Zastosowanie mikroskopii kąta Brewstera w badaniu oddziaływań
advertisement
Panel Chemia Środowiska Pracownia Specjalizacyjna Ćwiczenie 9 06.05.2016 (p.239, WCh ul. Ingardena 3) Zastosowanie mikroskopii kąta Brewstera w badaniu oddziaływań wybranych toksykantów z lipidowymi monowarstwami na granicy faz roztwór wodny/powietrze. dr Michał Flasiński e-mail: [email protected] 1. Zagadnienia teoretyczne Monowarstwy Langmuira, klasyfikacja stanów monowarstw, surfaktanty - struktura chemiczna i właściwości, podstawowe klasy lipidów błonowych, właściwości i funkcje lipidów błon komórkowych, modelowe błony biologiczne, współczynnik załamania światła, kąt Brewstera 2. Wstęp Mikroskopia kąta Brewstera (BAM) stanowi obok mikroskopii fluorescencyjnej podstawową technikę mikroskopową stosowaną w celu bezpośredniej wizualizacji monowarstw substancji amfifilowych na granicy faz woda/powietrze. Historia techniki BAM sięga początku lat dziewięćdziesiątych dwudziestego wieku, kiedy to pierwsze tego typu urządzenie zostało skonstruowane w Laboratorium Fizyki Statystycznej Uniwersytetu w Paryżu (Rys. 1) [1]. Rys. 1. Pierwszy mikroskop kąta Brewstera. I - źródło światła (laser argonowy); Obj - układ optyczny źródła światła, F - światłowód; C - kamera; Oc - okular; Mo - silnik; Trough - waga Langmuira [1]. W przeciwieństwie do mikroskopii fluorescencyjnej obserwacja domen powierzchniowych przy pomocy mikroskopu kąta Brewstera nie wymaga stosowania amfifilowych barwników fluorescencyjnych, a tym samym ogranicza wpływ dodatkowej substancji na zachowanie fazowe monowarstwy. Z tego względu technika BAM jest obecnie rutynowo stosowana w celu uzupełnienia charakterystyki monowarstw Langmuira prowadzonej w oparciu o rejestrowane izotermy ciśnienia powierzchniowego (π) w funkcji średniej powierzchni w przeliczeniu na pojedynczą cząsteczkę w monowarstwie (A). Mikroskopia BAM dostarcza informacji na temat przemian fazowych zachodzących w trakcie kompresji warstwy powierzchniowej, a także podstawowych cech domen, takich jak wielkość, kształt oraz ich gęstości powierzchniowej. Przy pomocy mikroskopii kąta Brewstera możliwa jest również detekcja separacji fazowej oraz obserwowanie struktur trójwymiarowych związanych z załamaniem (kolapsem) monowarstwy. Prowadząc analizę wewnętrznych tekstur domen skondensowanych można również wnioskować na temat orientacji tworzących je cząsteczek względem normalnej do granicy międzyfazowej. Rys. 2. Nowoczesny mikroskop BAM firmy Accurion [2]. 3. Podstawy metody Mikroskopia kąta Brewstera jest jedną z podstawowych bezinwazyjnych technik stosowanych w badaniu monowarstw utworzonych na powierzchni subfazy wodnej przez nierozpuszczalne w wodzie substancje amfifilowe. Technika ta opiera się na zmianie współczynnika załamania światła na granicy faz woda (roztwór wodny)/powietrze w wyniku utworzenia na niej monowarstwy Langmuira. a. Zasada działania mikroskopu BAM Intensywność światła odbitego od oświetlanej powierzchni zależy od dwóch podstawowych czynników: kąta padania światła oraz jego polaryzacji. W przypadku światła spolaryzowanego w płaszczyźnie padania (polaryzacja p) istnieje kąt, zwany kątem Brewstera, dla którego promieniowanie odbite od ostrej (tzw. fresnelowskiej) granicy międzyfazowej jest całkowicie wygaszane (Rys. 3). Warto wspomnieć, że sytuacja ta odnosi się do idealnie ostrej, pozbawionej szorstkości granicy pomiędzy dwoma przezroczystymi ośrodkami, pomiędzy którymi współczynnik załamania światła zmienia się skokowo. Dla rzeczywistych granic międzyfazowych, z uwagi na ich szorstkość, wywołaną przede wszystkim fluktuacjami termicznymi, współczynnik załamania światła nie zmienia się skokowo, z tego względu intensywność promieniowania odbitego nie jest wygaszona