi.
[0019] W WO05053741 (Kyowa Hakko Kogyo) ujawniono lek obejmujący rekombinowane
przeciwciało, które specyficznie wiąże się z CCR4, w połączeniu z co najmniej jednym innym środkiem. Zaproponowano przeciwciało do leczenia nowotworów, szczególnie nowotworów narządów hematopoetycznych.
[0020] W WO0042074 (MILLENIUM PHARMACEUTICALS) ujawniono przeciwciała
dla CCR4 i przeciwciała, które mogą współzawodniczyć z ich wiązaniem. Nie ujawniono
żadnych konkretnych zastosowań diagnostycznych. Zaproponowano terapię zaburzeń zapalnych.
[0021] Również znane w dziedzinie są różne małe cząsteczki, które wiążą się z receptorem
CCR4.
[0022] W WO04007472 (ONO PHARMACEUTICAL CO.) ujawniono drobnocząsteczkowy związek tricykliczny o aktywności anty-CCR4.
[0023] W WO05023771 (ONO PHARMACEUTICAL CO.) ujawniono drobnocząsteczkowe związki heterocykliczne zawierające azot o aktywności anty-CCR4.
[0024] W WO02094264 (TULARIK INC.) ujawniono specyficzne związki o aktywności
hamującej CCR4.
[0025] W WO0230358 (TULARIK/CHEMOCENTRYX) ujawniono różne związki wiążące
CCR-4 i zastosowania do leczenia różnych chorób, lecz nie obejmujących nowotworu.
4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[0026] W WO0230357 (CHEMOCENTRYX) ujawniono związki, które są antagonistami
CCR4. W zgłoszeniu tym opisano zastosowania do leczenia zapalnych chorób i stanów.
[0027] W WO051236976 (ASTELLAS PHARMA INC.) ujawniono pochodne chinazoliny
jako regulatory CCR4.
[0028] W WO05085212 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) ujawniono
pochodne pirymidyny jako modulatory CCR4.
[0029] W WO05082865 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) ujawniono
skondensowane bicykliczne pochodne pirymidyny jako środki kontrolujące działanie CCR4.
[0030] W WO04108717 (ASTRAZENECA AB) ujawniono związki sulfonamidowe, które
modulują aktywność receptorów chemokin (szczególnie CCR4).
[0031] W EP1633729 (ASTRAZENECA AB) ujawniono związki sulfonamidowe, które
modulują aktywność receptorów chemokin (specyficznie CCR4).
[0032] W WO03014153 (TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.) ujawniono inną technologię w dziedzinie, sposób modulowania zakażenia wirusowego komórki przez modulowanie oddziaływania między receptorami chemokin (w tym CCR4) a wirusem.
[0033] W WO2004/045526 (Morehouse School of Medicine) ujawniono przeciwciała przeciw poszczególnym chemokinom i receptorom chemokin i ich zastosowanie w hamowaniu
wzrostu i przerzutowania komórek nowotworowych. Wytworzono przeciwciała przeciwko
poszczególnym receptorom chemokin i ich ligandom, które nie obejmują CCR4. Opisano
również sposoby badania nadekspresji poszczególnych chemokin w nowotworze i sugestię,
że takie nowotwory można leczyć przez podawanie przeciwciał przeciwko szczególnej nadeksprymowanej chemokinie lub receptorowi chemokin.
[0034] W WO99/15666 (Icos Corporation) ujawniono sekwencje nukleotydowe i sekwencje
polipeptydowe chemokiny C-C pochodzącej z makrofagów, określonej jako „Chemokina
pochodząca z makrofagów” (MDC). Okazuje się, że MDC jest synonimem CCL22. Okazuje
się, że TARC jest synonimem CCL17. Opisano sposoby dla rekombinacyjnego lub syntetycznego wytwarzania białka lub fragmentów polipeptydowych MDC. Ujawniono również
przeciwciała reaktywne wobec MDC, jak również testy do identyfikowania modulatorów
aktywności chemokiny MDC i TARC.
[0035] Nakanishi i in. (Expression of macrophage-derived chemokine (MDC)/CCL22 in
human lung cancer), CANCER IMMUNOLOGY IMMUNOTHERAPY, tom 55, nr 11,
strony 1320-1329 badali rolę kilku chemokin, w tym CCL22 w postępie nowotworu w
raku płuc.
[0036] Weihrauch i in. (Elevated Serum Levels of CC Thymus and Activation-Related
Chemokine (TARC) in Primary Hodgkin's Disease: Potential for a Prognostic Factor),
CANCER RESEARCH, tom 65, nr 13, strony 5516-5519 badali istotność prognostyczną
CCL17 w surowicy pacjentów z pierwotną ziarnicą złośliwą przed i po leczeniu.
[0037] Wagsater i in. (Quantification of the chemokines CCL17 and CCL22 in human
colorectal adenocarcinoma), MOLECULAR MEDICINE REPORTS, SPANDIDOS
PUBLICATIONS, tom 1, nr 2, strony 211-217, ocenili rolę ekspresji białka CCL17 i
CCL22 w raku jelita grubego (CRC) i usiłowali ustalić, czy istnieje związek pomiędzy
polimorfizmem niektórych genów u pacjentów z CRC w porównaniu do pacjentów bez
CRC.
[0038] Rak szyjki macicy jest drugim najpowszechniejszym typem nowotworu u kobiet na
całym świecie. Objawy są często nieobecne dopóki nowotwór nie będzie w późnym stadium,
a wiec rak szyjki macicy jest przedmiotem intensywnego programu populacyjnego badania
przesiewowego z zastosowaniem wymazu Pap, w którym można wykryć zmiany przednowotworowe w badaniu histopatologicznym. Chociaż nieprawidłowy wymaz Pap wskazuje
możliwą neoplazję szyjki macicy, jest to niewystarczające dla diagnozy, którą następnie
przeprowadza się przez biopsję i dodatkowe procedury inwazyjne („kolposkopia”). Łącznie,
24000 kobiet w Wielkiej Brytanii rejestruje się z nieprawidłowymi wymazami Pap. Wymaz
Pap ma jedynie 70% czułość, zatem znaczna część kobiet z rakiem szyjki macicy lub prze-
5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
dinwazyjnymi zmianami pozostaje niezdiagnozowana. Zatem, są wymagane bardziej dokładne sposoby badań przesiewowych, aby i) pozwolić, aby badanie przesiewowe było bardziej zautomatyzowane i mniej subiektywne, ii) aby poprawić czułość badania przesiewowego.
[0039] Zakażenie HPV (wirus brodawczaka ludzkiego) stwierdzono w większości inwazyjnych raków szyjki macicy, jedną strategią jest badanie przesiewowe pod kątem obecności
markerów HPV, takich jak E6 i E7, razem z wymazem Pap. Jednak, ze względu na wysoki
poziom zakażeń HPV w populacji osób aktywnych seksualnie (do 80% zakażeń w wywiadzie), powoduje to również identyfikację dużej liczby wyników fałszywie dodatnich i czyni
dokładność testu zależną od częstości występowania HPV. W związku z tym, identyfikowanie nowych biomarkerów raka szyjki macicy pozostaje obszarem aktywnego zainteresowania. Ponadto wymagane są nowe lub alternatywne biomarkery dla innych postaci nowotworu, w tym, lecz nie wyłącznie, następujących typów raka: oskrzeli, nosogardła, krtani, drobnokomórkowego i niedrobnokomórkowego raka płuc, skóry (np. czerniak lub rak podstawnokomórkowy), mózgu, trzustki, szyi, płuca, nerki, wątroby, sutka, okrężnicy, pęcherza,
przełyku, żołądka, szyjki macicy, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego. Cecha
biomarkera jednego typu nowotworu może być wspólna z innymi typami nowotworu, zatem
zastosowanie biomarkera może wykraczać poza pierwotny typ nowotworu, z którym stwierdzono, że jest związany.
[0040] Istnieje potrzeba ulepszonych biomarkerów dla szeregu nowotworów, które pozwalają na stratyfikację pacjentów potrzebujących leczenia przeciwnowotworowego.
[0041] Stopień zaawansowania nowotworu jest deskryptorem (zazwyczaj liczby I do IV)
tego jak bardzo rak jest rozsiany. Stopień zaawansowania często bierze pod uwagę wielkość
nowotworu, jak głęboko wniknął, czy zaatakował sąsiednie narządy, czy i do ilu węzłów
chłonnych wytworzył przerzuty i czy nastąpił rozsiew do odległych narządów. Klasyfikacja
nowotworu jest ważna, ponieważ stopień zaawansowania w diagnozie jest najsilniejszym
predyktorem przeżycia i leczenie jest często zmieniane w oparciu o stopień zaawansowania.
Poprawna klasyfikacja jest krytyczna, ponieważ leczenie bezpośrednio związane jest ze
stopniem zaawansowania choroby. Zatem, niepoprawna klasyfikacja prowadziłaby do niewłaściwego leczenia i poważnego zmniejszenia możliwości przeżycia pacjentów. Prawidłowa klasyfikacja może być jednak trudna do osiągnięcia. Patologiczna klasyfikacja, w której
patolog bada skrawki tkanki, może być szczególnie problematyczna z dwóch szczególnych
powodów: wizualne rozpoznanie i losowe próbkowanie tkanki. „Wizualne rozpoznanie”
oznacza zdolność do identyfikacji pojedynczych komórek nowotworowych zmieszanych ze
zdrowymi komórkami na preparacie. Przeoczenie jednej komórki może oznaczać nieprawidłową klasyfikację i prowadzić do poważnego, nieoczekiwanego szerzenia się nowotworu.
„Losowe próbkowanie” dotyczy faktu, że próbki wybiera się losowo z węzłów chłonnych
pacjentów i bada się. Jeśli zdarzy się, że komórki nowotworowe obecne w węźle chłonnym
nie są obecne w oglądanych wycinkach tkanki, może to powodować nieprawidłową klasyfikację i niewłaściwe leczenie.
[0042] Istnieje ciągła potrzeba nowych terapii przeciwnowotworowych, bez względu czy
obejmują one ulepszone drogi podawania istniejących środków przeciwnowotworowych,
czy obejmują one identyfikację, badanie i weryfikację skutecznych nowych środków przeciwnowotworowych. Istnieje również ciągła potrzeba ulepszonych sposobów monitorowania
skuteczności istniejących i jakichkolwiek nowych środków przeciwnowotworowych w przebiegu danego trybu leczenia. Konieczne są ulepszone sposoby uzyskiwania danych o wartości predykcyjnej. Dawkowanie i częstość przyjmowania terapii z użyciem środków przeciwnowotworowych jest ważnym czynnikiem. Również, określanie czasu początku leczenia
przeciwnowotworowego względem stadium postępu nowotworu lub względem grupy pacjentów są ważnymi czynnikami. Wymagane są ulepszone sposoby monitorowania, w celu
poszukiwania optymalnych terapii dla pacjentów, czy to pojedynczo czy też sklasyfikowanych jako grupy za pomocą cech genetycznych, fenotypowych lub innych.
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[0043] Istnieje również potrzeba bardziej dokładnych i niezawodnych sposobów diagnozowania/klasyfikacji nowotworów.
STRESZCZENIE WYNALAZKU
[0044] Twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że w pewnych guzach litych ekspresja receptora chemokin CCR4 jest wczesnym zdarzeniem w powstawaniu raka. Dodatkowo
twórcy wynalazku stwierdzili, że ekspresja dwóch ligandów CCR4, CCL17 i CCL22, zwiększa się podczas postępu nowotworu.
[0045] Ujawnia się tu również sposób uzyskiwania informacji o charakterze predykcyjnym
lub diagnostycznym dla pacjenta z nowotworem, obejmujący etap pomiaru ilości i/lub aktywności receptora chemokin CCR4 eksprymowanego przez komórki nowotworowe w
próbce guza litego lub w próbce nowotworu z komórek niehematologicznych pobranej od
pacjenta, przy czym ilość i/lub aktywność CCR4 dostarcza informację o charakterze predykcyjnym lub diagnostycznym.
[0046] Nowotwory hematologiczne pochodzą z komórek krwi, w tym komórek immunologicznych, i obejmują białaczki i chłoniaki różnych typów. Wynalazek ten nie dotyczy zatem
nowotworów hematologicznych. Wynalazek dotyczy nowotworów wybranych spośród raka
szyjki macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu, trzustki, szyi, nerki, wątroby, sutka, pęcherza, żołądka, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego Tak
więc, jakiekolwiek odniesienie do „guza litego lub nowotworu niehematologicznego” w
odniesieniu do dowolnych aspektów niniejszego wynalazku powinno być tu rozumiane
jako ograniczone do konkretnych rodzajów nowotworu wymienionych powyżej.
[0047] W guzach litych lub nowotworach niehematologicznych, których dotyczy wynalazek,
CCR4 eksprymują komórki nowotworu. Sposoby według wynalazku dotyczą zatem nowotworów eksprymujących CCR4, w których CCR4 jest eksprymowany przez próbki nowotworowych komórek pacjenta (lub komórki referencyjne) i zasadniczo nie przez komórki
układu immunologicznego. W zakresie, w jakim CCR4 pojawia się w jakichkolwiek próbkach nowotworu od pacjenta z niepożądanego źródła, takiego jak naciekające komórki immunologiczne, mierzona ilość i/lub aktywność CCR4 jest nieznacząca albo podlega kontroli
we wszystkich wykonanych pomiarach.
[0048] Referencyjną ilość i/lub poziom aktywności CCR4 można zmierzyć w jednej lub
większej liczbie próbek nienowotworowych. Próbki lub co najmniej jedną próbkę nienowotworową można pobrać od pacjenta. Gdy referencyjną ilość i/lub poziom aktywności CCR4
określa się dla komórek nienowotworowych od pacjenta, można pobrać od pacjenta pojedynczą próbkę tkanki nienowotworowej. W razie potrzeby, wiele próbek nienowotworowych można pobrać z różnych lokalizacji od tego samego pacjenta. Referencyjna ilość może
zatem być wartością średnią określoną dla szeregu próbek pobranych od pacjenta.
[0049] W innych postaciach, jednej lub większej liczby próbek nienowotworowych ewentualnie nie pobiera się od pacjenta. Takie próbki można pobierać od innych pacjentów i mogą
one obejmować hodowane linie komórek nowotworowych.
