Aktywacja p53, a odpowiedź immunologiczna

Stymulacja genów odporności
nieswoistej (innate immunity) w trakcie
synergistycznej aktywacji p53.
Marek Rusin
Odpowiedz na patogeny (wirusy, bakterie i
organizmy eukariotyczne)
1.
Nieswoista – pierwsza linia obrony, nie jest
uzależniona od swoistego rozpoznania patogenów
przez przeciwciała lub receptory limfocytów. Nie
zostawia pamięci immunologicznej.
2.
Swoista – uzależniona od klonalnej selekcji
limfocytów (T i B), może zostawiać pamięć
immunologiczną.
IFN-α
IFN-β
IFN-ε
IFN-κ
IFN-ω
IL-28A
IL-28B
IL-29
Interferonstimulated
gene
factor 3
Interferon
regulatory
factor 9
Interferon-stimulated genes
IFN-γ
Pattern recognition receptors (PRRs) and patogenassociated molecular patterns (PAMPs)
1.
2.
3.
4.
5.
RIG-I like receptors – rozpoznają cytozolowe dsRNA oraz
5’pppRNA.
AIM2-like receptor (ALRs) – rozpoznają cytozolowe DNA.
Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs)
– rozpoznają cytozolowe cząsteczki produkowane przez bakterie
(flagellina, lipopolisacharydy, peptydoglikany, toksyny).
OAS – oligoadenylate synthetase – rozpoznaje obce RNA i
syntetyzuje 2’-5’ oligoadenylates, które z kolei aktywują latentną
RNAzęL, która bez wybiórczości trawi komórkowe i obce RNA, co
z kolei jest rozpoznawane jako PAMP i powoduje wzmocnienie
odpowiedzi komórkowej.
Aktywacja kinazy PKR prowadzi do powstrzymania translacji oraz
do degradacji IκB.
Pattern recognition receptors (PRRs) and patogen-associated
molecular patterns (PAMPs)
1.
2.
Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) – PAMP sensor produkujący cGAMP,
który to związek aktywuje białko zwane STING (stimulator of interferon
genes). Białko jest zlokalizowane w na ER w pobliżu mitochondriów.
W regionie komórki bogatym w STING w zewnętrznej błonie
mitochondialnej jest zlokalizowane białko MAVS (mitochondrial antiviral
signaling protein)
cGAMP
2’-5’ oligoadenylan
W komórkach A549 mimo silnej fosforylacji seryny 46 w
warunkach traktowania aktynomycyną D i nutliną-3a nie
dochodzi do aktywacji kaspazy 3.
A549 30h
CPT
+ +
+ +
Act D
Nutlin-3a
p53
p53-Ser46
p21
Caspase-3 active
HSC70
Metodyka badań
CPT
Kon
ActD
ActD+Nut
Nut
30 h
Białko
RNA
Białko
RNA
Białko
RNA
Białko
RNA
Białko
RNA
Next Generation Sequencing, Illumina Technology, GATC Biotech, Germany
1. 30 milionów 50 bp zmapowanych odczytów na próbkę
2. Tabela FPKM (fragments per kilobase per million reads)
3. Tabela fold-change (Kon vs Exp, Exp vs Exp), znaczenie stat. (p, q)
Traktowanie komórek A549 actynomycyną D i nutliną-3a
przez 30 godzin powoduje znamienną statystycznie zmianę
ekspresji ok. 3000 genów.
1x powtórzenie biologiczne
3x powtórzenie biologiczne
KEGG pathways (ActD+Nut)
Term
Genes
Fold enr.
P-value
hsa04115:p53 signaling
pathway
ZMAT3, SFN, RRM2B, PMAIP1, CCNG1, SESN2, CCNG2,
SESN1, PPM1D, TP53I3, CDKN1A, i in.
6.44
7.89E-11
hsa05205:Proteoglycans in
cancer
PTPN6, HRAS, MRAS, IGF2, MAPK11, i in.
2.26
8.70E-04
hsa05164:Influenza A
RNASEL, TNFRSF10C, HSPA6, PIK3R3, MX1, CASP1,
PIK3R2 i in.
