Justyna Krystyna Ciepły Charakterystyka lekoopornych szczepów
advertisement
Warszawski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny Oddział Analityki Medycznej Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624 Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV‐1 izolowanych w Polsce w 2008 roku Praca magisterska wykonana w Zakładzie Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego pod kierownictwem naukowym prof. dr hab. Stefana Tyskiego Opiekunowie pracy: Dr n. farm. Bohdan Starościak (Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego) Dr n. med. Janusz J. Stańczak (Pracownia Diagnostyki Molekularnej Wojewódzkiego Szpitala Zakaźnego w Warszawie) Wirus HIV‐1 • Zidentyfikowany w 1983 roku przez L. Montagnier, następnie w 1984 roku przez R. Gallo • Rodzina Retroviridae, grupa Len.virus complex • Ma kształt kulisty, średnicę 100 nm • Genom to dwie cząsteczki jednoniciowego +ssRNA • Geny gag (białka strukturalne), pol (białka enzymatyczne), env (białka otoczki) oraz tat, rev, nef, vif, vpu, vpr (regulatorowe) • Enzymy: 1 cząsteczka proteazy, 1 integrazy i 2 odwrotnej transkryptazy Wirus HIV‐1 • Do wniknięcia do komórki wymaga cząsteczki CD4+ (receptor) oraz CCR5 lub CXCR4 (koreceptory) • Szczepy M‐tropowe korzystające z CCR5 • Szczepy T‐tropowe korzystające z CXCR4 Wirus HIV‐1 – główne grupy genetyczne • M (major) Grupa M to 9 subtypów: A – D, F – H, J i K • O (outlier) • N (non‐M, non‐O) • P ( wyizolowany w 2009 roku od kobiety z Kamerunu mieszkającej we Francji) • Występują formy zrekombinowane – CRF (Circulajng Recombinant Forms) – 48 form np. CRF01_AE, CRF02_AG, CRF05_DF, CRF07_BC Leki antyretrowirusowe • Nukleozydowe (NtRTI) i nukleotydowe (NRTI) inhibitory odwrotnej transkryptazy • Nienukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NNRTI) • Inhibitory proteazy (PI) • Inhibitory fuzji i wejścia (EI) • Inhibitory integrazy (II) • Nowe preparaty – inhibitory dojrzewania (III faza badań klinicznych) Metody oznaczania lekooporności • Fenotypowanie (w tym również fenotypowanie wirtualne) • Genotypowanie – Hybrydyzacja – Sekwencjonowanie Czynniki wpływające na powstanie lekooporności wirusa HIV‐1 • Wysokie tempo replikacji (dziennie syntetyzowanych jest 1010 – 1011 nowych wirionów) • Niedokładność wirusowej odwrotnej transkryptazy • 1 – 5x109 wirionów syntetyzowanych w ciągu 24 h zawiera mutacje w regionach kodujących odwrotną transkryptazę i proteazę • Niewystarczająca współpraca pacjenta z lekarzem • Akumulacja mutantów w czasie zakażenia Oznaczanie lekooporności – (zalecenia EACS) • Pacjenci nowozdiagnozowani • Pacjenci rozpoczynający leczenie ‐ o ile nie byli testowani wcześniej. Należy użyć najwcześniej pobraną próbkę krwi przed rozpoczęciem terapii. • Pacjenci z niepowodzeniem leczenia (wirusologicznym) • Kobiety ciężarne przed rozpoczęciem terapii (dla efektywnej terapii i ochrony dziecka przed zakażeniem) • Profilaktyka poekspozycyjna Cel pracy • wykrycie mutacji odpowiedzialnych za oporność wirusa HIV‐1 na leki • ocena częstości występowania w Polsce wariantów genetycznych HIV‐1 o obniżonej podatności na leki • wykrycie przyczyn niepowodzeń terapeutycznych wśród pacjentów leczonych, • umożliwienie prawidłowego doboru następnego schematu leczenia (nowych, aktywnych wobec mutantów leków) • ocena występowania