Zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny ekspresji białka

Maria Szczotka
ZASTOSOWANIE CYTOMETRII PRZEPŁYWOWEJ
DO OCENY EKSPRESJI BIAŁKA gp51
WIRUSA ENZOOTYCZNEJ BIAŁACZKI BYDŁA (BLV)
W LIMFOCYTACH ZAKAŻONYCH ZWIERZĄT
ROZPRAWA HABILITACYJNA
RECENZENCI:
prof. dr hab. Krzysztof
Kostro z Katedry Epizootiologii i Kliniki Chorób
Zakaźnych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Akademii Rolniczej w Lublinie
prof. dr hab. Jacek Roszkowski, emerytowany profesor z Państwowego Instytutu
Weterynaryjnego-Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach
prof. dr hab. Janusz A. Madej z Katedry Anatomii Patologicznej, Fizjopatologii i
Weterynarii Sądowej Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego
we Wrocławiu
prof. dr hab. Józef Szarek
Weterynaryjnej
Wydziału
Mazurskiego w Olsztynie
z Zespołu Weterynarii Sądowej i Administracji
Medycyny
Weterynaryjnej
Uniwersytetu
Warmińsko-
STRESZCZENIE
Enzootyczna białaczka bydła jest chorobą zakaźną, którą wywołuje
limfotropowy wirus białaczki bydła – Bovine Leukemia Virus (BLV), należący do
rodziny Retroviridae, rodzaj Deltaretrovirus. Po wniknięciu wirusa do organizmu na
powierzchni
limfocytów
następuje
ekspresja
białek
wirusowych,
głównie
glikoproteiny gp51. Przeciwko niej wytwarzane są przeciwciała wykrywane jako
pierwsze w badaniach serologicznych. Czasami zakażenie wirusem ma charakter
latentny, co oznacza, że wirus jest obecny w zakażonym organizmie, ale nie
wywołuje widocznych objawów klinicznych. Stosowane metody serologiczne nie
wykrywają wszystkich zakażonych zwierząt, gdyż w początkowym etapie zakażenia
poziom przeciwciał jest niski, często poniżej granicy wykrywalności użytego
systemu badawczego. U niektórych zwierząt układ immunologiczny słabo reaguje na
zakażenie i poziom wytwarzanych przeciwciał przeciw BLV jest zbyt niski.
Zwierzęta zakażone, ale seronegatywne, stanowią rezerwuar wirusa i będąc siewcami
wirusa stanowią zagrożenie dla innych zwierząt.
Podjęte badania miały na celu analizę metodą cytometrii przepływowej
obecności gp51 w limfocytach krwi i komórkach izolowanych z narządów ze
zmianami o charakterze proliferacyjnym owiec doświadczalnie zakażonych BLV
oraz w komórkach krwi i mleka bydła białaczkowego. Określono również charakter
limfocytozy oraz rodzaj komórek obecnych w guzach nowotworowych.
Obecność gp51 w limfocytach stwierdzono w limfocytach krwi już po 14
dniach od zakażenia. Zaobserwowano wzrost liczby limfocytów z ekspresją gp51
wraz z progresją choroby. Szczególnie silnie wyrażoną ekspresję stwierdzono w
nowotworowych zmianach w węzłach chłonnych i narządach wewnętrznych.
Wykazano także obecność gp51 w komórkach krwi i mleka u bydła, jednak ekspresja
gp51
w
mleku
była
znacznie
słabiej
wyrażona.
Wysokie
limfocytozy
charakteryzowały się obecnością młodocianych form limfocytów z markerem CD19+
oraz IgM+CD19+, co potwierdzało B-komórkowy charakter limfocytoz. W guzach
białaczkowych także stwierdzono obecność limfocytów B. Stwierdzono, że u
zwierząt z chłoniakiem odsetek limfocytów CD4+ zmniejszał się, zwiększał się
natomiast odsetek limfocytów CD8+, co powodowało obniżenie wartości liczbowej
stosunku CD4:CD8. Świadczyło to o progresji choroby i o niekorzystnym rokowaniu,
analogicznie jak w przypadku chłoniaków u ludzi.