2.23
0.002
hsa04068:FoxO signaling
pathway
HRAS, SGK2, TGFBR1, i in.
2.25
0.008
hsa04921:Oxytocin signaling
pathway
HRAS, PTGS2, PRKAB2, i in.
2.05
0.014
hsa05162:Measles
TNFRSF10A, TNFRSF10C, i in.
2.11
0.019
hsa04210:Apoptosis
TNFRSF10A, CASP6, i in.
2.78
0.023
hsa00564:Glycerophospholipid
metabolism
DGKA, GPD1L, i in.
2.27
0.030
hsa04070:Phosphatidylinositol
signaling system
DGKA, INPP1, i in.
2.20
0.036
GO Term Biological Process
Fold enr.
P-value
Apoptotic process
2.10
6.43E-07
Activation of cysteine-type endopeptidase
activity involved in apoptotic process
4.05
1.63E-05
Regulation of apoptotic process
2.63
2.85E-05
Defense response to virus
2.85
4.63E-05
Negative regulation of viral genome replication
5.60
5.19E-05
Immunoglobulin mediated immune response
12.23
6.39E-05
Signal transduction
1.54
1.01E-04
Type I interferon signaling pathway
4.20
1.09E-04
Tumor necrosis factor-mediated signaling
pathway
3.04
2.37E-04
Interferon-gamma-mediated signaling pathway
3.79
2.84E-04
Cellular response to interferon-alpha
12.46
4.11E-04
Intrinsic apoptotic signaling pathway in response
to endoplasmic reticulum stress
5.43
5.24E-04
Positive regulation of apoptotic signaling
pathway
6.28
6.55E-04
wirusowe DNA
wirusowe RNA
No change
Up 4x
No change
Up 20x
No expression
No expression
TBK
ISG15 – ubiquitin-like modifier,
modifies many viral proteins
TRIM22 – E3 ubiquiton ligase
RNASEL –
IFIT3 – disrepts virus-membrane
interaction
MX1 –
W jaki sposób p53 wpływa na nieswoistą
odporność.
1.
2.
3.
Długotrwałe traktowanie IFN-β aktywuje p53 przez stymulację
transkrypcji i mechanizmy potranskrypcyjne.
Infekcje wirusami (grypa A, VSV, NDV, HSV) aktywują p53.
Niektóre geny aktywowane przez interferony są również celami
p53, np.: IRF9, TLR3, IRF5, ISG15,
p53 jest inaktywowane przez białka wielu różnych wirusów.
Białko
Wirus
SV40
Large T
EBV
BZLF1, EBNA3C
KSHV
LANA, LANA2, ORF
K8,
HHV6
ORF1
Znaczenie
Wiążą p53 i hamują jego aktywność.
Adenovirus E1B-55K, E4-ORF6
HPV
VV
E6
Indukują degradację p53.
B1R
SARS-CoV SUD
HBV
X protein
Różne mechanizmy działania.
Aktywacja genu kaspazy 1 przez synergistyczną
aktywację p53.
CASP1
mRNA fold change
300
250
200
150
100
50
0
CPT
Kon
ActD
ActD+Nut
Nut
Model aktywacji i składania inflammasomu.
(up 19x)
(brak ekspresji)
PYCARD
piroptoza
FILM !
CARD – caspase recruitment domain
NACHT - nucleotide binding and
oligomerisation domain
LRR – leucin rich repeat
PYD – pyrin domain
Klasyfikacja i struktura domenowa kaspaz ssaków.
Indukcja stanu zapalnego przez kaspazę 1.
(słaba
ekspresja)
(brak
ekspresji)
(IFI16
up 19x)
(up
270x)
(up 4x)
Gasdermin D
pores
Aktywacja kaspazy 1 w komórkach A549 traktowanych A+N
up 19x
up 4x
IFI16
PYD
PYD
up 270x
PYCARD
Procaspase-1
CARD
CARD
Caspase 1
Caspase 1
Niska ekspresja w A549
Wysoka ekspresja w A549
pro-IL-1β
pro-IL-18
IL-1β
IL-18
piroptoza
Główny pirogen, aktywuje limfocyty T i B
Stymuluje produkcję IFG prze komórki Th.