[0050] Niniejszy wynalazek dostarcza w jednym aspekcie sposób przewidywania tego,
czy guz lity lub nowotwór niehematologiczny, który eksprymuje receptor chemokin CCR4
będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe, obejmujący etap pomiaru ilości i/lub
aktywność liganda CCR4, CCL17 w próbce wspomnianego nowotworu pobranej od pacjenta, porównania ilości i/lub aktywności CCL17 we wspomnianej próbce nowotworu z
referencyjną ilością i/lub poziomem aktywności CCL17 zmierzonymi w, lub wstępnie
określonymi na podstawie, jednej lub większej liczbie(-y) próbek nienowotworowych i
przewidywania, czy wspomniany nowotwór będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym zwiększona ilość i/lub aktywność CCL17 w porównaniu z referencyjną
ilością i/lub aktywnością wskazuje na nowotwór, który będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe oraz przy czym wspomniany nowotwór jest wybrany spośród raka szyjki
macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu, trzustki, szyi, nerki, wątroby,
sutka, pęcherza, żołądka, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego.
7
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[0051] W innym aspekcie dostarcza się sposób identyfikowania nowotworu złośliwego u
pacjenta, obejmujący etap pomiaru ilości i/lub aktywność liganda CCR4, CCL17 w próbce
nowotworu pobranej od pacjenta, porównania ilości i/lub aktywności CCL17 we wspomnianej próbce nowotworu z referencyjną ilością i/lub poziomem aktywności CCL17
zmierzonymi w, lub wstępnie określonymi na podstawie, jednej lub większej liczbie(-y)
próbek nienowotworowych i postawienia diagnozy, przy czym zwiększona ilość i/lub aktywność CCL17 w porównaniu z referencyjną ilością i/lub aktywnością wskazuje na nowotwór złośliwy oraz przy czym wspomniany nowotwór jest wybrany spośród raka szyjki
macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu, trzustki, szyi, nerki, wątroby,
sutka, pęcherza, żołądka, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego.
[0052] W innym aspekcie dostarcza się sposób określania czy guz lity lub nowotwór niehematologiczny, który eksprymuje CCR4 odpowiedział na leczenie przeciwnowotworowe,
przy czym pacjent otrzymał leczenie przeciwnowotworowe i pomiary ilości i/lub aktywności CCL17 wykonuje się przed i po rozpoczęciu leczenia i uzyskaną informację stosuje się
do określenia czy guz lity lub nowotwór z komórek niehematologicznych pacjenta odpowiedział na leczenie przeciwnowotworowe, oraz przy czym wspomniany nowotwór jest wybrany spośród raka szyjki macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu,
trzustki, szyi, nerki, wątroby, sutka, pęcherza, żołądka, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego.
[0053] Informację o charakterze predykcyjnym lub diagnostycznym można otrzymać
przez porównanie ilości i/lub aktywności CCL17 i ewentualnie CCL22 w próbce guza litego lub próbce nowotworu z komórek niehematologicznych z referencyjną ilością i/lub poziomem aktywności CCL17 i ewentualnie CCL22.
[0054] Referencyjną ilość i/lub poziom aktywności CCL17 i ewentualnie CCL22 można
zmierzyć w jednej lub większej liczbie próbek nienowotworowych. Jak wspomniano powyżej, próbki nienowotworowe można pobrać od pacjenta lub od innego pacjenta lub źródła, w tym hodowanych linii komórkowych.
[0055] Tę informację można wykorzystać dla przewidywania czy guz lity lub nowotwór z
komórek niehematologicznych pacjenta będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe.
[0056] W kolejnych korzystnych postaciach, pacjent otrzyma leczenie przeciwnowotworowe i pomiary ilości i/lub aktywności CCL17 i ewentualnie CCL22 wykonuje się przed i po
rozpoczęciu leczenia i uzyskaną informację stosuje się do określenia czy guz lity lub nowotwór z komórek niehematologicznych pacjenta odpowiedział na leczenie przeciwnowotworowe.
[0057] We wszystkich aspektach wynalazku, konkretne leczenie przeciwnowotworowe może obejmować środek, który moduluje lub hamuje ekspresję lub aktywność CCR4.
[0058] Ujawnia się tu sposób leczenia pacjenta z nowotworem mającego guz lity lub nowotwór niehematologiczny eksprymujący CCR4, obejmujący podawanie skutecznej ilości
środka, który moduluje lub hamuje ekspresję lub aktywność CCR4.
[0059] Środek można podawać w postaci preparatu farmaceutycznego. Odpowiednie preparaty obejmują jałowe wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny i emulsje. Kompozycje mogą ponadto obejmować środki pomocnicze lub zaróbki, znane w dziedzinie, patrz, np. Berkow i in., The Merck Manual, 16. wydanie Merck & Co., Rahman, NJ (1992), Avery's
Drug_Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3. wydanie, ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987) & Osol (wyd.), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 1324-1341 (1980).
Kompozycje farmaceutyczne podawane zgodnie z wynalazkiem korzystnie są w postaci pojedynczych dawek (dawek jednostkowych).
[0060] Kompozycja lub lek może dalej zawierać sole, bufory lub inne substancje, które są
pożądane do ulepszania skuteczności kompozycji. Podawanie kompozycji lub leku według
wynalazku może być lokalne lub ogólnoustrojowe.
[0061] We wszystkich ze wspomnianych wcześniej sposobach, środkiem, który moduluje
8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
lub hamuje ekspresję lub aktywność CCR4 może być:
(i) przeciwciało, które wiąże się z CCR4; ewentualnie przeciwciało anty-CCR4, jak
ujawniono w którymkolwiek z WO0041724, WO0164754, WO05035582,
WO03018635, WO05053741, WO0042074; lub
(ii) przeciwciało, które wiąże się z ligandami CCR4, CCL17 lub CCL22; ewentualnie
przeciwciała anty-CCL17 lub anty-CCL22, jak ujawniono w WO99/15666, lub Ishida,
T., i in. (2004) Clin Cancer Res 10:7529-7539.
(iii) antagonista CCR4, ewentualnie antagonista CCR4, jak ujawniono w którymkolwiek
z WO04007472, WO05023771, WO02094264, WO0230358, WO0230357,
WO051236976,
WO05085212,
WO05082865,
WO04108717,
EP1633729,
WO03014153.
[0062] Odpowiednie kompozycje i preparaty środków czynnych obejmują te opisane we
wcześniej wspomnianych publikacjach.
[0063] Wynalazek dostarcza ponadto sposób według zastrzeżenia 1 określania czy pacjent z
nowotworem jest odpowiedni do leczenia środkiem przeciwnowotworowym.
[0064] Odpowiedniość pacjenta z nowotworem do leczenia szczególnym środkiem terapeutycznym zależy od wielu czynników, przy czym niektóre są wzajemnie powiązane. Wiek
pacjenta, płeć, stopień zaawansowania nowotworu, typ nowotworu, uwarunkowania genetyczne pacjenta, czynniki związane ze stylem życia, takie jak dieta lub palenie, mogą
wszystkie wpływać na potencjalny rezultat danego trybu leczenia. Stratyfikację zazwyczaj
podejmuje się, aby pogrupować pacjentów na podstawie wielu wybranych parametrów, które
mogą pozwalać na przewidywania wykonane pod względem rezultatu klinicznego dla grupy
pacjentów lub pojedynczego pacjenta z grupy.
[0065] Na ogół, zwiększony poziom lub aktywność CCL17 i ewentualnie CCL22 w próbce
nowotworu pacjenta wskazuje, dla kogo leczenie ujawnionymi tu środkami przeciwnowotworowymi jest korzystne.
[0066] Wynalazek obejmuje ponadto sposób monitorowania skuteczności leczenia przeciwnowotworowego według zastrzeżenia 4.
[0067] We wspomnianych wcześniej sposobach, próbkowanie komórek nowotworowych
można wykonać przed, podczas i/lub po podaniu środka przeciwnowotworowego.
[0068] Ujawnia się również sposoby profilaktyki lub leczenia pewnych guzów litych jak
tutaj opisano, obejmujące podawanie środka wybranego spośród:
(a) środków modulujących CCR4 np. jak ujawniono w WO0041724A1 (LELAND
STANFORD / LEUKOSITE);
(b) przeciwciał anty-CCR4, np. jak ujawniono w WO0164754 (Kyowa Hakko Kogyo),
WO05035582 (Kyowa Hakko Kogyo), WO03018635 (Kyowa Hakko Kogyo),
WO05053741 (Kyowa Hakko Kogyo) lub WO0042074 (MILLENIUM
PHARMACEUTICALS); lub
(c) antagonistów CCR4, np. jak ujawniono w WO04007472 (ONO
PHARMACEUTICAL CO.), WO05023771 (ONO PHARMACEUTICAL CO.),
WO02094264 (TULARIK INC.), WO0230358 (TULARTK / CHEMOCENTRYX),
WO0230357 (CHEMOCENTRYX), WO051236976 (ASTELLAS PHARMA INC.),
WO05085212 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO05082865
(YAMANOUCHI
PHARMACEUTICAL
CO.,
LTD.),
WO04108717
(ASTRAZENECA AB), EP1633729 (ASTRAZENECA AB) lub WO03014153
(TOPIGEN PHARMACEUTIQUE INC.)
[0069] Wynalazek dostarcza zatem również sposób według zastrzeżenia 1. Zwiększone poziomy aktywności i/lub ekspresji CCL17 i ewentualnie CCL22, czy to bezwzględnie, standaryzowane z uwzględnieniem wartości referencyjnej, czy względnie (standaryzowane) jak
między (a) komórkami nowotworowymi/nienowotworowymi lub (b) komórkami nowotworowymi w czasie, na ogół wskazuje na nowotwór podatny na leczenie ujawnionymi tu środkami przeciwnowotworowymi.
9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[0070] Próbkami uzyskanymi od pacjentów są korzystnie próbki biopsji. Biopsja jest badaniem medycznym obejmującym usunięcie komórek lub tkanek do badania. Tkankę na ogół
bada pod mikroskopem patolog i/lub można ją analizować chemicznie stosując sposoby dobrze znane w dziedzinie, aby ocenić poziomy białka lub RNA. Gdy pobiera się mniejszą
próbkę tkanki, procedurę nazywa się biopsją nacięciową lub biopsją rdzeniową. Gdy pobiera
się cały guzek lub podejrzany obszar, procedurę nazywa się biopsją wycinkową. Gdy próbkę
tkanki lub płynu pobiera się igłą, procedurę nazywa się aspiracyjną biopsją igłową.
[0071] W alternatywnych postaciach, próbki nowotworu można uzyskać od pacjentów innymi sposobami dobrze znanymi w dziedzinie, w tym, lecz nie wyłącznie, próbki komórek
pobranych przez test „wymazu”.
[0072] Test wymazu (na przykład test Papancolaou, zwany również wymazem Pap lub testem wymazu z szyjki macicy) można zastosować do pobierania próbek komórek od pacjentki. W przypadku testu wymazu z szyjki macicy, komórki pobiera się i usuwa z powierzchni tkanki badanej za pomocą kontaktu fizycznego ze szpatułką Aylesbury, plastikową rozgałęzioną „szczoteczką” lub innym przyrządem.
[0073] Komórki zebrane w próbce pobranej od pacjenta można poddać obróbce natychmiast
lub zachować w odpowiedniej pożywce do przechowywania do późniejszej obróbki. Przykładowo w przypadku testu wymazu z szyjki macicy komórki często zachowuje się w pożywce do przechowywania na bazie etanolu do późniejszej obróbki i analizy. Próbkę można
traktować do celów zachowania lub maksymalizowania dokładności i/lub niezawodności
uzyskanego sygnału przez analizę próbki.
[0074] We wszystkich ze sposobów i zastosowań według wynalazku czy to zdefiniowanych
czy opisanych powyżej lub poniżej, nowotworami są te, które wytwarzają guzy lite wybrane
z grupy obejmującej raka oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry (np. czerniak lub rak podstawnokomórkowy), mózgu, trzustki, szyi, nerki, wątroby, sutka, pęcherza, przełyku, żołądka,
szyjki macicy, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego. Korzystniej, nowotworami są raki szyjki macicy, przełyku, nerki, mózgu, sutka i jajnika.
[0075] W innych postaciach nowotworem może być rak, korzystnie rak płaskokomórkowy
(SCC) lub gruczolakorak, korzystnie wybrany z raków szyjki macicy, przełyku, nerki, mózgu, sutka i jajnika.
[0076] W korzystnych postaciach, zwiększony poziom CCL17 i ewentualnie CCL22 wytwarzanego przez komórki nowotworowe identyfikuje nowotwór złośliwy lub nowotwór potencjalnie złośliwy.
[0077] Można określić poziom CCL17 i ewentualnie CCL22 i/lub CCR4 wytwarzanego w
komórkach nienowotworowych i porównuje się poziom w komórkach nowotworowych i
nienowotworowych.
[0078] Poziom CCL17 i ewentualnie CCL22 i/lub CCR4 w komórkach nowotworowych
można porównać z wcześniej określonymi poziomami. Wcześniej określone poziomy można
uzyskać z normalnej nienowotworowej tkanki, tkanek nowotworowych wcześniejszego stadium, danych uzyskanych z baz danych lub bezpośrednio z dostępnego materiału biologicznego lub próbek.
[0079] Różne drogi określania poziomu CCL17 i ewentualnie CCL22 i/lub CCR4 można
stosować w sposobach według wynalazku. Korzystnie poziom białka i/lub aktywność CCR4
i/lub CCL17 i/lub CCL22 można stosować jako miarę produktów genu CCR4 i/lub CCL17
i/lub CCL22 w próbce.
[0080] W kolejnej korzystnej postaci, poziom białka CCL17 i ewentualnie CCR4 i/lub
CCL22 mierzy się stosując przeciwciało reaktywne wobec odpowiednio CCR4, CCL17 i
CCL22, korzystnie specyficzne przeciwciało, np. przeciwciało monoklonalne.
[0081] Lokalizację i ilość specyficznych białek można wykryć technikami mikroskopowymi
i histologicznymi. Stosując otrzymywanie próbki, barwienie i techniki sondowania dobrze
znane w dziedzinie, można pokazać strukturę komórek i można wykryć specyficzne białka
związane z nimi i określić ich lokalizację w próbce.