całkowicie, lecz osiąga minimum (1,2·10-8) [1]. Rys. 3. Współczynnik odbicia (R) od ostrej granicy międzyfazowej w funkcji kąta padania dla światła o polaryzacji p (w płaszczyźnie padania) oraz s (prostopadle do płaszczyzny padania) [1] Utworzenie monowarstwy surfaktantu na powierzchni wody powoduje wprowadzenie dodatkowej cienkiej warstwy o współczynniku załamania światła innym niż dla powietrza i wody, co powoduje zwiększenie intensywności promieniowania odbitego w wyniku niewielkiej zmiany wartości kąta Brewstera. Na przykład utworzenie na granicy faz woda/powietrze monowarstwy o grubości 10 Å i współczynniku załamania światła 1,4, skutkuje około 35-krotnym zwiększeniem współczynnika odbicia. Intensywność promieniowania odbitego jest zatem silnie zależna od właściwości granicy międzyfazowej. W obecności monowarstwy zależy ona przede wszystkim od jej gęstości, grubości oraz anizotropii, dlatego współistnienie na granicy międzyfazowej domen faz różniących się tymi właściwościami może zostać zaobserwowane mikroskopem BAM. Dodatkowe użycie analizatora umożliwia określenie polaryzacji promieniowania odbitego, dostarczając informacji na temat anizotropii optycznej monowarstwy, a tym samym orientacji cząsteczek względem normalnej do granicy międzyfazowej [3]. Rys. 4. Względna zmiana współczynnika odbicia w wyniku utworzenia monowarstwy na granicy faz woda/powietrze [4]. Rys 4. przedstawia względną zmianę współczynnika odbicia związaną z utworzeniem monowarstwy, w funkcji kąta padania światła. Na rysunku wykreślono wartość zmiany współczynnika odbicia podzieloną przez wartość współczynnika odbicia dla granicy fazowej niepokrytej monowarstwą (∆R/R). Rys. 5. Schemat działania mikroskopu BAM. Na Rys. 5 przedstawiono schemat obrazujący zasadę działania mikroskopu BAM wraz z wyszczególnieniem podstawowych elementów optycznych urządzenia. Wartość kąta Brewstera dla dwóch przezroczystych ośrodków o znanych współczynnikach załamania światła n1 i n2 można obliczyć posługując się wzorem: tgθ B = n2 . Dla granicy faz n1 powietrze (n1=1) / woda (n2=1,33) wartość kąta Brewstera wynosi w przybliżeniu 53°. W przypadku granicy międzyfazowej pokrytej monowarstwą promieniowanie odbite przechodzące przez analizator można zarejestrować posługując się czułą kamerą CCD. Jako źródło światła w mikroskopie BAM stosowany jest laser (zazwyczaj światło czerwone lub w starszych modelach zielone), zapewniający wysoką intensywność promieniowania padającego, co w związku z niskim współczynnikiem odbicia powierzchni jest bardzo ważne. b. Anizotropia optyczna w obrazach BAM Obecność tekstur wewnętrznych przejawiających się niejednolitym kontrastem w obrazach zarejestrowanych techniką BAM związane jest ze zjawiskiem anizotropii optycznej, które występuje w przypadku domen odpowiadających fazom monowarstwy o relatywnie wysokiej kondensacji (Rys. 6) [5]. W takim przypadku, w przeciwieństwie do światła padającego, promieniowanie odbite nie jest już spolaryzowane w płaszczyźnie padania. Rys. 6. Struktury wewnętrzne w obrębie domen fazy LC [6]. Najczęściej zjawisko to związane jest z niejednorodnym azymutem kąta odchylenia cząsteczki od normalnej do granicy międzyfazowej (w przypadku faz utworzonych z cząsteczek pochylonych, Rys. 7) lub z deformacją dwuwymiarowej sieci krystalicznej (w przypadku faz złożonych z cząsteczek zorientowanych prostopadle do granicy międzyfazowej). Drugi z powyższych przypadków, który odznacza się niższym kontrastem domen anizotropowych jest często związany z obecnością na powierzchni faz typu 'harringbone', w których krótkie osie prostopadle zorientowanych cząsteczek o konformacji all-trans hydrofobowego łańcucha tworzą ten charakterystyczny wzór ułożenia na powierzchni (Rys. 8). Rys. 7. Schemat