na komórki linii nowotworowych jelita grubego człowieka Caco

Odrzygóźdź Cezary, Skorłutowski Wojciech, Żelechowski Konrad, Matysiewicz Michał
Opiekun Pracy: Mgr Michał Matysiewicz
Opiekun Koła Naukowego: Prof. dr hab. Elżbieta Kostyra, prof. zw.
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, Międzywydziałowe Koło Naukowe Biochemii
Medycznej Wydziału Nauk Medycznych i Wydziału Biologii i Biotechnologii
Wpływ ekstraktów z Aloe arborescens Mill.
na komórki linii nowotworowych jelita grubego człowieka Caco-2 i HT29
Streszczenie
W badaniach wykorzystano aloes drzewiasty (Aloe arborescens Mill.), który posłużył jako substrat
do otrzymania ekstraktu octanowo-etylowego. Ekstrakt naniesiono na linie komórkowe nowotworu
jelita grubego człowieka Caco-2 i HT29. Celem pracy było sprawdzenie wpływu ekstraktu z aloesu na
wyżej wymienione linie komórkowe. Podczas badania wykazano, iż ekstrakt z aloesu powoduje zmiany
w proliferacji komórek, wpływa na cytotoksyczność oraz sekrecję cytokin prozapalnych IL-6 i TNF-α.
1. Wstęp
Aloes to sukulent zaliczany niegdyś do rodziny liliowatych, a obecnie klasyfikowany do
rodziny złotogłowowych (Asphodeloideae). Aloes stosowany jest także jako roślina lecznicza
[1]. Aloe arborescens działa na wielu płaszczyznach, wpływa pozytywnie na układ pokarmowy
i immunologiczny [4]. Aloe arborescens zawiera wiele substancji aktywnych biologicznie,
cukrów, aminokwasów, witamin, antyoksydantów, enzymów oraz składników mineralnych [1].
Wykryto również pochodne antrachinonów takie jak emodin i aloe-emodin [2, 3]. Roślina ta
zawiera także związki adaptogenne co oznacza, że potrafi dostosować się do potrzeb
organizmu. W Polsce najpopularniejszą odmiana jest aloes drzewiasty (Aloe arborescens Mill).
2. Cel pracy
Celem pracy było określenie wpływu ekstraktu octanowo etylowego otrzymanego z Aloe
arborescens na proliferację linii komórkowych nowotworu jelita grubego człowieka: Caco-2 i
HT29. Określono również wpływ ekstraktu na cytotoksyczność oraz na sekrecję cytokin
prozapalnych: interleukiny 6 (IL-6) oraz czynnika martwicy nowotworów (TNF-α).
3. Materiał i metody
3.1 Przygotowanie ekstraktu
15 gramów świeżych liści aloesu drzewsiatego (Aloe arborescens Mill.) sproszkowano w
moździerzu z wykorzystaniem ciekłego azotu. Następnie aloes umieszczono w 50 ml probówce
typu falcon i dodano 30 ml 2,1% octanu etylu. Probówkę umieszczono w łaźni ultradźwiękowej
na 15 minut, po czym ekstrakt przeniesiono na bibułę filtracyjną i przepłukano 120 ml
rozpuszczalnika. Następnie filtraty oczyszczono za pomocą ultrafiltracji (punkt odcięcia 10
kDa). Uzyskany ultrafiltrat odparowano na wyparce (temperatura 38°C). Pozostałą suchą masę
rozpuszczono w DMSO, otrzymując roztwór wyjściowy o stężeniu 10 mg/ml. Następnie
przygotowano roztwory robocze o stężeniach: 25, 50, 75, 100, 125 i 150 μg/ml we
wzbogaconym medium hodowlanym Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM).
3.2 Kultury komórkowe
Linie komórkowe nowotworu jelita grubego człowieka Caco-2 oraz HT29, pochodzące z
American Type Culture Collection (ATCC) rozchodowano w medium hodowlanym Dulbecco's
Modified Eagle's medium (DMEM). Pożywkę wzbogacono o 10% bydlęcą surowicę płodową
(FBS), antybiotyki (100 U/ml penicylina i 100 μg/ml streptomycyna) oraz aminokwasy (1
mM/ml). Komórki hodowano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2.
