PCR – łańcuchowa reakcja polimeryzacji. Metoda ta umożliwia
advertisement
PCR – łańcuchowa reakcja polimeryzacji. Metoda ta umożliwia kopiowanie specyficznych sekwencji z chromosomowego DNA (zwykle odpowiadająych genom lub fragmentom genów) i namnażanie ich ponad milionkrotnie, ponieważ każda powstająca cząsteczka DNA jest matrycą dla powstania kolejnej. Warunkiem przeprowadzania PCR jest znajomość sekwencji DNA na obu końcach regionu, który ma być skopiowany. Każda próba PCR musi zawierać 4 podstawowe składniki: matrycowy DNA – zawiera sekwencję DNA która ma być namnożona. Mogą znajdować się tam też inne sekwencje, ale ważne aby była ta docelowa; startery oligonukleotydowe – każda reakcja PCR wymaga pary starterów, ponieważ polimeraza DNA aby zacząć syntezę potrzebuje krótkiego odcinka dwuniciowego (aby mieć koniec 3' do którego może przyłączać nukleotydy). Startery są to krótkie jednoniciowe DNA syntezowane chemicznie. Ich sekwencje muszą być tak dobrane aby wiązały się komplementarnie po obu stronach sekwencji przeznaczonej do namnożenia (na obu końcach 5' genu). Startery muszą być w takim nadmiarze molowym aby przy reasocjacji pojedynczych nici to one, a nie syntetyzowane łańcuchy, łączyły się z komplementarnymi sekwencjami; *overhang – jest to przedłużenie startera zawierające dodatkową sekwencję (stosuje się jeśli chcemy namnożyć DNA z przyłączoną dodatkową sekwencją, np. służącą do wklonowania potem w plazmid.) polimeraza DNA – musi to być polimeraza termostabilna, najczęściej Taq z bakterii Thermus aquaticus. Polimeraza DNA służy do namnażania kopii DNA. Aby rozpocząć replikację polimeraza potrzebuje krótkiego dwuniciowego rejonu – jes nim przyłączony starter oligonukleotydowy. Startery zmuszają polimerazę do amplifikacji tylko sekwencji docelowej. DNTP (trifosforany deoksynukleotydów) – elementy budulcowe nowego DNA. Bufor, w którym przebiega reakcja zawiera jony Mg2+, ponieważ są one potrzebne polimerazie do działania. Etapy: 1) Denaturacja – podgrzanie próby do 90º C, co powoduje rozdzielenie helisy na dwie nici; 2) Przyłączenie starterów do matrycy – temperaturę obniża się do 40-60st. C, co pozwala na przyłączenie starterów do matrycy ale nie pozwala na odtworzenie się podwójnej helisy. 3) Elongacja – dla polimerazy Taq etap ten odbywa się w 72º C. Polmimeraza zaczynając od starterów kopiuje sekwencję docelową. Polimeraza może zsyntetyzować maksymalnie około 3000 pz więc liczba cykli jest ograniczona. Przeprowadza się po 20-40 cykli. Można namnażać sekwencję o długości od kilku do kilku tysięcy par zasad. Dobór odpowiednich parametrów do PCR: odpowiednie startery – nie tworzące spinek, nie komplementarne względem siebie nawzajem, o temperaturze topnienia 50-60º C; rodzaj polimerazy – musi być termostabilna np. Taq lub Pfu; warunki reakcji – temperatura, przebieg cykli itp. Enzymy restrykcyjne są to bakteryjne endonukleazy, które chronią ich komórki przed obcym DNA tnąc go pośrodku cząsteczek. DNA bakteryjny jest chroniony przez specyficzną metylację. W inżynierii wykorzystywane są zwykle enzymy klasy II, czyli takie, które tną DNA w obrębie lub w pobliżu określonych, rozpoznawanych sekwencji. Używa się właśnie klasy II ponieważ one tną dokładnie w rozpoznawanych miejscach. Enzymy klasy I i III tną z pewnymi przesunięciami. Są to w większości homodimery, ich kofaktorem jest Mg2+. Najczęściej są to sekwencje palindromowe, o długości 4 lub 6 nukleotydów. Im większe fragmenty są rozpoznawane, tym rzadziej enzym tnie, a więc tym większe fragmenty się otrzymuje. Przecięcie wiązań fosfodiestrowych dwu nici zachodzi albo dla tej samej pary zasad (pozostają „tępe” końce), albo z przesunięciem o jedną lub więcej par (pozostają „lepkie” końce). Lepkie końce ułatwiają ligację ponieważ wiązania wodorowe między wolnymi