odchylenia cząsteczki od normalnej do granicy międzyfazowej (t - kąt odchylenia, ϕ - azymut odchylenia) oraz schemat rozmieszczenia cząsteczek różniących się azymutem odchylenia w obrębie domeny [3]. Rys. 8. Schemat ułożenia typu 'herringbone' cząsteczek w monowarstwie [7]. W przypadku faz charakteryzujących się brakiem odchylenia cząsteczek od orientacji prostopadłej oraz heksagonalną symetrią komórki elementarnej obserwowany obraz przejawia jednolity kontrast. W takim przypadku swoboda rotacji cząsteczki wokół jej długiej osi sprawia, że anizotropia nie jest obserwowana. c. Przykłady zastosowania mikroskopii BAM • Określanie nie stanu monowarstwy Rys. 9. Struktury przypominające 'dwuwymiarową pianę', charakterystyczne dla monowarstwy w stanie ciekłym rozprężonym (lewe zdjęcie) oraz rozgałęzione struktury fazy ciekłej skondensowanej (prawe zdjęcie). • Obserwacja struktur trójwymiarowych - np. w trakcie kolapsu monowarstwy Rys. 10. Struktury fazy trójwymiarowej charakteryzujące się wysokim współczynnikiem odbicia światła. Uwidaczniają się najczęściej w trakcie załamania (kolapsu) monowarstwy i w zależności od jego mechanizmu przyjmują rozmaite struktury (np. białe pasy lub drobne, jaskrawe punkty). • Detekcja przejść fazowych w obrębie monowarstwy oraz obserwacja zmian wielkości i kształtu domen fazy skondensowanej Rys. 11. Ewolucja kształtu, wielkości i gęstości powierzchniowej jasnych, nieregularnych domen fazy ciekłej skondensowanej wanej (LC) pozostającej w równowadze z ciemniejszą fazą rozrzedzoną (np. fazą ciekłą rozprężoną, LE lub gazową, G). Powyższa sekwencja struktur typowa dla przejścia fazowego LE ->> LC. Fazę LC charakteryzuje duża różnorodność kształtu domen - od eliptycznych, aż po dendrytyczne. • Badanie separacji fazowej Rys. 12. Współistnienie fazy ciekłej skondensowanej (lewa strona zdjęcia) i trójwymiarowej fazy krystalicznej (jaskrawe domeny z prawej strony). Obraz może świadczyć o separacji fazowej w obrębie monowarstwy dwu- lub wieloskładnikowej o ograniczonej mieszalności komponentów. Jeden ze składników wyodrębnia się w postaci jaskrawych struktur trójwymiarowych. • Badanie organizacji cząsteczek w obrębie domen skondensowanych Rys. 13. Anizotropowe domeny fazy skondensowanej. 4. Literatura 1. Meunier, J. Why a Brewster angle microscope? Colloids Surf. A 2000, 2000 171, 33-40. 2. Dostępne na: www.accurion.com 3. Henon, S.; Meunier, J. Phase transitions in Gibbs films: Star textural defects in tilted mesophases. J. Chem. Phys. 1993, 98, 9148 - 9154. 4. Feder, A. Optical Studies of Monolayers at the Air/Water Interface. Interface Doctoral Thesis 1997, Harvard University. University 5. Roldán-Carmona, C.; Giner-Casares, Giner J. J.; Pérez-Morales, Morales, M.; Martín-Romero, Martín M. T.; Camacho, L. Revisiting the Brewster Angle Microscopy: The relevance of the polar headgroup. Adv. Colloid Interfac. 2012, 173, 12-22. 6. Albalat, R.; Claret, J.; Ignés-Mullol, Ignés J.; Sagués, F.; Morán, n, C.; Pérez, L.; Clapés, P.; Pinazo, A. Langmuir Monolayers of Diacyl Glycerol Amino AcidAcid-Based Surfactants. Effect of the Substitution Pattern of the Glycerol Backbone. Langmuir 2003, 19, 10878-10884. 7. Kaganer, V. M.; Möhwald, H.; Dutta, Dutta, P. Structure and phase transitions in Langmuir monolayers. Rev. Mod. Phys. 1999, 71, 779-819. 5. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie bezpośredniej wizualizacji monowarstw lipidowych utworzonych na granicy faz roztwór wodny/powietrze przy zastosowaniu mikroskopu kąta Brewstera. Obserwacja domen powierzchniowych utworzonych na powierzchni wodnych roztworów wybranych toksykantów oraz dla porównania na powierzchni ultraczystej wody ma na celu analizę wpływu czynników zanieczyszczających środowisko na morfologię monowarstw badanych lipidów błonowych. 