3.3 Inkubacja z ekstraktem
Komórki wysiano na płaskodenne płytki 96-dołkowe w stężeniu 1×105 komórek/ml. Po 24
godzinnej inkubacji medium usunięto, a następnie komórki zaindukowano przygotowanymi
wcześniej ekstraktami – po 100 μl na dołek. Kontrolę stanowiły komórki hodowane tylko we
wzbogaconym medium DMEM. Indukcję prowadzono przez 6, 12 i 24 godziny, po których
sprawdzano wpływ ekstraktu na proliferację komórek (BrdU) oraz jego wpływ cytotoksyczny
(NR).
3.4 BrdU (bromodeoksyurydyna)
Test polega na ilościowym pomiarze syntezy DNA, co umożliwia zbadanie zmiany
proliferacji komórek. Bromodeoksyurydyna jest syntetycznym analogiem nukleozydu [3H]tymidyny inkorporowanym do DNA w dzielącej się komórce w trakcie fazy S podziału
komórki. Detekcja BrdU jest możliwa przy użyciu specyficznego przeciwciała sprzężonego z
enzymem oraz reakcji enzymatycznej powyższego enzymu. Na wysiane 24 godziny wcześniej
komórki nałożono badane stężenia ekstraktu w ilości 100 μl/dołek. Jednocześnie dodano do
każdego dołka po 10μl roztworu znakowanego BrdU. Po każdym z ustalonych przedziałów
czasu medium z BrdU usunięto, a płytki wysuszono do sucha. Następnie do dołków dodano
bufor fiksacyjny, który po 30 minutach usunięto a do dołków dodano przeciwciała anti-BrdUPOD. Po 2 godzinach płytki przepłukano trzykrotnie 1% PBS i dodano substrat TMB.
Zmierzono absorbancję na czytniku do mikropłytek przy długości fali 450 nm i obliczono
proliferację w odniesieniu do kontroli.
3.5 Wychwyt czerwieni obojętnej (Neutral Red - NR)
Test wychwytu czerwieni obojętnej oparty jest na wychwycie czerwieni obojętnej (NR)
przez lizosomy żywych komórek poprzez bierny transport w poprzek błony komórkowej.
Martwe i uszkodzone komórki nie mają tej właściwości. Komórki hodowano na 96-dołkowych
płytkach przez 24 godziny po czym zaindukowano je 100μl przygotowanymi ekstraktami
aloesu (próba kontrolna inkubowana tylko w czystym medium hodowlanym). Po każdym z
ustalonych przedziałów czasu ekstrakty usunięto i dodano do dołków 0,4% roztwór czerwieni
obojętnej. Komórki następnie indukowano przez 3 godziny, po których barwnik usunięto,
komórki utrwalono w roztworze 1% paraformaldehydu a następnie włączony barwnik
rozpuszczono za pomocą rozpuszczalnika. Przy pomocy czytnika do mikropłytek zmierzono
absorbancję przy długości fali 540nm i obliczono cytotoksyczność w odniesieniu do kontroli.
3.6 Test ELISA
Poziom wydzielanych przez komórki cytokin prozapalnych: IL-6 oraz TNF-a był oznaczony
w medium pohodowlanym po 24 godzinach inkubacji z badanymi stężeniami aloesu. Do
oznaczeń wykorzystano metodę immunoenzymatyczną ELISA z zastosowaniem komercyjnych
zestawów firmy Mabtech zgodnie z procedurą producenta.