Domeny HIN200 białka IFI16 mają zdolność wiązania się z DNA.
Wiązanie nie wykazuje swoistości sekwencyjnej.
Promotor NLRP1 w wektorze ekspresyjnym jest aktywowany
przez gen p53. W komórkach z wyciszonym p53 aktywacja
genu NLRP1 mierzona RT-PCR jest osłabiona.
A549, 30h
30
p53-sh
NCI-H1299, 48h
8
7
6.24
6
5
4
3
2
25
mRNA fold change
luc. Activity fold change
pro NLRP1 - pGL3
9
con-sh
20
15
10
5
1.00
1
0
0
pro-NLRP1
pro-NLRP1 + P53
untr
A+N
CPT
Mitochondrialne platformy przeciwpatogenowe.
MAVS
IFIH1
Leucin-rich
repeats
CARD – caspase recruitment domain
Komórki wywodzące się z raka płuca różnią się
wrażliwością na apoptozę. Dlaczego?
A - A549 – komórki oporne na apoptozę
H – NCI-H460 – komórki wrażliwe na apoptozę
CPT
A
H
untr
A
H
ActD
A
H
A+N
A
H
Nutl
A
H
p53
p53-Ser46
Caspase-3 active
HSC70
Komórki A549 i H460 różnią się ekspresją znanych
białek regulujących apoptozę.
A549 wysoka ekspresja:
Proapoptotycznych: ?
H460 wysoka ekspresja:
Proapoptotycznych: ?
Antyapoptotycznych:
Antyapoptotycznych: ?
BIRC3
10x
BCL2A1
inf.
PYCARD 415x
TGM2
39x
NKX2-5 725x
Hipotetyczny mechanizm aktywacji piroptozy w komórkach
A549 pod wpływem A+N.
A549
Ekspresja PYCARD
sensor patogenu
PYCARD
PYD
PYD
Kaspaza 1 może ulec aktywacji.
CARD
CARD
Caspase 1
NCI-H460
Brak PYCARD
PYD
Kaspaza 1 nie może ulec aktywacji.
CARD
Caspase 1
Gen PYCARD (ASC1) ulega ekspresji jedynie w
komórkach A549.
A549
H460
U2OS
A375
We wrażliwych na apoptozę komórkach NCI-H460, pod wpływem
traktowania A+N następuje wzrost ekspresji genu DAPK1, którą kieruje
alternatywny promotor w intronie. Powstaje w ten sposób fragment białka
DAPK1 zawierający jedynie tzw. COR i Death Domain.
A375
Kon
A375
A+N
Struktura kinazy DAPK1
Wnioski
1.
2.
3.
Synergistyczna stymulacja genu p53 aktywuje kilkadziesiąt
genów związanych z obroną komórki przed infekcjami
wirusowymi.
W komórkach A549, synergistyczna aktywacja p53 indukuje
prawdopodobnie piroptozę – śmierć komórki spowodowaną
aktywacją kaspazy 1, skutkującą wydzieleniem do
środowiska prozapalnych cytokin, głównie interleukiny 18.
Podatność badanych komórek na apoptozę jest negatywnie
skorelowana z ekspresją genu PYCARD, genu BIRC3 oraz z
prawdopodobną ekspresją skróconej formy białka DAPK1.
Udział wzięli: (alfabetycznie)
Agnieszka Gdowicz-Kłosok……………………….hodowla, izolacja RNA
Patryk Janus……………………………...……………………………...ChIP
Małgorzata Krześniak…………………….klonowanie, testy lucyferazowe
Iwona Matuszczyk……………………………………….pomoc techniczna
Artur Zajkowicz………...…trucie, klonowanie, testy lucyferazowe, xPCR
Żadne zwierzę nie ucierpiało podczas realizacji tego badania…….
….a członkowie zespołu???