zasadami przytrzymują dwie cząsteczki razem. Enzymy tną pozostawiając wolne grupy OH na końcu 3' i grupy fosforanowe na końcu 5'. Mapa restrykcyjna – jest to wzjaemne ułożenie miejsc restrykcyjnych rozpoznawanych w danej sekwencji przez określony zbiór enzymów restrykcyjnych. Wzór restrykcyjny – to wielkość fragmentów DNA uzyskanych po trawieniu określonym enzymem restrykcyjnym. Izoschizomery – to enzymy restrykcyjne rozpoznające tą samą sekwencję, ale tnące w inny sposób (zostawiają inne końce). Niektóre enzymy rozpoznają różne sekwencje ale pozostawiają takie same końce. Typy wektorów 1) Plazmidy Są to małe, zwykle koliste cząsteczki DNA występujące w komórkach bakterii a także drożdży, które mogą się replikować autonomicznie. Są najczęściej stosowanymi wektorami do klonowania. Zaletą plazmidów jest to, że są małe (średnio 3kpz) co ułatwia ich izolację z kolonii bakteryjnych i uzyskanie wklonowanego DNA. Ponadto zawierają geny np. nadające odporność na antybiotyki, lub cechy metaboliczne, które służą jako markery selekcyjne (umożliwiają selekcję tych komórek które przyjęły plazmid od pozostałych). Wektory plazmidowe posiadają zwykle takie podstawowe elementy jak: Ori - miejsce inicjacji replikacji specyficzne dla danej komórki gospodarza, Marker I - gen na wektorze np. nadający odporność, który umożliwia oddzielenie tych komórek, które przyjęły plazmid, od pozostałych. Marker II - pozwala odróżnić komórki z plazmidami bez wstawki od tych ze wstawką. Zwykle w środku takiego markera jest polilinker, w który trafia wstawka. Jeśli zostanie wbudowana, gen jest unieczynniony. Komórka która przyjęła plazmid ze wstawką z oba takimi markerami, będzie odporna na jeden antybiotyk (marker I) a nie odporna na drugi (marker II). Polilinker, czyli MCS (miejsce wielokrotnego klonowanie) -jest to niewielki, syntetycznie skonstruowany odcinek DNA, wstawiany do plazmidu (zwykle w obrębie markeru II), zawierający sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych. Przykładowym plazmidem bakteryjnym jest pUC8 – zawiera on gen markerowy odporności na ampicylinę, oraz gen lanZ' kodujący część enzymu β-galaktozydazy. Niektóre szczepy bakterii mają zmodyfikowany gen lacZ gdzie brakuje właśnie fragmentu lacZ'. Uzupełnia się on po transformacji plazmidem (patrz α-komplementacja). 2) Fag λ Jest to bakteriofag, który został przystosowany do użycia jako wektor do klonowania - centralna część jego DNA (która nie ma zasadniczo wpływu na infekcję) została usunięta i tam można wprowadzać obce DNA. Pozostawione końce 5' i 3' zwane są ramionami. Zrekombinowane DNA wprowadza się do kapsydów białkowych w procesie pakowania. Jest to możliwe dzięki sekwencjom cos występującym na każdym końcu DNA faga (są to 12 nukleotydowe jednoniciowe końce, komplementarne do siebie). Pakowanie zachodzi spontanicznie, ale pakowane są tylko fragmenty DNA długości 37-52 kpz, oflankowane na obu końcach sekwencjami cos. A więc w wielu przypadkach od razu zachodzi selekcja – pakowane są tylko fragmenty ze wstawką bo tylko te są wystarczająco długie. Fagi wysiewa się następnie na szalkę z murawą bakterii (lub też infekuje się komórki mieszając je z fagami i wysiewa się wszystko na szalkę)- tam gdzie powstaną małe łysinki doszło do lizy komórek, przez bakteriofaga. Łysinki można izolować i używać do produkcji dużej ilości klonowanego DNA przez infekcję świeżych kultur E. Coli. Zaletą faga lambda jest to, że można wklonować znacznie większe obszary niż w przypadku plazmidów bakteryjnych, dlatego też mają zastosowanie w tworzeniu bibliotek genomowych. 3) Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC) Są to wektory umożliwiające klonowanie w komórkach eukariotycznych (drożdży). Są to zmodyfikowane chromosomy zawierające wszystkie elementy niezbędne do replikacji - miejsce startu replikacji, centromery, telomery, a także wstawione są do nich markery selekcyjne oraz miejca restrykcyjne. Mogą przyjmować bardzo duże fragmenty DNA ( do kilkuset kpz) nawet wielkości genu ssaka dlatego są bardzo użyteczne do tworzenia bibliotek genowych wyższych organizmów. Wadą tych wektorów jest często ich mała stabilność (trudno utrzymać wstawkę). Stabilniejsze choć niezdolne przyjmować tak duże odcinki DNA są sztuczne chromosomy bakteryjne BAC, wektory bakteriofaga P1 i kilka innych. 4) Sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) Oparte są na naturalnie występującym u E. coli plazmidzie F. Plazmid ten jest względnie duży i ma większą pojemność niż typowe plazmidy bakteryjne. Wstawki są w nich bardzo stabilne, można klonować fragmenty ponad 300 kpz. Miały zastosowanie w Projekcie Genomu Człowieka. 5) Wektory ekspresyjne są to wektory, które umożliwiają ekspresją wstawionej sekwencji DNA kodującej białko. Wektory bakteryjne aby służyły jako wektory ekspresyjne, muszą posiadać: sekwencję promotorową - silny promotor, konstytutywny lub regulowany, umiejscowiony przed miejscem wprowadzenia sekwencji kodującej. sekwencję Shine-Dalgardno - miejsce wiązania rybosomów bakteryjnych. Sekwencja ATG może pochodzić z wstawki lub już znajdować się na wektorze. terminator transkrypcji - za sekwencją kodującą. 6)Wektory bifunkcjonalne są to wektory drożdżowe skonstruowane tak, że są zdolne do replikacji zarówno w komórkach drożdży jak i E. coli. Mają odrębne sekwencje startu replikacji oraz geny markerowe dla każdego z tych organizmów. Pozwala to np. na klonowanie genów w E. coli i badanie ich ekspresji w drożdżach co jest łatwiejsze niż wykonywanie wszystkich etapów w komórkach drożdży. 7) Plazmid Ti są to plazmidy występujące u bakterii Agrobacterium tumefaciens. Można dzięki nim wprowadzać geny do organizmu roślinnego. Dzięki białkom vir, plazmid ten integruje z chromosomem roślinnym (patrz dysrupcja). 8) Kosmid jest to typ wektora posiadający zarówno cechy plazmidu bakteryjnego jak i faga λ. Ma on cechy takie jak odporność na antybiotyki, polilinkery, a także sekwencje cos z faga – mogą więc być pakowane w kapsydy fagowe. Zainfekowana kosmidami murawa bakteryjna nie ma łysinek, bo kosmidy nie mają genów fagowych odpowiedzialnych za lizę komórek. Izoluje się je przez pożywki z antybiotykiem. Powielać można je tak jak plazmidy. Ich zaletą jest to, że mogą przyjmować bardzo duże wstawki (do 44kpz). Klonowanie W odniesieniu do pojedynczego DNA klonowanie oznacza namnożenie określonego odcinka DNA w komórce gospodarza, zwykle E. coli, przy zastosowaniu odpowiedniego wektora. Stosuje się je w celu odszukania i namnożenia danego genu z genomu organizmu, później można go poddawać manipulacji, ukierunkowanej mutagenezie etc. Klonowanie może zachodzić tylko w bakteriach bo pobierają one tylko 1 plazmid w czasie transformacji. Narzędzia niezbędne do klonowania to enzymy restrykcyjne, ligazy oraz wektory. Etapy: 1) DNA donorowy trawi się enzymem restrykcyjnym i tym samym enzymem (lub pozostawiającym takie same lepkie końce) trawi się wektor. 2) Przeprowadza się ligację wektora z donorowym DNA za pomocą enzymu - ligazy. Tworzy ona kowalencyjne wiązania fosfodiestrowe między nukleotydami(na koszt ATP). Aby zapobiec cyrkularyzacji wektora przed ligacją, można usunąć grupy fosforanowe z końców 5' przy użyciu fosfatazy. Po ligacji powstają trzy rodzaje produktów: odtworzony pusty wektor (fosfataza zwykle nie działa ze 100% wydajnością), donorowy DNA zamknięty w kółko i wektory ze wstawką czyli plazmidy zrekombinowane. Aby zapobigać powstawaniu plazmidów bez wstawki stosuje się duży nadmiar wstawek w stosunku do plazmidów. Aby sprawdzić które plazmidy przyjęły wstawkę można je rozdzielić elektroforetycznie, ponieważ różnią się wielkością. 