subtypów HIV‐1 w Polsce • ocena właściwości/przydatności metod sekwencjonowania ViroSeq i Trugene Przygotowanie materiału • Zbadano 285 próbek – w tym 91 od chorych leczonych, 194 od nieleczonych • Materiałem wyjściowym do badań było osocze • Przed przystąpieniem do sekwencjonowania materiał przygotowywano w następujących etapach: a) Izolacja RNA wirusa HIV‐1 b) Odwrotna transkrypcja c) Reakcja PCR d) Oczyszczanie DNA na kolumienkach e) Elektroforeza DNA w żelu agarozowym f) PCR sekwencyjny g) Oczyszczanie DNA Metody sekwencjonowania • ViroSeq HIV‐1 Genotyping System v2.6 (Abbos, Niemcy) ‐ sekwencjonowany jest region kodujący proteazę wirusa (kodony 1 – 99) oraz 2/3 regionu kodującego odwrotną transkryptazę (kodony 1 – 335) Metody sekwencjonowania • Test Trugene HIV‐1 Genotyping Assay (Siemens, Niemcy) ‐ określana jest sekwencja regionu proteazy wirusa (kodony 1 – 99) oraz odwrotnej transkryptazy wirusa (kodony 40 – 247) Przydatność metod stosowanych do oznaczania lekooporności wirusa HIV‐1 Metoda ViroSeq Zautomatyzowana Metoda Trugene Półautomatyczna Wykrywa 67 mutacji Wykrywa 72 mutacje Etapy dodatkowe Brak etapów dodatkowych w przygotowaniu materiału w przygotowaniu materiału Konieczna interwencja eksperta, nie wykrywa insercji i delecji Łatwiej poszerzyć oprogramowanie o wykrycie nowych mutacji Trudniej poszerzyć oprogramowanie o wykrycie nowych mutacji Wynik sekwencjonowania Pik zielony – adenina (A), czerwony – tymina(T), niebieski – cytozyna (C), czarny – guanina (G) Subtypy HIV‐1 zidentyfikowane w Polsce w 2008roku 1,4% 0,4% 3,9% 0,7% 1,8% 91,9% B C D G CRF01_AE CRF02_AG Wyniki Najczęściej wykrywane mutacje Leki, na które wystąpiła największa oporność Chorzy leczeni Chorzy nieleczeni NRTI i NtRTI: M184V PI: L10I, L90M, L76LV NNRTI:K103N, Y181C, E138A NRTI i NtRTI: M41L, T215S i M184V PI: L10I, L10IL NNRTI: G190A NNRTI: newirapina, delawirdyna, efawirenz PI: nelfinavir, sakwinawir, indinawir NRTI i NtRTI: lamiwudyna, emtrycytabina PI: nelfinawir NRTI i NtRTI: azydotymidyna, stawudyna NNRTI: newirapina Wyniki – pacjenci leczeni • Wśród 91 pacjentów leczonych szczepy lekooporne HIV‐1 stwierdzono u 35 (38,5%) Częstość występowania wariantów opornych HIV‐1 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% PI NRTI i NtRTI Grupy leków NNRTI Wyniki – pacjenci nieleczeni • Wśród 194 pacjentów szczepy oporne wirusa HIV‐1 stwierdzono u 15 (7,7%) Częstość występowania wariantów opornych HIV‐1 5,0% 4,5% 4,0% 3,5% 3,0% 2,5% 2,0% 1,5% 1,0% 0,5% 0,0% PI NRTI i NtRTI Grupy leków NNRTI Częstość występowania wariantów opornych HIV‐1 wśród pacjentów nieleczonych w Polsce 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 28,7% 10,0% 14,1% 5,0% 5,8% 7,7% 3,9% 0,0% 2001‐2002 2002‐2005 2006 2007 2008 Częstość występowania wariantów opornych HIV‐1 wśród pacjentów leczonych w Polsce 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 75,1% 76,7% 30,0% 52,6% 43,1% 20,0% 38,5% 10,0% 0,0% 2000‐2001 2002‐2005 2006 2007 2008 Podsumowanie • Chorzy leczeni – częstość oporności wirusa HIV‐1 na leki – 38,5% • Chorzy nieleczeni – częstość oporności wirusa HIV‐1 na leki – 7,7% • Subtypy HIV‐1 w Polsce w 2008 roku: B(91,9%), C, D, G, CRF01_AE, CRF02_AG • Metoda Trugene mniej złożona pod względem przygotowania materiału, metoda ViroSeq bardziej złożona Dziękuję za uwagę