4. Wyniki
4.1
BrdU
Zaobserwowano spadek proliferacji komórek Caco-2 po zastosowaniu każdego stężenia
ekstraktu. Najniższą proliferację (spadek o 34% względem kontroli) stwierdzono po
zastosowaniu ekstraktu o stężenia 50 μg/ml po upływie 6 godzin (Rys. 1). Ekstrakt z aloesu
użyty na linie komórkową HT29 nie działał hamująco na ich proliferację, tak jak było to w
przypadku linii Caco-2. Najwyższy wzrost proliferacji komórek HT29 odnotowano dla stężeń:
25, 50, 75 μg/ml po upływie 12 godzin inkubacji. Po upływie 24 godzin i stężeń 100, 125, 150
μg/ml zaobserwowaliśmy powrót komórek do stanu w jakim znajdowały się przed podaniem
ekstraktu (Rys 2).
W łą c z a n ie B r d U
w s t o s u n k u d o k o n t r o li [ % ]
130
k o n tro la
120
6 g o d z in
110
1 2 g o d z in
100
2 4 g o d z in y
90
80
70
60
25
50
75
100
125
150
s t ę ż e n ie [ g /m l]
Rysunek 1 Wpływ ekstraktu octanowo etylowego z aloesu na proliferacje komórek linii Caco-2
mierzoną za pomocą testu BrdU
W łą c z a n ie B r d U
w s t o s u n k u d o k o n t r o li [ % ]
130
k o n tro la
120
6 g o d z in
110
1 2 g o d z in
100
2 4 g o d z in y
90
80
70
60
25
50
75
100
125
150
s t ę ż e n ie [ g /m l]
Rysunek 2 Wpływ ekstraktu octanowo etylowego z aloesu na proliferacje komórek linii HT29
mierzoną za pomocą testu BrdU
4.2 Wychwyt czerwieni obojętnej (NR)
Ekstrakt po upływie 6 godzin, działał cytotoksycznie na komórki linii Caco-2, najwyższą
cytotoksyczność odnotowano dla stężenia 50 μg/ml, gdzie wychwyt czerwieni obojętnej spadł
o 16% w stosunku do próby kontrolnej.(Rys 3). Natomiast stężenia 25, 50 μg/ml po upływie 6
godzin wpływały najsilniej na cytotoksyczność komórek linii HT29. Dla powyższych stężeń
odnotowano spadek wychwytu czerwieni obojętnej o 20% w stosunku do próby kontrolnej. Po
upływie 12 godzin ekstrakt nie działał cytotoksycznie na linię komórkową HT29 (Rys. 4).
W ychw yt N R
w s t o s u n k u d o k o n t r o li [ % ]
120
k o n tro la
6 g o d z in
110
1 2 g o d z in
100
2 4 g o d z in y
90
80
70
25
50
75
100
125
150
s t ę ż e n ie [ g /m l]
Rysunek 3 Wpływ ekstraktu octanowo etylowego z aloesu na cytotoksyczność komórek linii Caco-2 mierzoną za
pomocą testu wychwytu czerwieni obojętnej (NR), p<0,05
W ychw yt N R
w s t o s u n k u d o k o n t r o li [ % ]
120
k o n tro la
6 g o d z in
110
1 2 g o d z in
100
2 4 g o d z in y
1 2 g o d z in
90
80
70
25
50
75
100
125
150
s t ę ż e n ie [ g /m l]
Rysunek 4 Wpływ ekstraktu octanowo etylowego z aloesu na cytotoksyczność komórek linii HT29 mierzoną za
pomocą testu wychwytu czerwieni obojętnej (NR), p<0,005
4.3 Sekrecja cytokin
Zaobserwowano, że stężenia wynoszące 50, 100, 125 oraz 150 µg/ml podwyższają sekrecję
IL-6 w przypadku linii Caco-2 (Rys 5) w odniesieniu do próby kontrolnej (16,6 pg/ml).
Najwyższy poziom IL-6 zaobserwowano po indukcji komórek ekstraktem o stężeniu 125 µg/ml
(27,0 pg/ml) i 150 µg/ml (22,9 pg/ml). Czynnik martwicy nowotworów (TNF-α) był
wydzielany w dużej ilości przez komórki Caco-2 po stymulacji ekstraktem aloesu o stężeniu 25
µg/ml. Oznaczone stężenie TNF-α wyniosło 70,3 pg/ml co było 2,5-krotnie wyższym wynikiem
niż w próbie kontrolnej – 19,1 pg/ml (Rys 6). Nie odnotowano sekrecji TNF-α po stymulacji
stężeniami od 50 do 150 µg/ml.