3) Transformacja, czyli wprowadzenie DNA do komórek bakterii gospodarza (zwykle E. coli). Aby komórki przyjęły obcy DNA muszą być kompetentne. E. coli w tym celu należy potraktować roztworem jonów wapnia w 4º. C i poddać szokowi cieplnemu - 37-42º. C. (Inna metoda to elektroporacja - poddanie silnemu impulsowi elektrycznemu uszkadzającemu błony.) Zasada klonowania opiera się na tym, że do jednej komórki bakterii trafia tylko jeden plazmid. W wektorze znajduje się gen markerowy, np. odporności na antybiotyk. Dzięki temu można selekcyjnie oddzielić komórki które przyjęły plazmid (pusty lub ze wstawką) bo tylko te wyrosną na pożywce z antybiotykiem. Potomstwo takiej bakterii to klon, z którego po namnożeniu można wyizolować DNA plazmidowy. 4) Wyszukanie pojedynczego klonu ze zrekombinowanym plazmidem. Klonowanie genów ma zastosowanie w identyfikacji genów związanych z procesami chorobowymi, w mapowaniu genomu, tworzeniu GMO a także tworzeniu białek zrekombinowanych. Biblioteki DNA Jest to zbiór zrekombinowanych fagów, które zawierają fragmenty sekwencji DNA reprezentujące cały genom organizmu. Sporządza się je z DNA wyizolowanego z komórki, który rozrywa się na małe fragmenty (ok 20 kpz) i łączy z ramionami faga lambda, a następnie losowo klonuje. Na szalkach z murawą bakteryjną powstają tysiące łysinek, a każda zawiera inną sklonowaną sekwencję. Szukaną sekwencję można odnaleźć metodą odciskową stemplem nylonowym na którym po denaturacji za pomocą sond można wyszukiwać odpowiednie sekwencje. Dobra biblioteka (bank) zawiera zwykle ponad 50% zrekombinowanych plazmidów ze średnią wielkością wstawki 10kpz i pokrywa kilkakrotnie genom organizmu dawcy. Banki genów na E. coli mogą być tworzone tylko jeśli geny mają mało intronów (np. geny drożdżowe) – zajmują mniej miejsca, inaczej jest małe prawdopodobieństwo że do plazmidu sklonuje się cały gen. Biblioteki cDNA są to biblioteki genowe zakładane przy użyciu mRNA. Enzym odwrotna transkryptaza przepisuje mRNA na DNA, zwane cDNA (– DNA komplementarne do mRNA). Takie DNA nie zawiera sekwencji intronowych - jest to tylko kodujące DNA. W ten sposób otrzymujemy klony reprezentujące tylko te geny, które są eksprymowane w danej komórce ( a więc biblioteka cDNA miocytu będzie inna niż np. krwinki). Dzięki temu, że geny nie zawierają już intronów, cała sekwencja genu może zmieścić się w jednym klonie. Biblioteki ekspresyjne Są to biblioteki cDNA, które umożliwiają translację sklonowanych sekwencji w komórce gospodarza. Do przeszukiwania takich bibliotek stosuje się znakowane przeciwciała swoiście rozpoznające dane białko. Metoda α-komplementacji Jest to metoda pozwalająca na selekcję bakterii ze wstawką i bez, nie wymagająca ich przesiewania jak w przypadku cechy odporności na antybiotyki. Stosuje się tu jako marker β-galaktozydazę. Na wektorze znajduje się N-końcowy fragment genu lacZ. Koduje on ten enzym, oraz sekwencję promotorową (fragment ten nazywa się Z' lub α). Na genomie szczepu biorcy natomiast znajduje się część C-końcowa oraz sekwencje niezbędne do ekspresjii genu. Po wprowadzeniu plazmidu do komórki biorcy, produkty białkowe ekspresji obydwu fragmentów genu lacZ łączą się w funkcjonalny enzym. Jeśli natomiast w obrębie fragmentu Z' na plazmidzie zostanie wstawiony DNA to nie będzie powstawał aktywny enzym. Po dodaniu do podłoża X-gal, w obecności β-galaktozydazy komórki będą przyjmowały niebieską barwę (produkt rozkładu X gal przez β-galaktozydazę jest niebieski) Gen reporterowy Jest to gen kodujący białko, którego obecność lub aktywność biochemiczną można łatwo oznaczyć w komórce in vivo, dzięki technikom atoradiografii, spektrofotometrii lub chemo- i bioluminescencji. Geny reporterowe łączy się z sekwencjami które mają być scharakteryzowane, a