Metodą immunofluorescencji z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych
anty–gp51 wykazano obecność gp51 w limfocytach krwi i mleka bydła oraz
limfocytach i guzach nowotworowych u owiec.
Badania testem PCR i nested-PCR wykazały obecność prowirusowego DNA
we krwi i narządach wewnętrznych, a zastosowanie PCR in situ pozwoliło na
stwierdzenie produktów PCR w komórkach narządów wewnętrznych ze zmianami
guzowatymi. U zwierząt zakażonych zaobserwowano wyższy odsetek komórek
wykazujących obecność cykliny PCNA oraz przeciwdziałającego apoptozie białka
bcl-2.
Zastosowana metoda cytometrii przepływowej pozwoliła na wczesne wykrycie
ekspresji gp51 w limfocytach krwi owiec, zanim w surowicy pojawiły się
przeciwciała wykrywalne testem ELISA. Umożliwiło to poznanie dynamiki rozwoju
zakażenia owiec BLV, monitorowanie wpływu wirusa na układ immunologiczny
oraz określenie rodzaju limfocytów związanych z limfocytozami i zmianami o
charakterze nowotworowym w narządach wewnętrznych.
SUMMARY
Enzootic bovine leukemia is an enzootic disease caused by a lymphotropic
Bovine Leukemia Virus (BLV) that belongs to Retroviridae family, genus
Deltaretroviridae. In infected organism viral proteins, mostly glycoprotein gp51, are
expressed on the surface of lymphocytes. The first antibodies that can be detected in
serological tests are directed against gp51. Sometimes BLV infection is latent and no
clinical signs are observed. Commonly used serological methods do not detect all the
infected animals because at the first stage of infection the level of antibodies is low,
in many cases below the detection limit. In some animals immunological system
reacts weakly after infection and the level of BLV antibodies is low. The infected
seronegative animals are the reservoir of the virus and can be a hazard for other
animals.
The aim of the study was to analyse the presence of gp51 in blood lymphocytes
and cells isolated from organs with lymphoproliferative changes using flow
cytometry method. The material was obtained from sheep experimentally infected
with BLV, and blood and milk lymphocytes from BLV-positive cattle. The character
of lymphocytosis and the type of cells present in neoplasmatic tumours were also
determined.
The presence of gp51 in lymphocytes was detected as early as 14 days after the
infection. The increase in the number of lymphocytes with gp51 expression was
observed in paralel with the progression of the disease. The significantly high
expression was observed in neoplasmatic lymph nodes and inner organs. The
presence of gp51 was also detected in blood and in milk lymphocytes of cattle, but
the expression in milk was weaker. The high lymphocytoses were characterised by
the presence of immature forms of lymphocytes with CD19+ and IgM+CD19+
markers which confirmed the B-cells type of lymphocytoses. The B cells were
observed in leukemic tumours. It was also noted that in animals with lymphoma the
percentage of CD4+ decreased and the percentage of CD8+ lymhocytes increased
which decreased the ratio of CD4 to CD8. It proved the progress of the disease and
negative prognosis, like in cases of human lymphomas.
The presence of gp51 in lymphocytes of blood and milk as well as in
lymphocytes
and
tumours
of
neoplasmatic
sheep
was
detected
using
immunofluorescence method with monoclonal gp51 antibodies.
With the use of PCR and nested-PCR the presence of proviral DNA in blood
and internal organs was detected. The use of in situ PCR enabled to detect PCR
products in cells of internal organs with tumour lesions. In infected animals higher
percentage of cells with the presence of PCNA cycline and bcl-2 protein protecting
against apoptosis were identified
The flow cytometry method used in the study enabled to detect gp51
expression in sheep blood lymphocytes at the early stages of the infection, before it
was possible to detect the antibodies in serum using the ELISA. The study enabled to
understand the dynamics of BLV infection in sheep and the modulation of
immunological system by the virus. It was also possible to evaluate the type of
lymphocytes related to lymphocytoses and neoplasmatic lesions in the internal
organs.