10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[0082] Barwienie histochemiczne jest dobrze znane w dziedzinie i można je zastosować, aby
pokazać morfologię komórki i/lub bardziej specyficzne składniki komórkowe. Powszechnie
stosowane barwienia obejmują hematoksylinę (która barwi kwasy nukleinowe i ergastoplazmę, niebieska) i eozynę (która barwi włókna sprężyste i siateczkowe, różowa).
[0083] Immunohistochemia jest techniką, w której stosuje się przeciwciała do specyficznych
białek do wykrywania tych białek w próbkach. Ich wiązanie przeciwciała z antygenem w
próbce można wykryć wieloma sposobami.
[0084] Najbardziej standardowym sposobem jest sprzęganie enzymu, który katalizuje reakcję zmiany koloru (np. fosfatazy alkalicznej, peroksydazy chrzanowej), z przeciwciałem,
zatem zastosowanie odpowiedniego chromogennego substratu pozwala na wizualizację lokalizacji antygenu w mikroskopie świetlnym. Odmianą tego sposobu jest immunofluorescencja, w której przeciwciało sprzęga się z fluoroforem (np. FITC, rodaminą, Texas Red), który
emituje wykrywalny sygnał, po wzbudzeniu odpowiednim źródłem energii. Normalnie jest
to światło o określonej długości fali. Immunofluorescencja jest korzystna, ponieważ zastosowanie wielu fluoroforów przyłączonych do różnych przeciwciał pozwala na wykrywanie
wielu celów w próbce i jest szczególnie odpowiednia do konfokalnej laserowej mikroskopii
skaningowej, która jest wysoce czuła i można ją również zastosować do wizualizowania
oddziaływań między wieloma białkami. Często wykrywanie specyficznego antygenu realizuje się przez wieloetapowy sposób pośredni. Nieznakowane lub niesprzężone „pierwszorzędowe” przeciwciało, wytworzone przeciwko badanemu antygenowi stosuje się do związania tego antygenu. To „pierwszorzędowe” przeciwciało można następnie wykrywać „drugorzędowym” przeciwciałem sprzężonym z wykrywalny markerem i wytworzonym tak, że
będzie reagowało z immunoglobuliną gatunku, w którym wytworzono przeciwciało „pierwszorzędowe”.
[0085] Do pomiaru poziomów białka z użyciem przeciwciał można stosować techniki takie
jak ELISA (test immunoenzymatyczny), RIA (test radioimmunologiczny), EMIT (technika
wielokrotnego testu immunologicznego), analiza mikromacierzowa białek, cytometria przepływowa, western blot, dot blot lub slot blot, korzystnie metodologia jest ilościowa.
[0086] Cytometria przepływowa jest techniką liczenia, badania i sortowania pod mikroskopem cząstek zawieszonych w strumieniu płynu. Pozwala na równoczesną wieloparametrową
analizę fizycznych i/lub chemicznych cech pojedynczych komórek przepływających przez
aparat do optycznej i/lub elektronicznej detekcji.
[0087] Sortowanie komórek aktywowane przez fluorescencję (FACS) jest wyspecjalizowanym typem cytometrii przepływowej. Zapewnia sposób sortowania heterogennej mieszaniny
komórek biologicznych do dwóch lub większej liczby pojemników, jednej komórki na raz, w
oparciu o cechy specyficznego rozpraszania światła i fluorescencji dla każdej komórki. Jest
to użyteczne narzędzie naukowe, ponieważ dostarcza szybkie, obiektywne i ilościowe rejestrowanie sygnałów fluorescencyjnych z pojedynczych komórek, jak również fizyczne oddzielenie szczególnie interesujących komórek.
[0088] Populacja komórek w próbce normalnie jest heterogenna. Aby wykryć różnice między komórkami, traktuje się je chemicznymi i immunochemicznymi technikami podobnymi
to tych histochemicznych. Wykrywanie immunochemiczne antygenów można zrealizować
stosując przeciwciała znakowane fluoroforami, takimi jak FITC, Cy5 i GFP. Barwienie komórek barwnikami (takimi jak barwniki wiążące DNA SYBR-Green i DAPI) można zastosować do wykrywania różnic, takich jak wielkość komórki lub etap cyklu komórkowego
wewnątrz i między próbkami. Stosowanie tych technik w połączeniu pozwala na nadanie
różnym komórkom wśród heterogennych specyficznych profili fluorescencyjnych, które są
rozróżnialne przez cytometrię przepływową. W ten sposób komórki eksprymujące szczególne antygeny lub związane ze szczególnymi profilami rozpraszania światła można wykryć i
zmierzyć ich częstość występowania w populacji próbnej.
[0089] Alternatywnie, poziom CCL17 i ewentualnie CCR4 i/lub CCL22 można określić
poprzez pomiar poziomu mRNA kodującego CCR4 i/lub CCL17 i/lub CCL22, jako pomiar
11
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
poziomu produktu genu CCR4 i/lub CCL17 i/lub CCL22 w próbce.
[0090] W kolejnych korzystnych postaciach wynalazku poziom mRNA mierzy się metodą
ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), korzystnie metodą qPCR, gdzie matrycą
jest produkt reakcji odwrotnej transkryptazy (RT-qPCR).
[0091] W korzystnych postaciach, mRNA ekstrahuje się z próbki i poddaje odwrotnej transkrypcji z wytworzeniem cDNA przed qPCR.
[0092] W innych korzystnych postaciach, poziom transkrypcji CCL17 i ewentualnie CCL22
i/lub CCR4 mierzy się stosując test ochrony przed nukleazą, korzystnie stosowana sonda jest
specyficzna dla CCR4 i/lub CCL17 i/lub CCL22.
[0093] W innych korzystnych postaciach wynalazku poziom mRNA mierzy się stosując
mikromacierz DNA.
[0094] Mikromacierz DNA (znana również jako czip genowy lub genomowy, czip DNA lub
macierz genowa) jest zbiorem mikroskopowych plamek DNA, wspólnie reprezentujących
pojedyncze geny, rozmieszczonych w postaci macierzy na stałej powierzchni przez kowalencyjne połączenie z chemicznie odpowiednimi matrycami. Jakościowe lub ilościowe pomiary z użyciem mikromacierzy DNA wykorzystują selektywny charakter hybrydyzacji
DNA-DNA lub DNA-RNA w warunkach wysokiej ostrości. Wykrywanie oparte na fluoroforze można zastosować do określenia stopnia hybrydyzacji, z którego można obliczyć pomiar ilościowy.
[0095] W korzystnych postaciach, nowotworem jest nowotwór złośliwy. Alternatywnie,
nowotworem możne być nowotwór przedrakowy. Sposób według wynalazku może korzystnie identyfikować stopień zaawansowania, do którego nastąpił postęp nowotworu u pacjenta,
pozwalając w ten sposób na identyfikację najodpowiedniejszego przebiegu leczenia.
[0096] Ujawnia się również zastosowanie receptora CCR4 jako markera do identyfikacji
i/lub klasyfikacji nowotworu. Receptor CCR4 można wykryć za pomocą przeciwciała, korzystnie specyficznego przeciwciała, np. przeciwciała monoklonalnego.
[0097] Zgodnie ze sposobem według wynalazku wcześniej tu opisanym, w tym wszystkimi zależnymi aspektami, wynalazek dostarcza zastosowanie liganda CCL17 jako markera
do identyfikacji i/lub klasyfikacji nowotworu. Ligand CCL17 może być wykryty za pomocą przeciwciała, korzystnie specyficznego przeciwciała, np. przeciwciała monoklonalnego.
[0098] Wynalazek ewentualnie dodatkowo dostarcza również zastosowanie liganda
CCL22 jako markera do identyfikacji i/lub klasyfikacji nowotworu. Ligand CCL22 może
być wykryty za pomocą przeciwciała, korzystnie specyficznego przeciwciała, np. przeciwciała monoklonalnego.
[0099] Leczenie przeciwnowotworowe może obejmować przeciwciało specyficzne dla
CCR4, i może być przeciwciałem monoklonalnym, na przykład, przeciwciałami ujawnionymi w WO0164754 (Kyowa Hakko Kogyo), WO05035582 (Kyowa Hakko Kogyo),
WO03018635 (Kyowa Hakko Kogyo), WO05053741 (Kyowa Hakko Kogyo) lub
WO0042074 (MILLENIUM PHARMACEUTICALS); lub przeciwciałem specyficznym
dla CCL17, które może być przeciwciałem monoklonalnym, lub przeciwciałem specyficznym dla CCL22, które może być przeciwciałem monoklonalnym.
[0100] Przeciwciałem może być fragment Fab, przy czym ten fragment Fab może być wybrany z grupy obejmującej: fragmenty scFv, F(ab')2, Fab, Fv i Fd; lub regiony CDR3.
[0101] Fragment wiążący antygen (fragment Fab) jest regionem na przeciwciele, który wiąże
się z antygenami. Jest złożony z jednej stałej i jednej zmiennej domeny każdego z łańcucha
ciężkiego i lekkiego. Domeny te formują paratop - miejsce wiązania antygenu - na końcu
aminowym monomeru. Dwie domeny zmienne wiążą epitop na ich specyficznych antygenach.
[0102] Można wytworzyć fragmenty Fc i Fab. Enzym papainę można zastosować do trawienia monomeru immunoglobuliny na dwa fragmenty Fab i fragment Fc. Enzym pepsyna trawi
poniżej regionu zawiasowego, tak że można utworzyć fragment F(ab')2 i fragment Fc. Regiony zmienne łańcuchów ciężkiego i lekkiego można połączyć razem z wytworzeniem po-
12
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
jedynczego łańcucha zmiennego (scFv), który ma połowę wielkości fragmentu Fab, który
jeszcze zachowuje wyjściową specyficzność rodzicielskiej immunoglobuliny.
[0103] Region determinujący komplementarność (CDR) jest krótką sekwencją aminokwasową występującą w domenach zmiennych białek receptora antygenu (np. immunoglobuliny
i receptora komórek T), która stanowi uzupełnienie dla antygenu, a tym samym zapewnia
receptorowi jego specyficzność dla tego konkretnego antygenu. Większość zmian sekwencji
związanych z immunoglobulinami i receptorami komórek T występuje w regionach CDR,
regiony te nazywa się czasami domenami hiperzmiennymi. Wśród nich, CDR3 wykazuje
największą zmienność, ponieważ jest kodowany przez rekombinację regionów VJ.
[0104] Przeciwciała mogą być przeciwciałami humanizowanymi lub chimerycznymi.
[0105] Przeciwciała humanizowane lub przeciwciała chimeryczne są typu przeciwciała monoklonalnego, które syntetyzuje się stosując technologię rekombinowanego DNA, aby ominąć kliniczny problem odpowiedzi immunologicznej na obce antygeny. W standardowej
procedurze wytwarzania przeciwciał monoklonalnych uzyskuje się mysie przeciwciała.
Chociaż mysie przeciwciała są bardzo podobne do ludzkich przeciwciał, różnice są wystarczająco znaczące, że ludzki układ immunologiczny rozpoznaje mysie przeciwciała, jako obce, szybko je usuwając z krążenia i powodując układowe działania zapalne.
[0106] Przeciwciała humanizowane można wytwarzać poprzez łączenie DNA, które koduje
część wiążącą monoklonalne mysie przeciwciało, z DNA wytwarzającym ludzkie przeciwciało. Hodowle komórek ssaczych następnie stosuje się do eksprymowania tego DNA i wytwarzania tych częściowo-mysich i częściowo-ludzkich przeciwciał, które nie są tak immunogenne jak te czysto mysiej odmiany.
[0107] Można dokonać modyfikacji przeciwciał monoklonalnych, które wiążą tylko antygeny specyficzne dla komórek i korzystnie indukują odpowiedź immunologiczną przeciw docelowej komórce nowotworowej. Takie przeciwciała monoklonalne korzystnie modyfikuje
się, aby dostarczały toksynę, radioizotop, cytokinę lub inny aktywny koniugat.
[0108] W innym aspekcie technologii przeciwciał, przeciwciała bispecyficzne można zaprojektować, aby wiązały się swoimi regionami Fab zarówno z docelowym antygenem jak i
koniugatem lub komórką efektorową. Również, wszystkie nienaruszone przeciwciała mogą
wiązać receptory komórkowe lub inne białka ze swoimi regionami Fc.
[0109] Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych może również obejmować technologie nazywane klonowaniem repertuaru lub prezentacją fagową/prezentacją
drożdżową. Mogą one obejmować zastosowanie wirusów lub drożdży, a nie myszy, do wytworzenia przeciwciał. Techniki te polegają na szybkim klonowaniu segmentów genu immunoglobuliny, aby wytworzyć biblioteki przeciwciał o delikatnie różnych sekwencjach
aminokwasowych, z których można wybrać przeciwciała o pożądanych specyficznościach.
Sposób ten można zastosować do wzmocnienia specyficzności, z jaką przeciwciała rozpoznają antygeny, zmiany ich trwałości w różnych warunkach środowiskowych, zwiększenia
ich skuteczności terapeutycznej i modulowania ich wykrywalności w zastosowaniach diagnostycznych.
[0110] Ujawnia się również sposób leczenia lub profilaktyki choroby złośliwej u osobnika
cierpiącego z powodu nowotworu, obejmujący leczenie tego osobnika z zastosowaniem
skutecznej ilości drobnocząsteczkowego inhibitora CCR4 i/lub CCL17 i/lub CCL22.
[0111] Przykładowe drobnocząsteczkowe inhibitory ujawniono w WO04007472 (ONO
PHARMACEUTICAL CO.), WO05023771 (ONO PHARMACEUTICAL CO.),
WO02094264 (TULARIK INC.), WO0230358 (TULARIK / CHEMOCENTRYX),
WO0230357 (CHEMOCENTRYX), WO051236976 (ASTELLAS PHARMA INC.),
WO05085212 (YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO05082865
(YAMANOUCHI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), WO04108717 (ASTRAZENECA
AB),
EP1633729
(ASTRAZENECA
AB)
lub
WO03014153
(TOPIGEN
PHARMACEUTIQUE INC.)
13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[0112] Ujawnia się również sposób leczenia lub profilaktyki choroby złośliwej u osobnika
cierpiącego z powodu nowotworu, obejmujący leczenie tego osobnika z zastosowaniem
skutecznej ilości środka, który moduluje aktywność CCR4 i/lub CCL17 i/lub CCL22.
