III. Budowa komórki bakteryjnej, metody barwienia, zasady

III. Budowa komórki bakteryjnej, metody barwienia, zasady
mikroskopowania i morfologia bakterii
Ćwiczenie 1. Wykonanie preparatu barwionego metodą Grama.
Zasada metody: Technika barwienia Grama składa się z następujących czynności:
1. Barwienie podstawowe roztworem fioletu krystalicznego – wszystkie bakterie zostają
wybarwione na fioletowo pod wpływem tego barwnika zasadowego.
2. Utrwalenie płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) – jod w połączeniu z fioletem
krystalicznym tworzy w komórkach kompleksy krystaliczne fiolet-jod.
3. Odbarwienie (alkohol etylowy lub mieszanina alkohol etylowy-aceton) – kompleksy
fioletu krystalicznego zostają wymyte u niektórych bakterii, inne pozostają zabarwione.
4. Dobarwienie barwnikiem kontrastowym (fuksyna karbolowa, safranina) – ten barwnik
zasadowy powoduje ponowne wybarwienie na czerwono (safranina) lub na różowo
(fuksyna) bakterii pozbawionych koloru podczas odbarwiania.
Przygotowanie szkiełka podstawowego
1. Szkiełko podstawowe odtłuścić poprzez natarcie jego powierzchni kawałkiem mydła
na sucho.
2. Wytrzeć mydło suchym kawałkiem ligniny.
3. Opalić w płomieniu palnika.
Wykonanie preparatu z hodowli płynnej
1. Zachowując zasady aseptyki pobrać z probówki hodowlę bakteryjną przy pomocy ezy
z oczkiem.
2. Wykonać ezą rozmaz na przygotowanym wcześniej szkiełku podstawowym.
3. Wysuszyć.
Wykonanie preparatu z hodowli stałej
1. Na powierzchnię przygotowanego szkiełka podstawowego nanieść kroplę soli
fizjologicznej.
2. Jałową ezą pobrać materiał z jednej kolonii bakteryjnej.
3. Wykonać rozmaz zawieszając pobraną kolonię bakterii w kropli soli fizjologicznej,
starając się rozprowadzić preparat na powierzchni ok. 1-2 cm2.
4. Wysuszyć preparat w temperaturze pokojowej.
Utrwalanie preparatu
1. Preparaty utrwalić termicznie przeprowadzając trzykrotnie przez płomień palnika,
trzymając szkiełko podstawowe w szczypcach rozmazem do góry.
Nie przetrzymywać szkiełka w płomieniu!
2. Preparat ostudzić a następnie zabarwić.
Barwienie preparatu metodą Grama
1. Na utrwalony preparat nanieść fiolet krystaliczny, tak, aby całkowicie pokrył
powierzchnię z bakteriami – barwnik pozostawić na 2 minuty.
2. Spłukać fiolet krystaliczny wodą.
3. Nanieść na preparat płyn Lugola i pozostawić przez 1-2 minuty.
4. Spłukać wodą.
5. Spłukać obficie alkoholem etylowym (odbarwianie), a następnie wodą destylowaną.
6. Nanieść roztwór fuksyny karbolowej i pozostawić na 30 sekund.
7. Spłukać wodą i pozostawić preparat do wyschnięcia.
Ćwiczenie 2. Wykonanie barwienia prostego błękitem metylenowym wg Lőfflera.
Wykonanie: Przygotować preparat z hodowli stałej wg opisu z ćwiczenia 1.
Barwienie:
1. Na utrwalony preparat nanieść błękit metylenowy, tak, aby całkowicie pokrył
powierzchnię z bakteriami – barwnik pozostawić na 10 minut.
2. Spłukać wodą i pozostawić preparat do wyschnięcia.
Ćwiczenie 3. Wykonanie preparatu przyżyciowego w kropli wiszącej.
Ćwiczenie 4. Oglądanie preparatów mikroskopowych.
Zasada metody: Barwione preparaty bakterii oglądamy pod dużym powiększeniem, stosując
obiektyw imersyjny (100x) i olejek immersyjny. Olejek, wypełniający przestrzeń pomiędzy
preparatem a obiektywem mikroskopu, zwiększa zdolność rozdzielczą mikroskopu, gdyż jego
współczynnik załamania światła jest zbliżony do współczynnika szkła, z którego wykonana
jest soczewka.
Wykonanie:
1. Na szkiełko nanieść kroplę olejku imersyjnego.
2. Preparat umieścić na stoliku i zanurzyć obiektyw mikroskopu w olejku do uzyskania
oporu.
3. Ustawić ostrość, najpierw przy użyciu śruby makrometrycznej (oburącz!), a następnie
mikrometrycznej.
4. Po zakończeniu pracy, obiektyw mikroskopu należy przetrzeć watą, nasączoną
ksylolem (mieszaniną ksylenu i alkoholu etylowego), w celu oczyszczenia z olejku
imersyjnego!
bakterie Gram-dodatnie są zabarwione na fioletowo
bakterie Gram-ujemne są zabarwione na różowo
A. Preparaty przygotowane w ramach ćwiczenia 1 i 2.
a. Preparat bawiony metodą Grama
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
b. Preparat barwiony błękitem metylenowym wg Lőfflera
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
B. Preparaty trwałe
a. Preparat barwiony metodą pozytywno-negatywną – obecność otoczek
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
b. Ziarenkowce Gram-dodatnie układające się w dwoinki
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
c. Laseczki – preparat ze śledziony barwiony metodą Lőfflera
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
d. Krwinki i bakterie
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
e. Drożdże w plwocinie
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………