6. Aparatura i stosowane odczynniki • Waga Langmuira: KSV (Helsinki, Finlandia) model 2000, dwubarierkowa o całkowitej powierzchni 700 cm2. Jako sensor ciśnienia powierzchniowego zastosowano płytkę Wilhelmy'ego wykonaną z bibuły filtracyjnej. • Mikroskop kąta Brewstera: ultraBAM, Accurion (Getynga, Niemcy). W urządzeniu zastosowano laser o mocy 50 mW emitujący światło o polaryzacji równoległej (p) i długości fali 658 nm. • Mikrostrzykawki: firmy Hamilton o pojemności 250 µl • Badane lipidy: kwas stearynowy, kardiolipina, DPPC • Wybrane toksykanty: jony Cd(II), wybrany regulator wzrostu roślin stosowany jako herbicyd (np. kwas indolilo-3-octowy, kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy) • Stosowane rozpuszczalniki: chloroform o czystości spektroskopowej 99,9% stabilizowany etanolem (Sigma-Aldrich), metanol czda. o czystości 99% (Avantor), chloroform czda. o czystości 99% (Avantor), ultraczysta woda o oporności ≥18,2 MΩ·cm produkowana przez system Milli-Q. 7. Wykonanie ćwiczenia • Przygotowanie wagi Langmuira do pomiaru - dokładne wyczyszczenie teflonowych powierzchni wanienki oraz ruchomych barierek przy pomocy wacików nasączonych chloroformem, a następnie dwukrotne przemycie wodą ultraczystą. • Wypełnienie wagi Langmuira subfazą na którą zostanie naniesiona monowarstwa (w zależności od pomiaru: wodą ultraczystą lub uprzednio sporządzonym wodnym roztworem toksykanta o znanym stężeniu). • Kalibracja mikroskopu względem oczyszczonej powierzchni subfazy - dostosowanie parametrów ekspozycji i wzmocnienia obrazu. • Utworzenie monowarstwy badanego lipidu na powierzchni subfazy wodnej. W tym celu, na powierzchnię subfazy nanosi się za pomocą mikrostrzykawki roztwór lipidu sporządzony w lotnym, niemieszającym się z wodą rozpuszczalniku organicznym (w praktyce najczęściej stosuje się mieszaninę chloroform/metanol 9/1). Przed rozpoczęciem pomiaru konieczne jest odczekanie 5 minut, celem odparowania rozpuszczalnika. • Pomiar rozpoczyna włączenie symetrycznej kompresji monowarstwy na powierzchni subfazy wodnej, w trakcie której rejestruje się izotermę ciśnienia powierzchniowego (π) w funkcji średniej powierzchni przypadającej na cząsteczkę w monowarstwie (A). Obserwację ewolucji struktur powierzchniowych w czasie pomiaru prowadzi się na monitorze komputera za pomocą sterującego mikroskopem oprogramowania. Program umożliwia zarejestrowanie obrazów morfologii warstwy powierzchniowej na dowolnym etapie pomiaru. Rejestrując zdjęcie należy pamiętać o zanotowaniu parametrów odpowiadających etapowi kompresji monowarstwy, tj. powierzchni i/lub ciśnienia powierzchniowego. W trakcie pomiaru należy pamiętać o regulacji ostrości obrazu oraz o zastosowaniu korekty tła. 8. Sposób opracowania wyników • Izotermy ciśnienia powierzchniowego (π) w funkcji średniej powierzchni (A) przypadającej na cząsteczkę w monowarstwie. Używając programy do obróbki danych umożliwiającego import plików ASCI (np. Origin lub Excel) należy opracować wykresy izoterm π - A dla badanych monowarstw lipidowych. • Moduły ściśliwości monowarstw. Na podstawie zarejestrowanych izoterm π - A przeprowadzić obliczenia modułów ściśliwości według wzoru: Cs-1 =-A(dπ/dA), a wyniki obliczeń wykreślić w funkcji ciśnienia powierzchniowego. Na podstawie maksymalnych wartości Cs-1(π) dokonać klasyfikacji stanu monowarstwy w oparciu o poniższą tabelę. Wartość modułu ściśliwości [mN/m] 0 - 12,5 >12,5 - 100 >100 - 250 ≥250 • Stan monowarstwy Gazowy (G) Ciekły rozprężony (LE) Ciekły skondensowany (LC) Stały (S) Obrazy BAM. Pomniejszone i w razie konieczności przycięte zdjęcia zestawić wraz z informacją o ciśnieniu powierzchniowym i powierzchni/cząsteczkę, przy jakiej zostały zarejestrowane obrazy.