[0113] Przykładowe środki modulujące CCR4 ujawniono w WO0041724A1 (LELAND
STANFORD / LEUKOSITE).
[0114] Wynalazek zostanie teraz opisany bardziej szczegółowo, w tym za pomocą przykładów doświadczalnych i w odniesieniu do rysunków, na których:
KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW
[0115]
Figura 1 - Ekspresja niRNA CCR4 zwiększa się w złośliwych biopsjach szyjki macicy
w porównaniu z normalnymi tkankami.
(A) Podsumowanie udziału procentowego próbek eksprymujących mRNA receptora chemokin CC i CXC w tkance szyjki macicy nienowotworowej (białe słupki) i
złośliwej (czarne słupki) po teście ochrony przed rybonukleazą (RPA) pod względem ekspresji mRNA.
(B) RPA próbek tkanki nienowotworowej 1 do 14 i tkanek złośliwych: biopsje gruczolakoraka, próbki 1 do 4 i biopsje raka płaskokomórkowego (SCC), próbki 1 do
11. Stopniami zaawansowania dla tkanek gruczolakoraka były: 1 do 3, 1B1; 4, 1B2.
Stopniami zaawansowania dla SCC były: 1, 1A2; 2 do 8-11, 1B1; 9, 1B2 i 10, 2A.
(C) Zwiększenie ekspresji genu CCR4 w przedziale nabłonkowym i zrębu, w porównaniu z ich nienowotworowymi odpowiednikami. Ekspresję mRNA w nienowotworowej tkance szyjki macicy zastosowano jako linię podstawową do porównania mRNA tkanki złośliwej i przedstawiono jako wartość „1”.
Figura 2 - Immunohistochemia w kierunku CCR4 podczas postępu zezłośliwienia szyjki macicy
Ekspresja białka CCR4 w zrębie (A) nienowotworowej tkanki szyjki macicy, 200x; (B)
CIN 200x; (C) inwazyjnej tkanki szyjki macicy, 200x. Ekspresja białka CD68+ w (D)
normalnej tkance, 400x: (E) CIN, 200x: i (F) inwazyjnym raku szyjki macicy, 400x.
Białko FoxP3+
barwienie w (G) nienowotworowej tkance szyjki macicy, 200x; (H) CIN, 400x; i (I) inwazyjnym raku szyjki macicy, 400x. Nabłonkowa ekspresja białka CCR4 w (I) nienowotworowej tkance 200x; (K) CIN, 400x i (L) inwazyjnym raku szyjki macicy, 400x.
Figura 3 - Wynik immunohistochemii w kierunku komórek CCR4, CD68 i FoxP3dodatnich podczas postępu zezłośliwienia szyjki macicy
(A) Całkowity wynik barwienia CCR4 komórek nabłonkowych (czarne słupki) i komórek zrębu (białe słupki) obliczony jako „dodatniość” x „intensywność” w normalnej
tkance (n=23), CIN (n=63) i SCC (n=45), nawrotowym nowotworze (n=15), przerzucie
do węzła chłonnego (n=10) i gruczolakoraku (n=10). (B) Średni wynik CD68+ (+SE)
dla nacieków makrofagów wewnątrz i w okolicy guza w normalnej tkance (n=11), CIN
(n=16), gruczolakorakach (n=16), nawrotowym nowotworze (n=24) i złogach przerzutowych w węzłach chłonnych (n=11); ** p<0,001; * p<0,005. (C) Średni wynik FoxP3+
(+SE) dla nacieków komórek Treg wewnątrz i w okolicy guza w normalnej tkance
(n=11), CIN (n=16), gruczolakorakach (n=44), nawrotowych nowotworach (n=24) i
złogach przerzutowych w węzłach chłonnych (n=11); * p<0,01. (D) Całkowity wynik
CCR4 dla komórek nabłonkowych (czarne słupki) i komórek zrębu (białe słupki) obliczony jako „dodatniość” x „intensywność” w CIN I (n=26), CIN II (n=19) i CIN III
(n=17).
Figura 4 - ekspresja mRNA i białka liganda CCR4, CCL22 w normalnej szyjce macicy,
z CIN i SCC
(A) Poziomy ekspresji mRNA CCL22 ocenione metodą ilościowej RT-PCR w czasie
rzeczywistym w normalnych biopsjach szyjki macicy (n=14) i z SCC (n=11) (P=0,43).
Ekspresja białka CCL22 w (B) nienowotworowych tkankach szyjki macicy, 200x, 200x;
14
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(C) z CIN, 200x i (D) SCC, 200x. (E) Całkowity wynik CCL22 dla komórek nabłonkowych (czarne słupki) i komórek zrębu (białe słupki) obliczony jako „dodatniość” x „intensywność” w normalnych próbkach szyjki macicy (n=16), z CIN (n=17), SCC (n=19)
i gruczolakorakiem (n=5).
Figura 5 - ekspresja mRNA i białka liganda CCR4, CCL17 w normalnej szyjce macicy,
z CIN i SCC
(A) Poziomy ekspresji mRNA CCL17 ocenione metodą ilościowej RT-PCR w czasie
rzeczywistym w normalnych biopsjach szyjki macicy (n=7) w porównaniu z SCC
(n=11) (P=0,02). Ekspresja białka CCL17 w (B) nienowotworowej tkance, 200x, (C)
CIN, 200x i (D) SCC, 200x. (E) Całkowity wynik CCL17 dla komórek nabłonkowych
(czarne słupki) i komórek zrębu (białe słupki) obliczony jako „dodatniość” x „intensywność” w normalnych próbkach szyjki macicy (n=21), z CIN (n=33), SCC (n=20) i gruczolakorakiem (n=4).
Figura 6 - CCR4 jest funkcjonalny na linii komórkowej raka szyjki macicy C-41
(A) Ekspresję białka CCR4, CCL17 i CCL22 (niebieskie linie) zmierzono w linii komórkowej raka szyjki macicy C-41 z zastosowaniem cytometrii przepływowej. Ekspresję/internalizację CCR4 przez C-41 badano po stymulacji 100 ng/ml (B) CCL17 i (C)
CCL22 (niebieska linia reprezentuje kontrolę CCR4 w czasie 0 minut; pomarańczowa
linia wskazuje ekspresję białka CCR4 po stymulacji odpowiednim ligandem). (D) Migracja komórki raka szyjki macicy C-41 w odpowiedzi na CCL17 i CCL22. Wartości są
średnią ± odchylenie standardowe z 10 oznaczeń, * P < 0,05, ** P< 0,01. (E i F) C-41
rosną w warunkach suboptymalnych po stymulacji 1 ng/ml, 10 ng/ml i 100 ng/ml
CCL17 i CCL22 przez 2, 4 i 6 dni. Po 6 dniach C-41 wykazywały znacznie zwiększony
wzrost po stymulacji 10 ng/ml CCL17; (P=0,017) i 100 ng/ml CCL17 (P= 0,044), lecz
nie przy 1 ng/ml CCL17 (P=0,383). Stymulacja 1 ng/ml CCL22 i 100 ng/ml CCL22
również wykazywała znacznie zwiększony wzrost: 1 ng/ml CCL22; (P=0,026) i 100
ng/ml CCL22 (P= 0,043), lecz nie przy 10 ng/ml CCL22 (P=0,195).
Figura 7 - Ekspresja CCR4 przy powstawaniu raka przełyku
Ekspresja CCR4 w normalnych (A, x40; D, x40), hiperplastycznych (B, x100), dysplastycznych (C, x40; D, x40) komórkach nabłonkowych przełyku i inwazyjnych komórkach nowotworowych (H, x200). Ekspresja CCR4 w zrębie podczas powstawania raka
przełyku: E, normalny przełyk (x200); F, dysplazja I (x200); G, dysplazja III (x200); H,
rak inwazyjny (x200).
Figura 8 - Wyniki oceny immunohistochemicznej CCR4-dodatnich komórek zrębu
podczas postępu zezłośliwienia szyjki macicy
Oceny dokonano na podstawie liczby komórek CCR4-dodatnich i intensywności wybarwienia CCR4. Liczbę komórek zmierzono jako średnią z 15 HPF: 0 = brak ekspresji
białka CCR4; +1 = 1-10 komórek CCR4-dodatnich na HPF; +2 = 10-20 komórek dodatnich na HPF; +3 (21-30 komórek na HPF); +4 (>30 komórek). Intensywność zmierzono jako: 0 = brak ekspresji; 1+ = łagodna ekspresja; 2++ = umiarkowana ekspresja;
3+++ = silna ekspresja.
Figura 9 - Wyniki oceny immunohistochemicznej CCR4-dodatnich komórek nabłonkowych podczas postępu zezłośliwienia szyjki macicy
Oceny dokonano na podstawie liczby komórek CCR4-dodatnich i intensywności wybarwienia CCR4. 0 = brak ekspresji białka CCR4 na komórkach nabłonkowych; +1 =
mniej niż 25% skrawka wykazuje ekspresję CCR4; +2 = 26-50% komórek dodatnich;
+3= 51-75% komórek dodatnich; +4 więcej niż 76% komórek CCR4-dodatnich. Intensywność zmierzono jako: 0 = brak ekspresji; 1+ = łagodna ekspresja; 2++ = umiarkowana ekspresja; 3+++ = silna ekspresja.
Figura 10 - Wyniki badania przesiewowego ekspresji CCR4 w szerszym zakresie nowotworów z użyciem biblioteki cDNA uzyskanej z ludzkiej tkanki (Cancer Research
UK). Biblioteka zawiera cDNA wytworzone z RNA wyizolowanego z 5-10 próbek no-
15
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
wotworowych i 2-5 próbek normalnych dla 11 różnych typów nowotworów: płuca,
okrężnicy, pęcherza, żołądka, trzustki, skóry, sutka, mózgu, przełyku, jajnika i gruczołu
krokowego. Poziomy ekspresji mRNA CCR4 zmierzono z zastosowaniem ilościowej
RT-PCR w czasie rzeczywistym.
Figura 11 przedstawia wyniki analizy FACS w kierunku ekspresji CCR4 na liniach
komórkowych szyjki macicy (C41, C33A) i liniach komórkowych raka nerki (786,
A498, CAKI). Linia przerywana: przeciwciało kontrolne dopasowane izotypowo; linia
szara: ekspresja CCR4.
Figura 12 przedstawia wyniki analizy FACS ekspresji CCR4 na komórkach C41 po 24
h stymulacji IL-10, TGF-β i FGF. Linia przerywana: kontrola izotypowa; linia szara:
ekspresja CCR4; linia pogrubiona: ekspresja CCR4 po stymulacji cytokiną.
Figura 13 przestawia sekwencję cDNA CCR4. Jest to opisywana tu SEQ ID NO:1.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
[0116] Twórcy wynalazku stwierdzili, że ekspresja receptora chemokin CCR4 jest wczesnym zdarzeniem w powstawaniu raka w pewnych typach nowotworów. Ekspresja nabłonkowa receptora chemokin homeostatycznych zazwyczaj obecna w tkance może zapewniać
przewagę związaną z przeżyciem zainicjowanej komórce.
[0117] Receptor chemokin CCR4 był obecny na nieinwazyjnych zmianach dysplastycznych
szyjki macicy i przełyku. Było to szczególnie widoczne w niektórych próbkach raka przełyku, gdzie CCR4-dodatnie obszary dysplastyczne były wyraźnie widoczne w obszarach przylegających do normalnych obszarów nabłonkowych w tym samym skrawku (np. Figura 7C i
D).
[0118] Zawartość receptora chemokin CCR4 zwiększała się z postępem zezłośliwienia szyjki macicy. Nie było to spowodowane jedynie zwiększonym naciekaniem CCR4-dodatnich
makrofagów i komórek Treg, lecz także nabyciem ekspresji CCR4 przez komórki nabłonkowe. Nieoczekiwanym stwierdzeniem było to, że CCR4 ulegał silnej ekspresji na nieinwazyjnych komórkach nabłonkowych w zmianach wewnątrznabłonkowych (CIN), jak również
w inwazyjnych komórkach nowotworowych. Postęp z CIN do choroby inwazyjnej był związany ze zwiększoną ekspresją ligandów CCR4, CCL17 i 22, w komórkach zrębu i te chemokiny stymulowały wzrost i migrację CCR4-dodatniej linii komórkowej raka szyjki macicy
(np. Figura 4 i Figura 6). CCR4 wykryto również na dysplastycznych, jak również inwazyjnych komórkach nabłonkowych w raku przełyku, ponownie ze zwiększonymi poziomami
CCL17 i CCL22 podczas postępu zezłośliwienia. Zmiany w gradientach CCL17 i 22 wspomagały przejście z przedinwazyjnej do inwazyjnej choroby i przyciąganie leukocytów pobudzających nowotwór, które pomagają zainicjowanym komórkom uniknąć nadzoru immunologicznego.
[0119] Dwie chemokiny wiążące CCR4, CCL17 i CCL22, stwierdzono również na powierzchni naczyń krwionośnych i limfatycznych w biopsjach nowotworu. Nie możliwe było
oznaczenie ilościowe, lecz wstępne obserwacje wskazują na wzrost intensywności wybarwienia wraz z postępem zezłośliwienia.
[0120] Innym elementem układu CCR4 jest niesygnalizujący receptor chemokin D6, który
ma wysokie powinowactwo do CCR17 i CCL22 [18]; oczekuje się, że jego obecność w
tkankach wpływa na gradienty tych chemokin [19].
[0121] Figura 6 przedstawia, że receptor CCR4 jest funkcjonalny na linii komórkowej raka
szyjki macicy C-41. Ekspresja CCR4 może być zwiększona przez mikrośrodowisko. Komórki CCR4-dodatnie i -negatywne eksponowano na liczne cytokiny (TNF-α, TGF-β, IFNγ, IL-4 i IL-10), o których wiadomo, że są obecne w mikrośrodowisku szyjki macicy, i dla
których receptory są prawdopodobnie obecne na komórkach nowotworowych. Żadna z nich
nie wpływała na ekspresję CCR4. Jednak, poziomy mRNA CCR4, lecz nie poziomy białka,
były zwiększane przez hodowlę komórek C-41 wspólnie z makrofagami.