następnie na drodze transformacji lub transfekcji wprowadza się je do komórek. Dany gen reporterowy można stosować w organizmie pod warunkiem, że organizm ten nie posiada genu homologicznego (w normalnych warunkach). Oczywiście trzeba zastosować odpowiedni wektor ekspresyjny aby gen reporterowy był wyrażany. Niektóre zastosowania genów reporterowych: ustalanie regionów promotorów odpowiedzialnych za regulację genów – potencjalny promotor łączy się z genem reporterowym i wprowadza do komórki. Szacuje się aktywność promotora na podstawie akywności białka kodowanego przez gen reporterowy. Ustalanie wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek – łączy się cDNA kodujący badane białko z genem reporterowym (najczęściej białkiem zielonej fluorescencji – GFP) i analizuje się mikroskopowo jego położenie w komórce po ekspresji. Wykorzysanie genu lacZ jako reportera w drożdżowym systemie dwuhybrydowym – (patrz: system dwuhybrydowy) Elektroforeza DNA Jest to rozdział łańcuchów polinukleotydowych w żelu agarozowym, ze względu na ich formę i wielkość. Do przygotowania żelu oraz roztworu, w którym prowadzona jest elektroforeza na ogół wykorzystywany jest ten sam typ buforu. Do elektroforezy DNA najczęściej używane są dwa typy buforów: TAE i TBE (z kwasem octowym i kwasem borowym). Po obu stronach żelu są umieszczone elektrody. Próbki DNA (lub RNA) umieszcza się w studzienkach na jednym końcu płytki żelu. Stosuje się substancję obciążającą, która zapewnia zaleganie preparatu na dnie kieszonki chroniąc kwasy nukleinowe przed dyfuzją do buforu elektroforetycznego. Na drugim końcu płytki jest elektroda dodatnia – anoda. DNA jest naładowane ujemnie więc wędruje w stronę anody. Ponieważ żel jest siecią porów przez które DNA się musi przeciskać, dlatego małe fragmenty wędrują szybciej – bo przeciskają się łatwiej. Duże fragmenty znajdą się na górze żelu a małe na dole. Wielkość cząstek a szybkość migracji to zależność logarytmiczna. W celu wizualizacji DNA w żelach agarozowych zazwyczaj stosuje się bromek etydyny (EDTA). Związek ten interkaluje pomiędzy pary zasad powodując intensywną fluorescencję w świetle UV. Po zakończeniu procesu żel wydobywa się z aparatu i analizuje przez wybarwienie bądź obserwację absorpcji światła (zazwyczaj UV) przez żel. Wizualizację elektroforegramów preparatów znakowanych radioaktywnie uzyskuje się przez zaczernienie kliszy fotograficznej (autoradiogram). Dysrupcja genów (knock-out) Jest to metoda określania funkcji danego genu przez jego wyłączenie i obserwację jakie są efekty tego wyłączenia, np. zaburzenie jakiegoś procesu metabolicznego. Aby uzyskać dysrupcję jakiegoś genu - np. genu X u drożdży należy stransformować komórkę drożdża liniowym fragmentem DNA, zawierającym gen markerowy. Końce tego fragmentu muszą być homologiczne do sekwencji odcinków leżących po obu stronach ORF genu X. Wolne końce wprowadzonego fragmentu stymulują homologiczną rekombinację (konieczny jest podwójny crossing-over) - gen markerowy zastępuje gen X. Taki fragment DNA - sekwencja genu markerowego otoczona sekwencjami homologicznymi do końca 5' i 3' usuwanego genu nazywa się kasetą delecyjną. Jeżeli jakiś gen jest kluczowy dla życia komórki i nie można go usunąć, to umieszcza się go pod promotorem i wycisza np. w pewnym stadium życia aby obserwować efekty. Można też poddawać transformacji szczep diploidalny - wtedy kaseta może zostać zintegrowana w locus jednego chromosomu. Obecność drugiego chromosomu z funkcjonującym genem będzie zapewniała przeżycie. Efekt letalny dysrupcji można stwierdzić analizując produkty mejozy w uzyskanych tetradach. Drożdże są najdogodniejszym obiektem do dysrupcji, ponieważ mają wyjątkowo dużą wydajność rekombinacji homologicznej – większość komórek stransformowanych kasetą delecyjną to