Rysunek 5. Poziom sekrecja IL-6 przez komórki
linii Caco-2 po inkubacji w ekstrakcie octanowoetylowym aloesu
Rysunek 6. Poziom sekrecja TNF-α przez komórki
linii Caco-2 po inkubacji w ekstrakcie octanowoetylowym aloesu
Bardzo niskie, na progu czułości testu (1,4 pg/ml), były za to poziomy oznaczeń IL-6
wytwarzanej przez komórki HT29. Zaobserwowano tutaj wzrost stężenia IL-6 w medium w
odniesieniu do kontroli (1,4 pg/ml) po stymulacji komórek ekstraktem o stężeniu 25 µg/ml, 75
µg/ml oraz 100 µg/ml. Stężenie IL-6 wynosiło odpowiednio: 2,6 pg/ml, 2,1 pg/ml oraz 2,6
pg/ml (Rys 7).
Wykazano wzrost sekrecji TNF-α przez komórki linii nowotworu jelita grubego człowieka
HT29 we wszystkich sprawdzanych stężeniach poza stężeniem 25μg/ml. Najwyższą sekrecje
wykazały komórki inkubowane w ekstrakcie o stężeniu 125μg/ml. Wartość ta wynosi 290pg/ml
(Rys 8)
Rysunek 7. Poziom sekrecja IL-6 przez komórki
linii HT29 po inkubacji w ekstrakcie octanowoetylowym aloesu
Rysunek 8. Poziom sekrecja TNF-α przez komórki
linii HT29 po inkubacji w ekstrakcie octanowoetylowym aloesu
5. Podsumowanie i wnioski
Na podstawie wyników stwierdzono, że komórki linii Caco-2 i HT29 zareagowały na
ekstrakty z Aloe arborescens Mill.. Wyniki przeprowadzonych testów pokazują obniżenie
proliferacji komórek linii Caco-2. Zaobserwowano natomiast wzrost proliferacji komórek linii
HT29. Najniższe stężenia ekstraktu wykazują największą cytotoksyczności na obie linie
komórkowe raka jelita grubego. Wyniki pokazują, że aloes może wywoływać stany zapalne w
układzie pokarmowym człowieka ze szczególnym uwzględnieniem jelita grubego.
Bibliografia
1. PAKŁOWSKI A. Aloes w leczeniu i profilaktyce zdrowotnej. F.H.U. "Dom", Kraków 1997
2. PECERE T, GAZZOLA MV, MUCIGNAT C, PAROLIN C, VECCHIA FD, CAVAGGIONI A, BASSO G,
DIASPRO A, SALVATO B, CARLI M, PALÙ G. 2000.Aloe-emodin is a new type of anticancer agent
with selective activity against neuroectodermal tumors. Cancer Res. 1; 60(11):2800-4
3. SHIMPO K, CHIHARA T, KANEKO T, BEPPU H, WAKAMATSU K, SHINZATO M, YUKITAKE J,
SONODA S. 2014. Inhibitory effects of low-dose aloe-emodin on the development of colorectal
tumors in min mice. Asian Pac J Cancer Prev. 15(14):5587-92
4. WOŹNIAK A, PADUCH R. 2012. Aloe vera extract activity on human corneal cells. Pharm Biol.
50(2):147-54
Effect of extracts of Aloe arborescens Mill.
on colon cancer cells lines Caco-2 and HT29
Summary
We used in research aloe arborescens, we used it for create an extract. This extract we carried on cell
lines Caco-2 and HT29. Aim of this study was to examine the effect of extracts of aloe threaded on these
cell lines. We have shown that extracts of aloe cause simultaneous changes in cell proliferation and the
production cytokines