[0122] CCR4 i D6 są zlokalizowane na chromosomie 3p blisko miejsca, gdzie jak się uważa,
są zlokalizowane geny hamujące nowotwory krytyczne dla raka szyjki macicy z odnotowa-
16
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
nymi złożonymi aberracjami (utrata heterozygotyczności, homozygotyczność i amplifikacja
genu) [25, 26, 27]. Podczas gdy ani CCR4 ani D6 nie jest bezpośrednio zaangażowany w te
zmiany [26], zmiany genetyczne w pobliżu mogą mieć wpływ na ich regulację.
[0123] Unieśmiertelnione z użyciem EBV komórki B wydzielają CCL22, jak również CCL3
i CCL4 [28]. Stabilna ekspresja onkogenu EBV LMP1 również indukowała CCL17 i CCL22
w linii komórkowej B, a ekspresję CCL17 i CCL22 indukowaną LMP1 regulował NF-kB.
Zasugerowano, że indukcja tych dwóch chemokin przez EBV pomaga złośliwym komórkom
uniknąć nadzoru immunologicznego przez przyciąganie komórek Th2 i Treg. Inne onkogenne zmiany mogą wywołać wytwarzanie CCL17 i CCL22 przez komórki nabłonkowe.
[0124] Twórcy wynalazku wykonali szczegółowe oznaczanie ilościowe dwóch składników
jednojądrzastego nacieku w raku szyjki macicy, specyficznie makrofagów CD68+ i Treg
FoxP3+. Gęstość naciekających komórek CCR4-dodatnich wzrasta w CIN w porównaniu z
normalną szyjką macicy i wzrasta dalej zarówno w SCC i gruczolakorakach. Makrofagi
CD68+ wykazują taki sam wzór i stwierdzono, że były one CCR4-dodatnie. Wzajemny
wpływ między makrofagami i komórkami złośliwymi jest krytyczny we wszystkich stadiach
postępu raka, wpływając na przeżycie komórek złośliwych, wspomagając włączenie angiogenezy, polaryzując leukocyty i wspomagając inwazję komórek złośliwych [29,30,31]. W
rakach szyjki macicy i przełyku, chemokiny CCL17 i CCL22 odgrywają rolę w rekrutacji
makrofagów, podczas gdy w innych rakach, np. raku jajnika, krytyczne są chemokiny, takie
jak CCL2 [32].
[0125] CCL17 i CCL22 są również ważne w rekrutowaniu Treg, których ilość zwiększa się
w sposób równoległy do komórek CD68+ w biopsjach szyjki macicy. Rekrutacja komórek
Treg do zmian przednowotworowych i złośliwych sprzyja uprzywilejowaniu immunologicznemu. Przykładowo w ziarnicy złośliwej, HL, komórki złośliwe są otoczone dużą liczbą
limfocytów CCR4+ FoxP3+ [33]. Komórki te, rekrutowane przez złośliwe komórki HL,
tworzą korzystne środowisko dla komórek złośliwych, do ucieknięcia układowi immunologicznemu gospodarza. Twórcy wynalazku twierdzą, że jest to również przypadek raka szyjki
macicy i przełyku. Zatem nie tylko zmiany w gradientach CCL17 i CLL22 bezpośrednio
pobudzają przeżycie i rozsiew komórek nowotworowych, lecz przyciągają leukocyty, które
mogą również zapewniać czynniki przeżycia dla komórek nowotworowych i przyczyniać się
do uprzywilejowania immunologicznego/immunosupresji, które/która zapobiega skutecznym odpowiedziom gospodarza przeciwko nowotworowi.
[0126] Dane te wykazują, że obecność nabłonkowego CCR4 jest zarówno wysoce czułym i
wysoce specyficznym biomarkerem dla zarówno przednowotworowej, jak i złośliwej neoplazji szyjki macicy. Rola ekspresji CCR4 w postępie raka szyjki macicy jest na razie niejasna, chociaż dane twórców wynalazku sugerują, że CCR4 może zapewniać komórkom
ochronę przed bodźcami apoptotycznymi w środowisku nowotworu, jak również być ważny
dla inwazji błony podstawnej przez komórki nowotworowe. Ze względu na jego wysoką
czułość i selektywność, CCR4 ma potencjał do stosowania go jako biomarker diagnostyczny
dla wszystkich stopni zaawansowania raka szyjki macicy.
[0127] Następnie twórcy wynalazku również badali ekspresję CCR4 w 31 próbkach nowotworów przełyku, innego typu nowotworu, który ma silny związek z zapaleniem. Poprzez
IHC stwierdzono, że CCR4 nie był wykrywalny w jakiejkolwiek normalnej tkance nabłonkowej przełyku, lecz był obecny w komórkach nabłonkowych wszystkich zmian przedinwazyjnych i inwazyjnych. Ze względu na jego wysoką czułość i selektywność, CCR4 ma potencjał do stosowania go jako biomarker diagnostyczny dla wszystkich stadiów raka przełyku.
[0128] Podsumowując, poziom receptora chemokin CCR4 i jego ligandów wzrasta podczas
postępu zezłośliwienia w raku szyjki macicy, przełyku, nerki, mózgu, jajnika lub sutka.
Zmiany w CCR4 i gradientach jego ligandów mają liczne skutki pronowotworowe. Po
pierwsze, stymulacja CCR4 zwiększa wzrost i przeżycie zainicjowanych i inwazyjnych komórek nowotworowych; po drugie, zmiany w gradientach chemokin pomagają w inwazji
17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
błony podstawnej i późniejszym ruchu komórek złośliwych do naczyń krwionośnych lub
układu limfatycznego. Wreszcie, CCL17 i CCL22 przyciągają typy komórek, w tym makrofagi M2 i Treg FoxP3, które pobudzają wzrost nowotworu i pozwalają zainicjowanym komórkom uciec przed nadzorem immunologicznym. CCR4 i jego ligandy mogą być użytecznymi markerami diagnostycznymi i celami terapeutycznymi w neoplazji nabłonkowej.
[0129] Wynalazek częściowo opisano za pomocą doświadczalnej pracy i przykładów, w
których zastosowano następujące materiały i metody:
PRZYKŁADY
Próbki tkanki szyjki macicy i próbki przełyku
[0130] Do badań mRNA, piętnaście biopsji nowotworu od pacjentek z rakiem szyjki macicy
(11 raków płaskokomórkowych, S1-S11 i 4 gruczolakoraki, A1-A4) i 14 próbek nienowotworowej tkanki szyjki macicy (N1-N14) uzyskano podczas operacji i szybko zamrożono w
ciekłym azocie. Diagnozę wykonał oddział patologii Barts and The London NHS Trust.
Próbki od pacjentek podzielono według klasyfikacji FIGO (stopień I, II, III, IV) i biopsje
nowotworu sklasyfikowano według zwiększającego się stopnia atypii jądrowej (1, 2, 3) lub
jako również umiarkowanie lub słabo zróżnicowane.
[0131] Dla immunohistochemii, próbki zatopione w parafinie (n=166) od 150 różnych pacjentów uzyskano z Barts and The London NHS Trust i the Clinical Centre of Serbia, Belgrad. Dostęp do świeżych i zatopionych w parafinie ludzkich próbek spełnił wymagania
Podkomisji do spraw Etyki Badań Urzędu Zdrowia Londynu Wschodniego i City (ang. East
London and City Health Authority Research Ethics Subcommittee) (LREC nr T/02/046).
[0132] Wycięte próbki od trzydziestu jeden pacjentów z pierwotnym rakiem płaskokomórkowym przełyku również włączono do tej pracy. Pacjenci ci byli z obszaru wysokiego ryzyka pod względem raka przełyku w mieście Anyang, prowincji Henan, Chiny. Wszyscy pacjenci otrzymali leczenie chirurgiczne w Oddziale Chirurgii Centralnego Szpitala w Anyang.
Żaden z tych pacjentów nie przeszedł chemioterapii, radioterapii lub terapii immunomodulacyjnej przed operacją. Próbki pobrano z obszarów makroskopowo nowotworowych i odpowiadających im normalnych obszarów od tego samego pacjenta z nowotworem. Tkanki
utrwalono w PBS zawierającym 10% neutralnej buforowanej formaliny.
Ekstrakcja RNA i macierz ochrony RNazy (RPA)
[0133] Biopsje tkanki szyjki macicy zhomogenizowano przy użyciu schłodzonego ciekłym
azotem młynka 6750 (Glen Creston Ltd, Stanmore), a następnie rozpuszczono w Tri Reagent™ (Sigma, Poole, UK). Na wyekstrahowany RNA podziałano 10 jednostkami DNazy
(Pharmacia, St Albans, Wielka Brytania) według instrukcji producenta. RPA przeprowadzono stosując zestawy matryc Riboquant® hCR5 i hCR6 (BD Pharmingen, Oxford, Wielka
Brytania) i [α32P] UTP (Amersham International plc, Aylesbury, Wielka Brytania). Fragmenty chronione przed RNazą przepuszczono przez żel akrylamidowo-mocznikowy do sekwencjonowania (BioRad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, Wielka Brytania), zaadsorbowano na bibule filtracyjnej i wysuszono w próżni. Przeprowadzono autoradiografię stosując kliszę Kodak® Biomax® MS z intensyfikującym ekranem Transcreen LE (Sigma).
Preparowanie pod mikroskopem i macierz genowa
[0134] Tkanki szyjki macicy zatopione w parafinie wycięto w warunkach wolnych od RNaz
i osadzono na szkiełkach membranowych traktowanych UV PALM® (PALM, Microlaser
Technologies, Niemcy). Następnie odparafinowano je w ksylenie i ponownie nawodniono z
użyciem alkoholu w stopniowo zmienianym stężeniu. Próbki barwiono przez 1 min roztworem hematoksyliny Mayera, odwodniono i suszono na powietrzu przed obróbką. Skrawki
wypreparowano laserowo pod mikroskopem według protokołu producenta. W skrócie, interesujące obszary wypreparowano laserowo pod mikroskopem i katapultowano do nakrywki
mikroprobówki zawierającej bufor kinazy białkowej (PK). W każdej sesji wychwycono w
przybliżeniu 500 - 5000 komórek. Wypreparowane laserowo pod mikroskopem komórki
rozpuszczono w 100 µl buforu PK zmieszanego z 5 µl PK. Całkowite RNA następnie wyekstrahowano stosując zestaw do izolacji RNA z bloków parafinowych (1902, Ambion,
18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
USA) według instrukcji producenta. cDNA zamplifikowano, jak opisano powyżej i analizowano stosując wykonane na zamówienie mikroprzepływowe karty macierzy genowych (PE
Applied Biosystems) według instrukcji producenta.
[0135] Profil ekspresji genów dla poszczególnych genów w siedmiu próbkach nowotworu
szyjki macicy porównano z pięcioma próbkami normalnej szyjki macicy. Poziomy ekspresji
genów w próbkach normalnych komórek nabłonkowych lub zrębu zastosowano jako linię
podstawową wynoszącą „1” i porównano ze średnią wartością odpowiednio nowotworowych komórek nabłonkowych lub nowotworowych komórek zrębu. Wypreparowane laserowo pod mikroskopem próbki nowotworowe obejmowały jedną próbkę ze stopnia 1A2 i 2B
i pięć ze stopnia 1B1.
Immunohistochemia
[0136] Skrawki zatopione w parafinie (4 µm) wybarwiono w kierunku CCR4, CCL17 i
CCL22. W skrócie, skrawki odparafinowano w ksylenie i odwodniono stosując gradient etanolu. Po przemyciu PBS, antygen eksponowano stosując roztwór do odzyskiwania celu (ang.
Target Retrieval Solution) (S1700, DAKO) w 95°C przez 20 min lub roztwór odsłaniający
antygen (ang. Antigen Unmasking Solution) (H-3300, Vector) przez 9 min w urządzeniu
mikrofalowym. Skrawki blokowano normalną króliczą lub kozią surowicą przez 30 min i
inkubowano przez noc w 4°C z pierwszorzędowym przeciwciałem: CCR4 (1:300, ab1669,
AbCam, Cambridge), CCL17 (1:50, ab9816-50, AbCam, Cambridge) i CCL22 (1:20, 500P107, Peprotech). Po inkubacji z biotynylowanym drugorzędowym przeciwciałem (antykozia lub anty-królicza IgG, 1:200, Vector) przez 30 min w temperaturze pokojowej, antygeny uwidoczniono z użyciem 3,3'-diaminobenzydyny (DAB; Sigma). Preparaty następnie
wybarwiono kontrastowo hematoksyliną, odwodniono i osadzonr Pominięcie pierwszorzędowego przeciwciała zastosowano jako kontrolę negatywną. Aby sprawdzić specyficzność
przeciwciała CCR4, niektóre komórki CCR4-ujemne transfekowano cDNA tego receptora
chemokin. Przeciwciało CCR4 wykryło białko powierzchniowe tylko na skutecznie transfekowanych komórkach.
Barwienie podwójne, CD68, FoxP3, SR-A: Sposoby oceny i kategorie
[0137] Do oceny ekspresji CCR4, CCL17 i CCL22 na niezłośliwych i złośliwych komórkach nabłonkowych, każdą próbkę oceniono półilościowo w następującym systemie ocen: 0
(brak dodatniej ekspresji białka), +1 (<25% średnio przekroju poprzecznego ma dodatnią
ekspresję), +2 (26-50%), +3 (51-75%), +4 (>76%). Intensywność komórek dodatnich analizowano następująco: 0 (brak ekspresji), 1 (łagodna ekspresja), 2 (umiarkowana ekspresja), 3
(silna ekspresja). Ocena ekspresji CCR4, CCL17 i CCL22 w zrębie guza (komórki naciekające wewnątrz guza) i inwazyjnej granicy guza (komórki naciekające w okolicy guza) przeprowadzono przy użyciu metody „średniej kroczącej” [43]. Unikano obszarów martwiczych.
Zliczono sumę 15 pól w dużym powiększeniu (ang. high-power fields - HPF) (powiększenie
x400). Pięć skal ustawiono następująco: 0 = brak ekspresji białka CCR4; +1 = 1-10 CCR4komórek dodatnich na HPF; +2 = 10-20 komórek dodatnich na HPF; +3 (21-30 komórek na
HPF); +4 (>30 komórek). Całkowity wynik barwienia uzyskano przez obliczenie „udział
procentowy” x „intensywność”. Ocenę IHC nowotworu i komórek naciekających przeprowadził dyplomowany patolog (YW).