rekombinanty. Fragmenty otaczające gen markerowy w kasecie delecyjnej nie muszą być długie by zaszła rekombinacja (kilkadziesiąt par zasad. U innych eukariota potrzeba przynajmniej kliku tysięcy pz, a i to nie gwarantuje rekombinacji. Większa wydajność jest w komórkach macierzystych. Otrzymuje się z nich całe organizmy knockoutowe. Kasety delecyjne dla drożdży można tworzyć metodą PCR. Startery namnażające marker selekcyjny mają przyłączone do końców 5' sekwencje odpowiadające sekwencjom otaczającym docelowy usuwany gen. Można też uzyskać ją na drodze rekombinowania plazmidu z wykorzystaniem miejsc restrykcyjnych, a następnie wyciąć liniowy fragment DNA - kasetę. W przypadku rośliny Arabidopsis thaliana transformacji dokonuje się za pomocą bakterii Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta posiada plazmid niosący gen kodujący białka vir. Są one odpowiedzialne za przenoszenie fragmentów DNA do do komórek roślinnych. Drugi plazmid zawiera gen odporności na antybiotyk, oflankowany sekwencjami T-DNA. Dzięki tym sekwencjom fragment jest włączany z dużą częstotliwością do genomu roślinnego. Po infekcji zalążków powstają białka vir. Przecinają one jedną nić T-DNA co powoduje rozplecenie plazmidu. Jedna z nici jest opłaszczana białkami vir i transportowana do jądra gdzie jest włączana do genomu. Wstawianie nie jest specyficzne i w dodatku może nastąpić w 1-3 miejscach. Nasiona powstałe z takiej rośliny są wysiewane na szalkę z antybiotykiem. Te które wyrosną, to te które przyjęły gen markerowy. Następnie krzyżuje się te rośliny i otrzymuje pokolenie potomne, homozygotyczne. Z siewek izoluje się DNA i ustala się miejsca integracji T-DNA poprzez sekwencjonowanie przy użyciu startera komplementarnego do wstawionego T-DNA. Identyfikuje się w ten sposób gen znokautowany. Sondy są to jednoniciowe łańcuchy kwasów nukleinowych o znanej sekwencji – RNA, oligonukleotydy, lub DNA zdenaturowane (ogrzane i szybko schłodzone aby zachowało formę jednoniciową). Służą one do wykrywania określonych sekwencji DNA przez hybrydyzację (łączenie się na zasadzie komplementarności w dwuniciową strukturę). Sondy są znakowane izotopami promieniotwórczymi (P, S, C i H) i mogą być wywołane na kliszy rengenowskiej – autoradiografia. Mogą też być znakowane nieradioaktywnie co jest bezpieczniejszą metodą, np. za pomocą steroidu digoksygeniny (DIG), który można wykryć przy pomocy specyficznych przeciwciał znakowanych barwnie. Technika Southerna Jest to pierwsza metoda polegająca na wykrywaniu sekwencji przez hybrydyzację kwasów nukleinowych. Stosuje się ją zwykle w celu poznania struktury genów. Etapy: 1) DNA izoluje się z komórek w postaci dużych fragmentów chromosomowego DNA; 2) DNA trawi się przy pomocy enzymów restrykcyjnych na fragmenty wielkości od kilku do kilku tysięcy par zasad; 3) Fragmenty poddaje się elektroforezie na żelu - duże fragmenty znajdą się na górze żelu a małe na dole; 4) Żel zanurza się w alkalicznym roztworze w celu denaturacji dwuniciowych fragmentów; 5) Zdenaturowane fragmenty przenosi się na filtr przez transfer kapilarny lub elektrotransfer. Transfer kapilarny polega na tym, że żel umieszcza się na płytce nad buforem, na nim umieszcza się filtr i przykrywa stosem papierowych ręczników. Żel łączy się z buforem paskiem bibuły. Bufor przepływa przez żel to ręczników, i po kilku godzinach na filtrze znajduje się replika obrazów fragmentów z żelu. Obraz utrwala się naświetlając UV, lub zapiekając w 80º C. 6) Inkubacja fragmentów z sondą. Sondy hybrydyzują z fragmentami na żelu w komplementarnych do siebie miejscach. Filtr przemywa się w celu usunięcia związanej niespecyficznie sondy. Aby określić długość poszczególnych fragmentów stosuje się markerowe cząsteczki DNA o znanej długości - w celu porównania. Technika "northern" Technika