Czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w
advertisement
O trawieniu restrykcyjnym • • • • Enzymy II klasy, Mg2+, dsDNA z rozpoznawaną sekwencją, tępe, lepkie (kohezyjne) końce, warunki reakcji bufor o różnym stężeniu NaCl i określonym pH BSA -stabilizator 37oC /lub inna/ aktywność starowa przerwanie trawienia nie koniecznie 15’ 65oC EDTA pH 8,0 do stęż. 10mM ekstrakcja fenolem CO DAJE NAM TRAWIENIE RESTRYKCYJNE? Fragmenty DNA na żelu w postaci prążków o identycznej sekwencji, ( precyzyjna obróbka DNA, powtarzalność fragmentacji cząsteczki) mapy restrykcyjne = obraz cząsteczki z zaznaczonymi miejscami rozpoznawanymi przez różne RE, z uwzględnieniem odległości między nimi , podstawy do mapowania genetycznego (RFLP) identyfikacja mutacji, diagnostyka, rekombinowanie i klonowanie genów. 46 – 4096pz 48 – 65536pz 44 – 256pz Długość miejsca restrykcyjnego determinuje długość fragmentów restrykcyjnych Większość miejsc restrykcyjnych to sekwencje palindromowe metylacja dam grupa metylowa jest przyłączona do adeniny w sekwencji GATC zapisujemy GmATC. metylacja dcm grupa metylowa jest przyłączona do cytozyny w sekwenji CC(AT)GG zapisujemy CmC(A/T)GG. Jednostka aktywności enzymatycznej enzymu restrykcyjnego 1 UNIT taka ilość enzymu, która - trawi całkowicie 1g dzikiego faga - w optymalnych warunkach - w ciągu 1 godziny DEFINICJE I ZASADY • Elektroforeza = ruch jonów i makromolekuł obdarzonych ładunkiem elektrycznym poprzez medium w wyniku przyłożonego napięcia • Makromolekuły rozdzielane są ze względu na 1 wielkość 2 strukturę 3 rozkład ładunku Dla liniowej cząsteczki szybkość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do log10 z masy cząsteczkowej Elektroforeza DNA • • • • • • • na ”sitach molekularnych” czyli żelach agarozowych (5020000pz)/poliakrylamidowych (5-500pz) pozwala: • rozdzielić fragmenty DNA • zidentyfikować fragmenty DNA • oczyścić fragmenty DNA • inna technika? DNA na żelu jest barwione za pomocą EtBr (>10ng dwuniciowego DNA, 1973) lub SYBR Gold (>20pg dwuniciowego DNA) i wizualizacja pod UV (albo światło niebieskie) Prążki mogą być wycięte z żelu i wykorzystane Agaroza – polimer galaktozy (~800 cząsteczek) po zestaleniu tworzą się kanaliki 50-200nm Akrylamid – neurotoksyna Rozdzielanie bardzo dużych fragmentów DNA - PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis (Schwarz i Cantor, 1984) Czynniki wpływające na szybkość migracji DNA w żelu (szybkość migracji jest odwrotnie proporcjonalna do log z liczby par zasad fragmentu DNA) 10 Wielkość cząsteczki konformacja DNA koncentracja agarozy/akrylamidu wartość przyłożonego napięcia skład nukleotydowy i temperatura obecność barwników interkalacyjnych skład buforu do elektroforezy (siła jonowa) Bufory do elektroforezy DNA TAETris-acetate, EDTA 1x TBETris-borate, EDTA 1x TPETris – phosphate, EDTA 40 mM Tris-acetate 1 mM EDTA pH 8,0 89 mM Tris-borate 2 mM EDTA pH 8,0 0.5x 45 mM Tris-borate 1 mM EDTA pH 8,0 1x 90 mM Tris-phosphate 2 mM EDTA pH 8,0 Typy agarozy • Standardowe – high melting np. SeaKam LE, TG = 35-38˚C • Low melting/gelling - np. SeaPlaque, NuSieveGTG, TG = 25-35˚C np. do ekperymentów gdzie trzeba oczyścić długi fragment DNA z żelu • O wysokiej rozdzielczości – np. MetaPhor – zastępują żele akrylamidowe • Do blottingu Agarozy do specjalnych aplikacji są drogie • zwiększają gęstość próbki • nadają próbce kolor • migrują w stronę anody(+) z określoną szybkością: -bromophenol blue – w 0.5xTBE jak dsDNA 300pz -xylene cyanol - w 0.5xTBE jak dsDNA 4kb Łączenie DNA - Ligacja Ligaza DNA - tworzy wiązania fosfodiestrowe pomiędzy nukleotydami w łańcuchu DNA - substrat: dwuniciowe DNA lub hybrydy DNA:RNA, RNA:RNA - łączy pęknięcia w pojedynczych łańcuchach dwuniciowego DNA - może łączyć 2 fragmenty dsDNA o tępych końcach (niska wydajność) Łączenie DNA - Ligacja Aktywność ligazy Najczęściej wyrażana w jednostkach Weissa: 1 U = taka ilość enzymu która katalizuje przekształcenie 1 nmola 32P-pirofosforanu w [γ,β-32P]ATP ciągu 20min. w 37˚C 0.015 jednostki Weissa ligazy liguje 50% fragmentów HindIII z 5ug bakteriofaga λ w ciągu 30min. w 16 ˚C Optymalna temperatura ligacji: -16˚C przez noc najwyższa efektywność - temp. pokojowa 30min - 2 hr do szybkiego klonowania - 4˚C przez noc 24godz Funkcje i zastosowanie: • in vivo: – udział w replikacji, rekombinacji i reperacji DNA • in vitro: – tworzenie nowych układów DNA i łączenie ich z wektorami – podczas syntezy drugiej nici cDNA (replacement synthesis) – amplifikacja DNA znajdującego się na zewnątrz znanej sekwencji DNA – inverse PCR – detekcja mutacji punktowych w DNA za pomocą ligase chain reaction (ligase amplification reaction) Typy ligaz: zależne od ATP - T4 DNA ligase (podstawowa ligaza) zależne od NAD+ E.coli DNA ligase (replacement synthesis, nie liguje RNA, łączy tępe końce tylko w obecności PEGu lub Ficollu) - Ligacja fragmentów obcego DNA do wektorów plazmidowych Końce fragm. obcego DNA Tępe Lepkie różne, uzyskiwane przy pomocy różnych enz. restr. Lepkie identyczne, uzyskiwane przy pomocy tych samych enz. restr. Wymagania w klonowaniu Uwagi • tło klonów nierokombinantów może być wysokie Duże stężenie DNA i • możliwa eliminacja miejsc restrykcyjnych przy połączeniu wektora ligazy i obcego DNA • możliwe tandemowe inserty • tło klonów nierekombinantów niskie, Otrzymanie maksymalnej miejsca restrykcyjne są zwykle zachowane wydajności ligacji wymaga oczyszczenia • możliwe tandemowe inserty wektora po cięciu • obce DNA jest klonowane tylko w dwoma enzymami jednej orientacji • miejsca restrykcyjne są zwykle zachowane Liniowe DNA wektora • możliwe tandemowe inserty trzeba traktować • obcy DNA może być wklonowany w fosfatazą każdej orientacji Alkaliczna fosfataza AP • 3 typy alkalicznej fosfatazy: – BAP – bacterial AP –najbardziej aktywna – najtrudniejsza do inaktywacji – CIP – calf intestinal AP – inaktywacja prot.K lub 65C 1godz z 5mM EDTA – SAP – shrimp AP – wrażliwa na temp. łatwa inaktywacja 65C przez 15’ • Katalizuje reakcję usunięcia grupy fosforanowej końca 5’ DNA, RNA, rNTPs, dNTPs Alkaliczna fosfataza - zastosowanie Usuwanie grupy fosforanowej z końca 5’ DNA lub RNA przed znakowaniem końców 32P za pomocą kinazy polinukleotydowej T4 Usuwanie grupy fosforanowej z końca 5’ DNA by nie dochodziło do autoligacji (samozamykania się) DNA np. plazmidu Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów α – komplementacja / blue-white screening 2 nieaktywne fragmenty β-galaktozydazy łączą się tworząc aktywny enzym – – fragment genu kodujący pierwsze 146aa w plazmidach + miejsce klonowania bakteria na chromosomie 2 fragment genu enzym rozkłada X-gal – kolonie są niebieskie Jeżeli dojdzie do wbudowania się insertu – N terminalny fragment białka nie jest zdolny do komplementacji - nie ma aktywnej β-galaktozydazy – kolonie są białe Identyfikacja zrekombinowanych plazmidów • E.coli ccdB (control of cell death) – białko CcdB blokuje gyrazę DNA (topoizomerazę II) która uczestniczy w naprawie DNA – gdy komórka produkuje CcdB gyraza jest blokowana, komórka nie jest w stanie naprawić DNA i umiera - umieszczenie tego genu w MCS (miejscu do klonowania) powoduje że gdy insert się nie wbuduje dochodzi do wytworzenia białka CcdB i komórka posiadająca plazmid bez insertu umiera - obecność insertu w obszarze MCS powoduje przerwanie genu CcdB, gyraza nie jest blokowana, komórka normalnie rośnie Przygotowanie i transformacja kompetentnych komórek E.coli • Kompetencja do transformacji - stan komórki polegający na zdolności do absorbcji obcego DNA • Metoda chemiczna (Heat shock) - metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca traktowaniu bakterii zimnym CaCl2 (na lodzie) i szybkim podgrzaniu do 42C • Elektroporacja - metoda transformacji komórek bakteryjnych polegająca na odwracalnej destabilizacji błony komórkowej z wytworzeniem w niej porów, zachodzącej pod wpływem pola elektrycznego o wysokim napięciu. TRANSFORMACJA - METODY Heat - shock • komórki kompetentne - 0,1M CaCl2 Elektroporacja • komórki kompetentne w 10% glicerolu • aparat do elektroporacji np. BIO-RAD + kuwety • mieszanina ligacyjna + komórki kompetentne/ 20’ 0oC • mieszanina ligacyjne + kom. kompetentne /1’ 0oC • 1,5’ 42oC =heat shock 5’ lód (przerwanie reakcji) • puls elektryczny ~5ms/ 1,51,8kV • + 1 ml LB/ 60’ 37oC • + 1 ml SOC / 60’ 37oC Jaka jest i od czego zależy wydajność transformacji? • • • • • • • • 105 - 1010 transformowanych komórek na 1ug DNA plazmidowego szczepu bakterii (kompetencji= przygotowanie komórek) fazy wzrostu pobranych komórek ilości i wielkości DNA użytego do transformacji długości pulsu elektrycznego (heat shock’u) jakości pożywki na jaką wysiewa się transformanty temperatury szybkości i sprawności wykonania