Hodowla linii komórkowej raka szyjki macicy
[0138] Linię komórkową raka szyjki macicy C-41 (ATCC, Rockville, MD, USA) hodowano
w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FCS. W niektórych doświadczeniach komórki stymulowano 1, 10, 100 lub 1000 ng/ml CCL17 lub CCL22 (PeproTech, Londyn, Wielka Brytania). Proliferację i migrację oceniano stosując sposoby opisane poprzednio [11].
Analiza statystyczna
[0139] Istotność statystyczną oceniono stosując niesparowany test-t z korektą Welcha (Instat
software, San Diego, CA). Wartość P <0,05 uważa się za istotną.
Doświadczenie 1 - Macierz ochrony przed rybonukleazą dla receptorów chemokin
[0140] Testy ochrony przed rybonukleazą (RPA) zastosowano do badania przesiewowego
19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
13 mRNA receptora chemokin w świeżo zamrożonych biopsjach ludzkiej tkanki szyjki macicy. Jak można zobaczyć z podsumowującego wykresu na Figurze 1A, szereg mRNA receptora chemokin stwierdzono w ekstraktach tkanki szyjki macicy z pewnymi dyskretnymi
różnicami między biopsjami nienowotworowymi i złośliwymi. Szczególnie interesujący jest
receptor CCR4, który jest obecny w złośliwej szyjce macicy, lecz nie w ekstraktach z nienowotworowych biopsji szyjki macicy (Figura 1B).
[0141] Ponieważ ekspresję receptora chemokin badano na ekstraktach całej tkanki zawierających mieszaną populację komórek zrębu i komórek nabłonkowych, następnie badano źródło komórkowe mRNA CCR4. mRNA wyekstrahowano z wypreparowanych laserowo pod
mikroskopem obszarów komórek zrębu i nabłonkowych z normalnych i złośliwych biopsji
szyjki macicy i półilościową RT-PCR w czasie rzeczywistym zastosowano do analizy ekspresji CCR4 z 18S rRNA, jako kontrolą. Jak przedstawiono na Figurze 1C, ekspresja mRNA
CCR4 była zwiększona w obszarach zrębu z tkanek złośliwych, gdy porównano je z ich nienowotworowymi odpowiednikami. Dodatkowo i nieoczekiwanie, ekspresja mRNA CCR4
również była zwiększona w ekstraktach z obszarów złośliwych komórek nabłonkowych w
porównaniu z normalnym nabłonkiem.
[0142] Aby zbadać dalej te obserwacje dotyczące mRNA CCR4, wybarwiono grupę biopsji
w kierunku CCR4 stosując immunohistochemię, IHC. Oceniono ekspresję białka CCR4 w
166 próbkach tkanek szyjki macicy zatopionych w parafinie od 150 różnych pacjentek: nienowotworowych, n=23, CIN I, n=30; CIN II, n=17; CIN III, n=16; SCC, n=45; nawrotowego nowotworu , n=15; przerzutu do węzła chłonnego (przerzut LN), n=10; gruczolakoraka,
n=10. Zarówno leukocyty jak i komórki nabłonkowe eksprymowały białko CCR4. Aby
oznaczyć ilościowo wyniki, wynik IHC obliczono przez pomnożenie „dodatniości” i „intensywności” (patrz opis sposobów i Figury 8 i 9 po więcej szczegółów).
Doświadczenie 2 - białko CCR4 stwierdzono na naciekających leukocytach w ludzkich biopsjach szyjki macicy.
[0143] Jak przedstawiono na Figurze 2 (A-C), leukocyty w obszarach zrębu biopsji barwiły
się dodatnio w kierunku CCR4. Wynik IHC dla dodatniości CCR4 w obszarach zrębu podsumowano na Figurze 3A (białe słupki). Tkanki nienowotworowe były ujemne pod względem leukocytów CCR4 (Figury 2A, 3A). Więcej komórek zrębu eksprymujących CCR4
występowało w próbkach CIN (Figura 2B, 3A) i ich ilość zwiększała się dalej w próbkach
inwazyjnych nowotworów szyjki macicy (Figura 2C, 3A). Intensywność ekspresji CCR4 na
naciekających leukocytach również wzrastała z postępem zezłośliwienia. W tkankach nienowotworowych była ona łagodna; intensywność była umiarkowana do silnej w CIN i gruczolakorakach, i intensywność była silna w inwazyjnych SCC, nowotworach nawrotowych i
przerzutach do węzłów chłonnych (Figura 8).
[0144] Zrąb składa się z różnych typów komórek i badania przeprowadzano, aby upewnić
się, które z naciekających komórek przyczyniały się ekspresji CCR4. Ponieważ makrofagi i
komórki Treg eksprymują CCR4, zbadano ekspresję białka CCR4 w tych dwóch typach komórek i również określono liczbę makrofagów CD68+ i zliczono komórki Treg FoxP3+ w
biopsjach tkanki.
Doświadczenie 3 - liczba makrofagów i komórek Treg CCR4-dodatnich zwiększa się z postępem zezłośliwienia.
[0145] Liczba makrofagów CD68+ i Treg FoxP3+ zwiększała się z postępem zezłośliwienia
szyjki macicy. Jak przedstawiono na Figurze 2D-I występowało niewiele komórek CD68 i
FoxP3 w biopsjach normalnej szyjki macicy, lecz liczby zwiększały się w CIN i oba typy
komórek były widoczne w nowotworach inwazyjnych.
[0146] Liczby komórek CD68+ i FoxP3+ następnie określono w odpowiednio 122 i 33 biopsjach. Jak przedstawiono na Figurze 3B nastąpił istotny (p<0,001) wzrost w komórkach
CD68+ w zmianach CIN w porównaniu z normalną szyjką macicy. Liczba 13 komórek
CD68+ dalej wzrastała w SCC, gruczolakoraku, nawrotowych nowotworach i przerzutach
do węzłów chłonnych (P<0,001, a dla przerzutów LN P <0,05, w porównaniu z normalną
20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
szyjką macicy). Podobny wzrost liczby komórek FoxP3+ występował z postępem zezłośliwienia w SCC, gruczolakorakach i przerzutach do węzłów chłonnych, przy czym wszystkie
wykazywały istotne zwiększenie w nacieku FoxP3+ w porównaniu z normalną szyjką macicy (p<0,01).
[0147] Aby zbadać fenotyp naciekających komórek eksprymujących CCR4, dokonano oceny ekspresji CCR4 na powierzchni komórek dla makrofagów i Treg, stosując podwójne
barwienie immunohistochemiczne w kierunku CD68 i FoxP3. Potwierdza to, że komórki
CD68+ i FoxP3+ również eksprymują białko CCR4 (dane nieprzedstawione). Podzbiór 33
zatopionych w parafinie tkanek również wybarwiono pod względem białka receptora zmiatacza A (SR-A) (nienowotworowe=10, CIN=10, SCC=10, gruczolakorak=3). SR-A jest
markerem powierzchni komórkowej dla M2 alternatywnie aktywowanych makrofagów [12].
SR-A nie można było wykryć na komórkach zrębu w zmianach nienowotworowych lecz w
CIN i nowotworze inwazyjnym, część komórek CD68+ eksprymowała SR-A (dane nieprzedstawione).
[0148] Badania te pokazują, po pierwsze, że postęp zezłośliwienia szyjki macicy jest związany ze wzrostem liczby makrofagów CD68+ i komórek Treg FoxP3+. Komórki te mogą
zapewnić pronowotworowe czynniki wzrostu dla komórek złośliwych i również wspomagać
tworzenie immunosupresyjnego mikrośrodowiska, które pomoże komórkom transformowanym uniknąć nadzoru immunologicznego. Po drugie, wyniki te wykazywały, że pierwotna
obserwacja zwiększenia ilości mRNA CCR4 w złośliwym raku szyjki macicy w porównaniu
z normalną tkanką była spowodowana, co najmniej częściowo, zwiększonym naciekaniem
leukocytów eksprymujących CCR4, w tym makrofagów i komórek Treg.
[0149] Jednak, wynik preparowania laserowego pod mikroskopem wykazał, że ilość mRNA
CCR4 zwiększała się w obszarach nabłonkowych nowotworów i przy ocenie białka CCR4
na naciekających leukocytach, było jasne, że receptor chemokin był również obecny na niektórych komórkach nabłonkowych (patrz Figura 2B i C). Było to nieoczekiwane i uzasadniało dalsze badania.
Doświadczenie 4 - Komórki nabłonkowe w biopsjach szyjki macicy również eksprymują
CCR4
[0150] W nienowotworowych biopsjach szyjki macicy, normalne komórki nabłonkowe nie
eksprymowały CCR4 (Figura 2A). Jednak komórki nabłonkowe w ponad 90% przypadków
CIN eksprymowały CCR4 (Figura 2B i 2E). 96% próbek SCC zawierało komórki nabłonkowe CCR4-dodatnie (Figura 2C i 2F) i komórki nabłonkowe 90% próbek gruczolakoraka
były dodatnie pod względem CCR4 (Figura 2G). Złośliwe komórki nabłonkowe we wszystkich nawrotowych nowotworach i przerzutach do węzłów chłonnych eksprymowały białko
CCR4. Wszystkie szczegóły wyników IHC dla białka CCR4 na komórkach nabłonkowych
przedstawiono na figurze 9 i podsumowano na figurze 2D (czarne słupki). Ekspresja CCR4
nie była ograniczona do mniejszości komórek nabłonkowych. Figury 2E-G i 9 przedstawiają, że większość złośliwych komórek nabłonkowych w biopsjach szyjki macicy z CIN i inwazyjnym nowotworem była CCR4-dodatnia.
[0151] Więcej szczegółów dotyczących wyniku IHC dla różnych stopni CIN przedstawiono
na Figurze 2H. Pokazuje to, że nabłonkowa ekspresja CCR4 zasadniczo nie zmieniała się
podczas postępu z CIN I do III, lecz poziomy CCR4 w zrębie wzrastały z CIN I-III.
Doświadczenie 5 - Analiza statystyczna ekspresji CCR4 podczas postępu raka szyjki macicy
[0152] Analiza statystyczna danych na figurach 8 i 9 pokazała, że zmiany CIN wykazywały
znaczące zwiększenie ekspresji białka CCR4 zarówno w przedziałach nabłonkowych
(P=0,0001) jak i zrębu (P=0,0001) w porównaniu z nienowotworowymi tkankami szyjki
macicy. Ekspresja CCR4 w inwazyjnych SCC również istotnie wzrastała zarówno w przedziałach nabłonkowych (P=0,0001) jak i zrębu (P=0,0001) w porównaniu z tkankami nienowotworowymi. Również w próbkach gruczolakoraka, ekspresja CCR4 była zwiększona
15 na komórkach nabłonkowych (P=0,0006) i zrębu (P=0,0050) w porównaniu z nienowotworową tkanką szyjki macicy.
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Doświadczenie 6 - Zmiana poziomów mRNA i białka CCL22 wraz z ekspresją złośliwą
[0153] W normalnych tkankach, CCL22 jest produktem makrofagów, monocytów, komórek
DC, B i T [13, 14]. Występuje również w tkankach nabłonkowych; na przykład nabłonek
jelitowy konstytutywnie wytwarza CCL22, którego ekspresja może być dalej zwiększona
przez cytokiny zapalne, takie jak TNF-α [15]. Wyizolowano mRNA z 14 biopsji normalnej
szyjki macicy, 11 SCC i 4 gruczolakoraków i oceniono poziomy CCL22 przez RT PCR w
czasie rzeczywistym. Jak przedstawiono na Figurze 4A, poziomy mRNA CCL22 były niższe
w tkankach złośliwych w porównaniu z normalnymi biopsjami, lecz nie było to istotne
(P=0,43). W sumie 52 próbki tkanek szyjki macicy zatopionych w parafinie od 50 różnych
pacjentek oceniono pod względem białka CCL22: nienowotworowe, n=16; CIN, n=17; SCC,
n=19. We wszystkich biopsjach szyjki macicy CCL22 wykrywano w komórkach nabłonkowych (Figura 4B-D). Czternaście z 16 normalnych próbek, 15/17 CIN, 14/19 SCC zawierało
CCL22-dodatnie komórki nabłonkowe. Naciekające leukocyty we wszystkich biopsjach
zawierały CCL22 (Figura 4C, D). Wynik IHC dla nabłonka spadał nieznacznie między
zmianami CIN i SCC (Figura 4E, czarne słupki). Jednak, wynik CCL22 dla zrębu zwiększał
się od normalnych do CIN i SCC (Figura 4E, białe słupki).
Doświadczenie 7 - Zmiana poziomów mRNA i białka CCL17 wraz z ekspresją złośliwą
[0154] W normalnych tkankach, CCL17 ulega ekspresji w naczyniowych i limfatycznych
komórkach śródbłonka, lecz także produkują go makrofagi, DC i keratynocyty [16, 17, 55].
Wyizolowano mRNA z 14 biopsji normalnej szyjki macicy, 11 SCC i 4 gruczolakoraków i
oceniono poziomy CCL17 metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym. Jak przedstawiono na
Figurze 5A, poziomy mRNA CCL17 były wyższe w SCC w porównaniu z normalną szyjką
macicy. W sumie 74 próbki tkanek szyjki macicy zatopionych w parafinie od 70 różnych
pacjentek oceniono w kierunku białka CCL17: nienowotworowe, n=21; CIN, n=33; SCC,
n=20. Biopsje normalnej szyjki macicy miały niskie poziomy CCL17 w niewielkiej liczbie
próbek zarówno nabłonka jak i zrębu (Figura 5B). Tylko 2/19 normalnych próbek zawierało
komórki CCL17-dodatnie w nabłonku w porównaniu z 23/33 próbek CIN i 13/20 SCC.
Liczba komórek zrębu, które były CCL17-dodatnie zwiększyła się w CIN (Figura 5C) i SCC
(Figura 5D) w porównaniu z normalnymi próbkami. Sześć z 21 normalnych biopsji zawierało CCL17-dodatnie komórki zrębu w porównaniu z 25/33 CIN i 15/20 SCC. Wynik IHC
CCL17 dla nabłonka i zrębu zwiększył się w CIN i SCC w porównaniu z normalnymi biopsjami (Figura 5E). Gdy analizowano wyniki IHC z poszczególnych biopsji, istniała statystycznie istotna różnica w wyniku IHC CCL17 w zrębie z CIN (P=0,001) i SCC (P=0,002) w
porównaniu z normalnymi biopsjami. Istniała również różnica w wynikach IHC w obszarach
nabłonkowych CIN (P=0,001) i SCC (P=0,009) w porównaniu z normalnymi. Dane te pokazują, że gradienty chemokin zmieniały się z przejściem od neoplazji wewnątrznabłonkowej
do choroby inwazyjnej.