ta służy do wykrywania (detekcji) RNA. Poza tym jest podobna do Southern. Identyfikuje się w ten sposób tylko te geny, które są aktywne w komórkach (bo tylko te są transkrybowane do mRNA.) Z komórki izoluje się RNA i poddaje elektroforezie. Po inkubacji z sondą otrzymuje się zwykle obraz jednego prążka. Stopień jego zaczernienia mówi o ilości mRNA. Technika "western" Ta technika służy do wykrywania białek, szczególnie takich które występują w komórkach w małych ilościach. Białka wykrywa się za pomocą przeciwciał swoiście rozpoznających charakterystyczne dla białek epitopy. Białka rozdziela się elektroforetycznie, następnie przenosi na filtr, zwykle przez elektrotransfer. Następnie stosuje się przeciwciała pierwszorzędowe, które swoiście rozpoznają docelowe białko, a w drugiej kolejności przeciwciała drugorzędowe, które rozpoznają epitopy charakterystyczne dla przeciwciał gatunku wykorzystanego do uzyskania przeciwciał pierwszorzędowych. Te drugie są oznakowane grupami które umożliwiają detekcję np. fluorescencyjną. Często stosuje się białka "z góry" wyposażone w znacznik, to znaczy domenę białkową pozwalającą na łatwe wykrycie białka - np. znacznik HIS (sześciohistydynowy). Do sekwencji kodującej takie białko przyłącza się w wektorze ekspresyjnym sekwencję kodującą domenę znacznikową. Wykrywa się je wtedy przeciwciałami skierowanymi przeciwko temu znacznikowi. Hybrydyzacja in situ stosuje się ją do wykrycia sekwencji kwasów nukleinowych w nienaruszonych komórkach. Zwykle stosuje się ją do identyfikacji konkretnych mRNA w komórkach, aby wykazać jakie geny są tam aktywne – np. wykazanie że insulina jest produkowana tylko w komórkach β trzustki. FISH to odmiana in situ gdzie znakuje się chromosomy. Służy to do określenia w nim pozycji genu. System dwuhybrydowy (u drożdży) Metoda ta służy do wykrywania oddziaływań między białkami. Aby jakiś gen został wyrażony, potrzebny jest na początek czynnik transkrypcyjny. Ma on domenę wiążącą się do promotora na DNA tego genu, oraz domenę aktywującą transkrypcję. Domeny te muszą współdziałać ze sobą. W systemie dwuhybrydowym stosuje się dwa wektory: na jednym zakodowane jest pierwsze badane białko z przyłączoną do niego sekwencją domeny wiążącej DNA czynnika transkrypcyjnego. Nazywa się je "przynętą". Na drugim wektorze zakodowane jest drugie badane białko z przyłączoną do niego sekwencją kodującą domenę aktywującą czynnika transkrypcyjnego. Nazywane jest ono "celem". Domeny te są domenami czynnika transkrypcyjnego dzięki któremu transkrybowany jest jakiś gen markerowy. Jeżeli po translacji białek dojdzie do oddziaływania między nimi, to domeny będą współdziałać i gen markerowy będzie eksprymowany. Interaktom - to cała sieć wszystkich oddziaływań między białkami w danej komórce. Systemy heterologicznej ekspresji białek metody te służą do uzyskiwania dużych ilości białek, które naturalmie w komórce występują w ilościach znikomych, w celu badania ich struktury i funkcji. Systemy te opierają się o różne organizmy – gospodarzy. Są to głównie bakterie (E. Coli, B. subtilis), drożdże oraz linie komórek eukariotycznych. W celu oczyszczenia produktu białkowego stosuje się zwykle chromatografię powinowactwa. Ekspresja heterologiaczna w E. coli opiera się na odpowiednich wektorach ekspresyjnych do których wstawia się cDNA kodujące białko, oraz odpowiednio zmodyfikowanych szczepach gospodarza. Wektory mogą też dołączać do badanego białka dodatkowe sekwencje aminokwasowe ułatwiające oczyszczanie, sekrecję, albo zwiększające stabilność produktu. Oczyszczanie ułatwia np. znacznik HIS (sekwencja 6 histydyn) dołączana do białka. System Qiagen (QIAexpress) – jest to system bakteryjny oparty na pochodzących z faga T5 elementach promujących transkrypjcę i translację. Promotor faga T5 jest