Doświadczenie 8 - CCR4 jest funkcjonalny na komórkach raka szyjki macicy
[0155] Aby zbadać istotność biologiczną ekspresji CCR4 na komórkach raka szyjki macicy,
liczne linie komórkowe raka szyjki macicy (CaSki, Me180, Hela-Ohio, Hela-S3, Siha,
C33A, C41-1) poddano badaniu przesiewowemu w kierunku ekspresji CCR4. Linia komórkowa C-41 eksprymowała CCR4 na powierzchni komórek w sposób konstytutywny (Figura
6A). Stosując analizę FACS wykazano, że komórki C-41 eksprymowały CCR4 na powierzchni komórki. Ta linia komórkowa miała również wewnątrzkomórkowe białko CCL22,
lecz inny ligand CCR4 - CCL17 nie był obecny (Figura 6A). Po stymulacji 100 ng/ml
CCL22, białko CCR4 na powierzchni komórek było internalizowane na komórkach C-41 po
2 godzinach i powróciło na powierzchnię po 3 godzinach (Figura 6B). Po stymulacji 100
ng/ml CCL17, białko CCR4 na powierzchni komórek również było internalizowane na komórkach C-41 po 2 godzinach i powróciło na powierzchnię po 3 godzinach (Figura 6C).
Komórki C-41 wykazywały typową odpowiedź chemotaktyczną o rozkładzie dzwonowym
w kierunku zarówno CCL17 i CCL22 w testach migracji trans-well (Figura 6D). Przy 10
ng/ml CCL17 indukował istotną migrację (P=0,036) i również przy 100 ng/ml i 1000 ng/ml
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(odpowiednio, P=0,0006 i P=0,0004). Podobne wyniki były widoczne dla CCL22 przy 10
ng/ml (P=0,0081), 10 ng/ml (P=0,0009) i przy 1000 ng/ml (P=0,0348).
Komórki C-41 wykazywały zwiększoną proliferację po stymulacji 10 ng/ml (P= 0,017) lub
100 ng/ml (P= 0,044) CCL17. 1 ng/ml CCL22; (P=0,026), 100 ng/ml CCL22 (P= 0,043),
lecz nie 10 ng/ml CCL22 (P=0,195), również stymulowały wzrost komórek C-41 (Figura 5C
i D). CCR4 był zatem funkcjonalny na tej linii komórkowej raka szyjki macicy, sugerując, że
może być on również funkcjonalny in vivo.
Doświadczenie 9 - CCR4 ulega ekspresji na komórkach nabłonkowych i zrębu podczas postępu zezłośliwienia przełyku
[0156] Nie było wiadomo, czy ekspresja CCR4 i zmiany w ligandzie chemokin były specyficzne dla raka szyjki macicy czy były widoczne w jakichkolwiek innych nabłonkowych
stanach złośliwych, które miały związek z zapaleniem. Rak przełyku jest rakiem nabłonkowym, dla którego można łatwo uzyskać przykłady wszystkich etapów postępu nowotworu,
często równocześnie od tego samego pacjenta. Ekspresję CCR4 zbadano w 31 próbkach od
pacjentów z rakiem przełyku. W 27 przypadkach, wszystkie etapy powstawania raka przełyku: normalny, hiperplazja, dysplazja, rak in situ i nowotwór inwazyjny, były obecne w biopsjach od tego samego pacjenta. Cztery z 31 przypadków miały zmiany przedinwazyjne bez
obszarów nowotworu inwazyjnego. Jak przedstawiono na Figurze 7A, nie było wykrywalnej
ekspresji CCR4 w normalnych komórkach nabłonkowych przełyku, poza kilkoma CCR4dodatnimi komórkami w okolicach warstwy podstawnej hiperplastycznego nabłonka (Figura
7B). W 30 z 31 przypadków, białko CCR4 było obecne na komórkach nabłonkowych we
wszystkich stopniach zaawansowania przedinwazyjnych zmian (Figura 7C, D), tak że intensywność i udział procentowy komórek eksprymujących CCR4 w zmianach dysplastycznych
był znacznie wyższy niż w hiperplastycznych komórkach nabłonkowych. Komórki nabłonkowe w raku inwazyjnym były również CCR4-dodatnie (Figura 7H). W niektórych miejscach, występowało nagłe przejście między normalną i nieprawidłową błoną śluzową (Fig.
7C, D). Co jest najbardziej interesujące, w komórkach dysplastycznych występowały wysokie poziomy ekspresji CCR4, lecz komórki w warstwach powierzchniowych i przylegającej
normalnej błonie śluzowej były ujemne. Komórki CCR4-dodatnie były również obecne w
zrębie, przy czym wzór jest taki sam jak w raku szyjki macicy. Jak przedstawiono na Figurze
7E, występowało niewiele komórek CCR4-dodatnich w normalnej warstwie podśluzówkowej; z postępem zezłośliwienia, występowało więcej komórek CCR4-dodatnich naciekających zrąb (Figura 7F-H).
Doświadczenie 10 - CCL17 i CCL22 w biopsjach przełyku
[0157] IHC zastosowano do oceny ekspresji CCL17 i CCL22 w 23 z próbek przełyku, w
których wszystkie etapy powstawania raka były obecne w każdej próbce. CCL17 był na ogół
nieobecny w obu obszarach nabłonkowych i zrębu normalnych tkanek, chociaż występowało
niewiele komórek CCL17-dodatnich w zrębie i niewielkiej liczbie obszarów hiperplastycznych. Liczba próbek kontynuujących CCL17-dodatnie komórki nabłonkowe lub zrębu
zwiększała się w dysplazji i była najwyższa w obszarach inwazyjnych z 10/23 z tych wykazujących pewną CCL17-dodatniość. Szczególnie warto zauważyć silną immunoreaktywność
CCL17 na komórkach nabłonkowych lub naczyniach krwionośnych/limfatycznych w warstwie podśluzówkowej dysplastycznego, lecz nie normalnego nabłonka.
[0158] Podobnie do obserwacji w raku szyjki macicy, poziomy dodatniości zrębu dla CCL22
również zwiększały się z postępem zezłośliwienia. Tylko 1/23 próbki wykazywała CCL22dodatnie komórki w zrębie normalnych obszarów, lecz w obszarach dysplastycznych i obszarach inwazyjnych odpowiednio 20/23 i 18/23 próbek zawierało CCL22-dodatnie komórki
w zrębie. CCL22-Dodatniość komórek zrębu wzrastała ze stopniem dysplazji. Osiem z 23
próbek dysplazji I miało komórki CCL22-dodatnie w zrębie; zwiększyło się to do 19 z 23
próbek dysplazji II i 20/23 próbki dysplazji III. Istniała jedna różnica między nabłonkiem
szyjki macicy i przełyku, polegająca na tym, że CCL22 nie wykryto w normalnym nabłonku,
chociaż doniesiono, że jest obecny w normalnym nabłonku jelitowym [15]. Nabłonkowa
23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
ekspresja CCL22 zwiększała się z postępem zezłośliwienia przełyku; 0/23 próbki było dodatnich w normalnych obszarach, 2/23 hiperplazje, 7/23 dysplazje i 14/23 obszary inwazyjne
zawierały CCL22-dodatnie komórki nabłonkowe. Wreszcie, więcej komórek śródbłonkowych naczyń krwionośnych w zrębie tkanek inwazyjnego nowotworu było dodatnich pod
względem barwienia CCL22 w porównaniu z nabłonkiem normalnym i dysplastycznym.
Doświadczenie 11 - Wyniki badania przesiewowego pod względem ekspresji CCR4 w szerszym zakresie nowotworów
[0159] Zastosowanie biblioteki nowotworowego cDNA (Cancer Research Wielka Brytania)
zawierającej cDNA wytworzone z RNA wyizolowanego z 5-10 próbek nowotworów i 2-5
próbek normalnych dla 11 różnych typów nowotworów: płuca, okrężnicy, pęcherza, żołądka,
trzustki, skóry, sutka, mózgu, przełyku, jajnika i gruczołu krokowego. Poziomy ekspresji
mRNA CCR4 zmierzono z zastosowaniem ilościowej RT-PCR w czasie rzeczywistym.
[0160] Poziomy mRNA CCR4 były znacznie podwyższone w rakach szyjki macicy, przełyku, nerki, mózgu, sutka i jajnika.
Doświadczenie 12 - Analiza ekspresji CCR4 w liniach komórkowych raka szyjki macicy i
nerki
[0161] Figura 11 przedstawia wyniki analizy metodą skanowania komórek aktywowanego
przez fluorescencję (ang. Fluorescence Activated Cell Scanning - FACS) na liniach komórkowych raka szyjki macicy (C41, C33A) i nerki z zastosowaniem przeciwciała anty-CCR4,
do wykrywania ekspresji CCR4. Wszystkie linie komórkowe eksprymowały CCR4. Linie
przerywane na Figurze 11 przestawiają dane dla kontrolnego przeciwciała o dopasowanym
fenotypie.
Doświadczenie 13 - Wpływ powszechnych cytokin na ekspresję CCR4 przez komórki nowotworowe
Najpowszechniejszymi cytokinami obecnymi w nowotworze są IL-10, TGF-β, FGF, TNF-α.
[0162] Linię komórkową raka szyjki macicy C-41 stymulowano w hodowli różnymi cytokinami (IL-10, TNF-α, TGF-β, FGF; 20 ng/ml) przez 24 h. Następnie określono ekspresję
CCR4 za pomocą analizy FACS. Jak przedstawiono na Figurze 12, ekspresja CCR4 była
zwiększona w odniesieniu do udziału procentowego komórek dodatnich po stymulacji IL-10,
TGF-β i FGF (niebieska linia), w porównaniu z komórkami niestymulowanymi (czarna linia). Linia przerywana pokazuje dane dla kontroli izotypowej. Pogrubiona linia pokazuje
ekspresję CCR4 po stymulacji. Wyniki wskazują, że mikrośrodowisko nowotworu może
indukować ekspresję CCR4 na komórkach nowotworowych.
Odniesienia
[0163]
1. Allen, S.J., Crown, S.E. i Handel, T.M. 2006. Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism. Annu Rev Immunol 25:787-820.
2. Balkwill, F.R. 2004. Cancer and the chemokine network. Nature Reviews Cancer
4:540-550.
3. Muller, A., Homey, B., Soto, H., Ge, N., Catron, D., Buchanan, M.E., McClanahan,
T., Murphy, E., Yuan, W., Wagner, S.N., i in. 2001. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410:50-56.
4. Scotton, C.J., Wilson, J.L., Milliken, D., Stamp, G. i Balkwill, F.R. 2001. Epithelial
cancer cell migration: a role for chemokine receptors? Cancer Res 61:4961-4965.
5. Zeelenberg, I.S., Ruuls-Van Stalle, L. i Roos, E. 2003. The chemokine receptor
CXCR4 is required for outgrowth of colon carcinoma micrometastases. Cancer Res
63:3833-3839.
6. Balkwill, F. 2004. The significance of cancer cell expression of CXCR4. Seminars in
Cancer Biology 14:171-179.
7. Burger, J.A., i Kipps, T.J. 2006. CXCR4: a key receptor in the crosstalk between tumor cells and their microenvironment. Blood 107:1761-1767.
8. Zlotnik, A. 2006. Chemokines and cancer. Int J Cancer 119:2026-2029.
24
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
9. Meijer, J., Zeelenberg, I.S., Sipos, B. i Roos, E. 2006. The CXCR5 chemokine receptor is expressed by carcinoma cells and promotes growth of colon carcinoma in the liver.
Cancer Res 66:9576-9582.
10. Letsch, A., Keilholz, U., Schadendorf, D., G., A., Asemissen, A.M., Thiel, E. i Scheibenbogen, C. 2004. Functional CCR9 expression is associated with small intestinal metastasis. J Invest Dermatol 122:685-690.
11. Scotton, C.J., Wilson, J.L., Scott, K., Stamp, G., Wilbanks, G.D., Fricker, S., Bridger, G. i Balkwill, F.R. 2002. Multiple actions of the chemokine CXCL12 on epithelial
tumor cells in human ovarian cancer. Cancer Research 62:5930-5938.
12. Gordon, S. 2003. Alternative activation of macrophages. Nature Reviews Immunol
3:23-35.
13. Godiska, R., Chantry, D., Raport, C.J., Sozzani, S., Allavena, P., Leviten, D., Mantovani, A. i Gray, P.W. 1997. Human macrophage-derived chemokine (MDC), a novel
chemoattractant for monocytes, monocyte-derived dendritic cells, and natural killer
cells. J Exp Med 185:1595-1604.
14. Mantovani, A., Gray, P.A., Van Damme, J. i Sozzani, S. 2000. Macrophage-derived
chemokine (MDC). J Leukoc Biol 68:400-404.
15. Berin, M.C., Dwinell, M.B., Eckmann, L. i Kagnoff, M.F. 2001. Production of
MDC/CCL22 by human intestinal epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280:G1217-G1226.
16. Imai, K., Kobayashi, M., Wang, J., Shinobu, N., Yoshida, H., Hamada, J., Shindo,
M., Higashino, F., Tanaka, J., Asaka, M., i in. 1999. Selective secretion of chemoattractants for haemopoietic progenitor cells by bone marrow endothelial cells: a possible role
in homing of haemopoietic progenitor cells to bone marrow. Br J Haematol 106:905911.
17. Sallusto, F., Palermo, B., Lenig, D., Miettinen, M., Matikainen, S., Julkunen, I., Forster, R., Burgstahler, R., Lipp, M. i Lanzavecchia, A. 1999. Distinct patterns and kinetics of chemokine production regulate dendritic cell function. Eur J Immunol 29:16171625.
18. Fra, A.M., Locati, M., Otero, K., Sironi, M., Signorelli, P., Massardi, M.L., Gobbi,
M., Vecchi, A., Sozzani, S. i Mantovani, A. 2003. Cutting Edge: Scavenging of inflammatory CC chemokines by the promiscuous putatively silent chemokine receptor D6. J
Immunol 170:2279-2282.
19. Graham, G.J. i McKimmie, C.S. 2006. Chemokine scavenging by D6: a movable feast? Trends in Immunol 27:381-386.
20. Woerner, B.M., Warrington, N.M., Kung, A.L., Perry, A. i Rubin, J.B. 2005. Widespread CXCR4 activation in astrocytomas revealed by phospho-CXCR4-specific antibodies. Cancer Res 65:11392-11399.
21. Salvucci, O., Bouchard, A., Baccarelli, A., Deschenes, J., Sauter, G., Simon, R.,
Bianchi, R. i Basik, M. 2006. The role of CXCR4 receptor expression in breast cancer: a
large tissue microarray study. Br Ca Res & Treat 97:275-283.
22. Schmid, B.C., Rudas, M., Rezniczek, G.A., Leodolter, S. i Zeillinger, R. 2004.
CXCR4 is expressed in ductal carcinoma in situ of the breast and in atypical ductal hyperplasia. Br Ca Res & Treat 84:247-250.
23. Pils, D., Pinter, A., Reibenwein, J., Alfanz, A., Horak, P., Schmid, B.C., Hefler, L.,
Horvat, R., Reinthaller, A., Zeillinger, R., i in. 2007. In ovarian cancer the prognostic influence of HER2/neu is not dependent on the CXCR4/SDF-1 signalling pathway. Br J
Cancer 96:485-491.
24. Borrello, M.G., Alberti, L., Fischer, A., Degl'innocenti, D., Ferrario, C., Gariboldi,
M., Marchesi, F., Allavena, P., Greco, A., Collini, P., i in. 2005. Induction of a proinflammatory program in normal human thyrocytes by the RET/PTC1 oncogene. PNAS
102:14825-14830.
25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
25. Braga, E., Senchenko, V., Bazov, I., Loginov, W., Liu, J., Ermilova, V., Kuzubskaya, T., Garkavtseva, R., Mazurenko, N., Kisseljov, F.L., i in. 2002. Critical tumorsuppressor gene regions on chromosome 3p in major human epithelial malignancies: allelotyping and quantitative real-time pcr. Int J Cancer 100:534-541.
26. Senchenko, V., Liu, J., Braga, E., Mazurenko, N., Loginov, W., Seryogin, Y., Bazov, I., Protopopov, A., Kisseljov, F.L., Kashuba, V., i in. 2003. Deletion mapping using
quantitative real-time PCR identifies two distinct 3-21.3 regions affected in most cervical carcinomas. Oncogene 22:2984-2992.
27. Acevedo, C.M., Henriquez, M., Emmert-Buck, M.R. i Chuaqui, R.F. 2002. Loss of
heterozygosity on chromosome arms 3p and 6q in microdissected 33 adenocarcinomas
of the uterine cervix and adenocarcinoma in situ. Cancer 94:793-802.
28. Nakayama, T., Hieshima, K., Nagakubo, D., Sato, E., Kakayama, M., Kawa, K. i
Yoshie, O. 2004. Selective induction of Th2-attracting chemokines CCL17 and CCL22
in human B cells by latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus. J Virol 78:16651674.
29. Balkwill, F., Charles, K.A. i Mantovani, A. 2005. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-217.
30. Hagemann, T., Wilson, J., Burke, F., Kulbe, H., Li, N.F., Pluddemann, A., Charles,
K., Gordon, S. i Balkwill, F.R. 2006. Ovarian cancer cells polarize macrophages toward
a tumor-associated phenotype. J Immunol 176:5023-5032.
31. Condeelis, J. i Pollard, J.W. 2006. Macrophages: obligate partners for tumor cell migration, invasion, and metastasis. Cell 124:263-266.
32. Negus, R.P.M., Stamp, G.W.H., Relf, M.G., Burke, F., Malik, S.T.A., Bernasconi,
S., Allavena, P., Sozzani, S., Mantovani, A. i Balkwill, F.R. 1995. The detection and localization of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) in human ovarian cancer. J
Clin Invest 95:2391-2396.
33. Ishida, T., Ishii, T., Inagaki, A., Yano, H., Komatsu, H., Iida, S., Inagaki, H. i Ueda,
R. 2006. Specific recruitment of CC chemokine receptor 4-positive regulatory T cells in
Hodgkin lymphoma fosters immune privilege. Cancer Res 66:5716-5722.
34. Nakamura, E.S., Koizumi, K., Kobayashi, R., Saitoh, Y., Arita, Y., Nakayama, T.,
Sakurai, H., Yoshie, O. i Saiki, I. 2006. RANKL-induced CCL22/macrophage-derived
chemokine produced from osteoclasts potentially promotes the bone metastasis of lung
cancer expressing its receptor CCR4. Clin Exp Metastasis, 5 lipca
35. Ishida, T., Inagaki, H., Utsunomiya, A., Takatsuka, Y., Komatsu, H., Iida, S., Takeuchi, G., Eimoto, T., Nakamura, S. i Ueda, R. 2004. CXC chemokine receptor 3 and
CC chemokine receptor 4 expression in T-cell and NK-cell lymphomas with special reference to clinicopathological significance for peripheral T-cell lymphoma, unspecified.
Clin Cancer Res 10:5494-5500.
36. Ishida, T. i Ueda, R. 2006. CCR4 as a novel molecular target for immunotherapy of
cancer. Cancer Sci 97:1139-1146.
37. Ishida, T., Iida, S., Akatsuka, Y., Ishii, T., Miyazaki, M., Komatsu, H., Inagaki, H.,
Okada, N., Fujita, T., Shitara, K., i in. 2004. The CC chemokine receptor 4 as a novel
specific molecular target for immunotherapy in adult Tcell leukemia/lymphoma. Clin
Cancer Res 10:7529-7539.
38. Kleeff J, Kusama T, Rossi DL, Ishiwata T, Maruyama H, Friess H, Büchler MW,
Zlotnik A, Korc M. Detection and localization of Mip-3alpha/LARC/Exodus, a macrophage proinflammatory chemokine, and its CCR6 receptor in human pancreatic cancer. Int J Cancer. 17 maja 1999;81(4):650-7.
39. Kimsey TF, Campbell AS, Albo D, Wilson M, Wang TN. Co-localization of macrophage inflammatory protein-3alpha (Mip-3alpha) and its receptor, CCR6, promotes
pancreatic cancer cell invasion. Cancer J. listopad-grudzień 2004;10(6):374-80.
26
5
10
15
20
25
30
40. Jöhrer K, Zelle-Rieser C, Perathoner A, Moser P, Hager M, Ramoner R, Gander H,
Höltl L, Bartsch G, Greil R, Thurnher M. Up-regulation of functional chemokine receptor CCR3 in human renal cell carcinoma. Clin Cancer Res. 1 kwietnia 2005; 1(7):245965.
41. Ferenczi, K., Fuhlbrigge, R.C., Pinkus, J.L., Pinkus, G.S. i Kupper, T.S. Increased
CCR4 expression in cutaneous T cell lymphoma. J Invest Dermatol 119, 1405-1410
(2002).
42. Baatar, D., Olkhanud, P., Newton, D., Sumitomo, K. i Biragyn, A. CCR4-expressing
T cell tumors can be specifically controlled via delivery of toxins to chemokine receptors. J Immunol 179, 1996-2004 (2007).
43. Nagtegaal ID, Marijnen CA, Kranenbarg EK, Mulder-Stapel A, Hermans J, van de
Velde CJ, van Krieken JH. Local and distant recurrences in rectal cancer patients are
predicted by the nonspecific immune response; specific immune response has only a
systemic effect--a histopathological and immunohistochemical study. BMC ital Cancer.
2001;1:7. Epub 16 lipca 2001.
44. Libura J, Drukala J, Majka M, Tomescu O, Navenot JM, Kucia M, Marquez L, Peiper SC, Barr FG, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak MZ. „CXCR4-SDF-1 signalling is
active in rhabdomyosarcoma cells and regulates locomotion, chemotaxis, and adhesion.”
Blood. 1 października 2002;100(7):2597-606.
45. Bange, J; Zwick E, Ullrich A. (2001). „Molecular targets for breast cancer therapy
and prevention”. Nature Medicine 7: 548 - 552
[46] Ménard, S; Pupa SM, Campiglio M, Tagliabue E (2003). „Biologic and therapeutic
role of HER2 in cancer”. Oncogene 22: 6570 - 6578
47. Kute, T; Lack CM, Willingham M, Bishwokama B, Williams H, Barrett K, Mitchell
T, Vaughn JP (2004). „Development of herceptin resistance in breast cancer cells”. Cytometry 57A: 86-93.
48. Vestergaard C, Bang K, Gesser B, Yoneyama H, Matsushima K, Larsen CG. A Th2
chemokine, TARC, produced by keratinocytes may recruit CLA+CCR4+ lymphocytes
into lesional atopic dermatitis skin. J Invest Dermatol. październik 2000;115(4):640-6.
WYKAZ SEKWENCJI
[0164]
<110> Cancer Research Technology Ltd
<120> Marker nowotworowy i marker terapeutyczny
<130> 68.111623/07
<150> EP08806315.1
<151> 2008-09-18
<150> PCT/GB2008/003160
<151> 2008-09-18
<150> GB 0718167.0
<151> 2007-09-18
<160> 1
<170> PatentIn wersja 3.5
<210> 1
<211> 1083
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
27
Zastrzeżenia patentowe
5
10
15
20
1. Sposób przewidywania tego, czy guz lity lub nowotwór niehematologiczny, który eksprymuje receptor chemokin CCR4 będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe,
obejmujący etap pomiaru ilości i/lub aktywność liganda CCR4, CCL17 w próbce
wspomnianego nowotworu pobranej od pacjenta, porównania ilości i/lub aktywności
CCL17 we wspomnianej próbce nowotworu z referencyjną ilością i/lub poziomem aktywności CCL17 zmierzonymi w, lub wstępnie określonymi na podstawie, jednej lub
większej liczbie(-y) próbek nienowotworowych i przewidywania, czy wspomniany nowotwór będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym zwiększona ilość
i/lub aktywność CCL17 w porównaniu z referencyjną ilością i/lub aktywnością wskazuje na nowotwór, który będzie podatny na leczenie przeciwnowotworowe oraz przy czym
wspomniany nowotwór jest wybrany spośród raka szyjki macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu, trzustki, szyi, nerki, wątroby, sutka, pęcherza, żołądka,
jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego.
2. Sposób identyfikowania nowotworu złośliwego u pacjenta, obejmujący etap pomiaru
ilości i/lub aktywność liganda CCR4, CCL17 w próbce nowotworu pobranej od pacjenta, porównania ilości i/lub aktywności CCL17 we wspomnianej próbce nowotworu z referencyjną ilością i/lub poziomem aktywności CCL17 zmierzonymi w, lub wstępnie
określonymi na podstawie, jednej lub większej liczbie(-y) próbek nienowotworowych i
postawienie diagnozy, czy zwiększona ilość i/lub aktywność CCL17 w porównaniu z referencyjną ilością i/lub aktywnością wskazuje na nowotwór złośliwy, i przy czym
wspomniany nowotwór eksprymuje receptor chemokin CCR4 i jest wybrany spośród
raka szyjki macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu, trzustki, szyi,
28
3.
5
4.
10
5.
15
6.
20
25
7.
30
8.
9.
nerki, wątroby, sutka, pęcherza, żołądka, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego.
Sposób jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 1 albo 2, w którym jedną lub co najmniej jedną
próbkę nienowotworową pobiera się od pacjenta lub w którym jedną lub większą liczbę
próbek nienowotworowych pobiera się od innego pacjenta.
Sposób określenia czy guz lity lub nowotwór niehematologiczny, który eksprymuje
CCR4 odpowiedział na leczenie przeciwnowotworowe, przy czym pacjent otrzymał leczenie przeciwnowotworowe i pomiary ilości i/lub aktywności CCL17 wykonuje się
przed i po rozpoczęciu leczenia i uzyskaną informację stosuje się do określenia czy guz lity lub nowotwór z komórek niehematologicznych pacjenta odpowiedział na leczenie
przeciwnowotworowe, i przy czym wspomniany nowotwór jest wybrany spośród raka
szyjki macicy, przełyku, oskrzeli, nosogardła, krtani, skóry, mózgu, trzustki, szyi, nerki,
wątroby, sutka, pęcherza, żołądka, jajnika, komórek płciowych i gruczołu krokowego.
Sposób jak zastrzeżono w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 albo 4, w którym leczenie przeciwnowotworowe obejmuje środek, który moduluje lub hamuje ekspresję lub aktywność
CCR4.
Sposób jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 5, w którym środkiem, który moduluje lub hamuje
ekspresję lub aktywność CCR4 jest
(i) przeciwciało, które wiąże się z CCR4; ewentualnie przeciwciało anty-CCR4 jak
ujawniono w którymkolwiek z WO0041724, WO0164754, WO05035582,
WO03018635, WO05053741, WO0042074; lub
(ii) przeciwciało, które wiąże się z ligandami CCR4, CCL22 lub CCL17; ewentualnie
przeciwciała anty-CCL17 lub anty-CCL22 jak ujawniono w WO99/15666, lub Ishida,
T., i in (2004) Clin Cancer Res 10:7529-7539; lub
(iii) antagonista CCR4; ewentualnie antagonista CCR4 jak ujawniono w którymkolwiek
z WO04007472, WO05023771, WO02094264, WO0230358, WO0230357,
WO051236976,
WO05085212,
WO05082865,
WO04108717,
EP1633729,
WO03014153.
Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-6, w którym wspomnianą ilość CCL17
mierzy się z użyciem przeciwciała reaktywnego względem CCL17.
Sposób według któregokolwiek z zastrzeżeń 1-7, w którym ilość i/lub aktywność CCL22
określa się również w próbce wspomnianego nowotworu.
Sposób według zastrzeżenia 8, w którym wspomnianą ilość CCL22 mierzy się z użyciem
przeciwciała reaktywnego względem CCL22.
Uprawniony: Cancer Research Technology Limited
Pełnomocnik:
mgr inż. Agnieszka Marszałek
Rzecznik patentowy
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42