rozpoznawany przez bakteryją polimerazę RNA. Dodatkowo promotor ten znajduje się pod kontrolą dwóch operatorów lac, a więc białko nie powstaje jeśli nie jest indukowane. IPTG indukuje ekspresję, ponieważ łączy się z represorem lac inaktywując go. Terminacja jest determinowana przez terminator pochodzący z faga λ i drugi z E. coli. Dwa miejsca terminacji mają zapobiegać powstawaniu nieprawidłowych transkryptów. Interferencja RNA Jest to druga obok dyrupcji metoda badania roli różnych genów przez zaburzenie ich funkcjonowania. Wykorzystuje się tu mechanizm posstranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów przez krótkie fragmenty dwuniciowego RNA (dsRNA). W komórce takie fragmenty powstają przez cięcie dłuższych odcinków enzymem Dicer. Wprowadzenie dwuniciowego RNA o sekwencji odpowiadającej sekwencji docelowego genu skutecznie wycisza jego ekspesję, przez uruchomienie zestawu białek degradujących mRNA. (Początkowo wprowadzano jednoniciowe oligonukleotydy RNA komplementarne do mRNA genu który chciano wyciszyć i w ten sposób uzyskiwano dwuniciowe RNA). U ssaków należy stosować krótkie RNAi (ponieżej 30 pz), ponieważ dłuższe fragmenty dwuniciowego RNA powodują wywołanie reakcji przeciwwirusowej niespecyficznie zmiejszającej ekspresję genów. DsRNA otrzymuje się chemicznie lub poddając dłuższe fragmenty dsRNA uzyskane przez transkrypcję obu nici in vitro, działaniu enzymu Dicer. Wadą systemu interferencji RNA jest krótki czas działania wyciszenia. Sekwencjonowanie DNA Metoda Sagera (metoda kontrolowanej terminacji łańcuchów) – polega na tym, że polimeraza DNA, syntetyzując nić, włącza przypadkowo dideoksynukleotydy (analogi nukleotydów bez grupy -OH w pozycji 3'), co powoduje przedwczesną terminację w miejscu włączenia. DNA, który ma być sekwencjonowany trzeba powielić (PCR lub klonowane plazmidy). Nazywa się on matrycą, musi być homogenny czyli zawierać takie same cząsteczki DNA. Ponadto sekwencjonowane DNA musi być jednoniciowe, co uzyskuje się przez termiczną lub alkaliczną denaturację. Do sekwencjonowania używa się kilku różnych polimeraz: fragment Klenowa. Jest to zmodyfikowana polimeraza DNA I z E. coli. W przeciwieństwie do naturalnej polimerazy nie wykazuje ona aktywności egzonukleazy w kierunku 5' → 3' (tylko w kierunku przeciwnym – naprawa swoich błędów). To właśnie fragment odpowiedzialny za tą funkcję został usunięty. Obecnie jednak używa się raczej sekwenazy. sekwenaza – modyfikowana polimeraza z faga TZ. polimeraza DNA Taq (patrz PCR). Wszystkie polimerazy wymagają krótkich dwuniciowych starterów (odcinków na DNA). Dodaje się więc krótkie oligonukleotydy starterowe wytwarzane chemicznie, które hybrydyzują z matrycowym DNA. Jeden z końców starterów jest znakowany radioaktywnie lub fluorescencyjnie (aby potem można było wywołać obraz na kliszy). Aby zsekwencjonować cząsteczkę DNA stosuje się 4 oddzielne próby. W każdej jest jednoniciowy matrycowy DNA, starter, polimeraza DNA, wszystkie cztery trifosforany deoksynukleotydów (A, C, T i G – substraty DNA), oraz jeden z czterech dideoksynukleotydów w każdej próbie. Polimeraza syntezując łańcuch losowo włącza dideoksynukleotyd i na tym kończy syntezę. Otrzymujemy więc w reakcjach różnej długości łańcuchy DNA w których każdy kończy się takim dideoksynukleotydem jaki został użyty w danej próbie. Podczas rozdziału elektroforetycznego grupują się one pod względem długości. Jeśli startery albo ddNTP były znakowane radioaktywnie to można je wywołać na kliszy rentgenowskiej. Sekwencja DNA odpowiada kolejności fragmentów odczytanej z żelu. Jeżeli stosuje się dideoksynukleotydy wyznakowane 4 różnymi znacznikami, to można prowadzić sekwencjonowanie w jednej mieszaninie. Otrzymuje się mieszaninę fluorescencyjnie wyznakowych fragmentów o długości startera + od 1 do n.
