Wstęp do radiobiologii Wykład 2 – radiobiologia komórkowa

Wstęp do radiobiologii
Wykład 2 – radiobiologia komórkowa
DNA jest komórkową tarczą
dla promieniowania jonizującego
aparat
Golgiego
6%
jądro
siateczka 6%
śródplazmatyczna
9%
błona
komórkowa
lizosom
1%
endosom
1%
rybosom
cytoplasma
mitochondrium
22%
54%
Częstości popromiennych i spontanicznych uszkodzeń DNA
Dawka 1 Gy wywołuje ~100,000 jonizacji w komórce
rodzaj uszkodzenia
uszkodzenia w komórce
na 1 Gy
uszkodzenia spontaniczne
w komórce na godzinę
pęknięcie podwójnoniciowe
40
<1
pęknięcie pojedynczoniciowe
1000
5000
utrata zasady
950
1500
uszkodzenie zasady
950
1250
popromienne uszkodzenia DNA
promienie X, gamma, beta
neutrony, protony, ciężkie jony
pojedynczoniciowe
Einzelstrangbruch
Doppelstrangbruch
pęknięcie DNA
podwójnoniciowe
pęknięcie DNA
uszkodzenie
Basenschaden
zasady DNA
Einzelstrangbruch
O
OH
pojedynczoniciowe
Indirekte Wirkung
pęknięcie DNA
.
(OH Radikal)
H
rodnik
H2 O
Radiolyse
radioliza
H
.
rodnik
(hydratisierter Wasserstoff)
tlen potęguje efekt pośredni:
H. + O2
HO2.
2 HO2.
H2O2 + O2
2 HO2. + H.
H2O2
Ciąg zdarzeń w napromienionej komórce
• Uszkodzenia pośrednie i bezpośrednie
• Wychwyt wolnych rodników przez zmiatacze
• Rozpoznanie uszkodzeń DNA
• Zatrzymanie cyklu i naprawa uszkodzeń DNA
lub skierowanie komórki na drogę apoptozy
Radioochraniacze, czyli zmiatacze wolnych rodników
glutation
Glu
Cys
Gly
atak przez rodnik .OH
GSH + .OH
H2O + GS.
powstaje disulfid glutationu
GS. + GS.
SH
grupa tiolowa
H2O
GSOH
GS.
H2O2
RH
.
R
peroksydaza
glutationowa
GSH
reduktaza
glutationowa
NADP+ + H+
NADPH
GSSG
ATP
ADP + P
elektrofilowe
Q-X ksenobiotyki
HX
transferaza
glutationowa
GS-Q
GSSG
Pierwszy krok w naprawie DNA: rozpoznanie uszkodzenia
(mocno uproszczone!)
białka genów supresorowych
białka onkogenów
aktywacja
supresja
Atm
p53
Puma
Noxa
Bax
Mdm2
Waf1
Rb
zatrzymanie
zatrzymaniewwcyklu
cyklu
Bcl2
śmierć
śmierćapoptotyczna
apoptotyczna
naprawa
naprawaDNA
DNA
Drugi krok w naprawie DNA:
mechanizmy naprawy
ale najpierw trochę o
cyklu komórkowym...
Chromatyna ulega
dekondensacji
Chromatyna
rozluźniona
Chromatyna ulega
kondensacji
Chromatyna
spakowana
+
G1
S
G2
M
Naprawa DNA: schemat głównych szlaków
ssb
bd
ssb
bd
ssb - single strand break
bd - base damage
dsb - double strand break
rodzaje uszkodzeń DNA:
dsb
uszkodzenia letalne – subletalne – potencjalnie letalne
naprawa z wycięciem
uszkodzenie w
S / G2
pojęcia
operacyjne wprowadzone do wytłumaczenia zjawiska
przy użyciu
wzrostu
odporności na promieniowanie przez:
komplementarnej
uszkodzenie w
G1
nici DNA jako matrycy
1.
rozbicie dawki na frakcje (Elkind repair)
naprawa szybka i wierna
2. przez trzymanie komórek po naprawa
napromienieniu
w warunkach
rekombinacyjna
naprawa przez sklejenie
BERsuboptymalnych
- base excision repair
(liquid holding)
powodujących
przy użyciu
chromatydy zatrzymanie
wolnych końców DNA
NER - nucleotide excision repair
siostrzanej
jako
matrycy
w cyklu.
NMRkomórek
- nucleotide mismatch
repair
po ich nadtrawieniu
naprawa stosunkowo
naprawa stosunkowo
W
przypadkach
komórka zyskuje
czas
na naprawę uszkodzeń!
ssbobu
i bd powstają
w komórkach
powolna
ale wierna
spontanicznie z częstością
około 8000 / komórkę / godzinę
powolna i błędna
HRR - homologous
recombination repair
NHEJ - non homologous
end joining
Pomiar naprawy DNA - test kometowy
(elektroforeza pojedynczych komórek)
0 min
15 min
długość ogona
20
30 min
kinetyka naprawy w czasie
10
0
180 min
180
0
czas naprawy (min)
głowa
ogon
Naprawa DNA jest przestrzennie uporządkowana
"ogniska" z udziałem białka Rad51 (białko naprawy HRR)
B.C. Godthelp, M. Zdzienicka i wsp., Nucleic Acid Research 30, 2002
bez
traktowania
komórki V79B
(dzikie - wt)
komórki CL-V4B
mutanty rad51c
komórki CL-V4B z
skomplementowanym
genem rad51c
traktowane
mitomycyną C
traktowane
promieniami X
ogniska
brak
ognisk
ogniska
Poziom podwójnoniciowych
pęknięć DNA można mierzyć
badając ogniska gamma-H2AX
M. Löbrich et al.
Kinetyka powstawania ognisk w jądrze komórki
napromienionej światłem laserowym
Naprawa DNA nie zawsze przebiega w sposób
bezbłędny...
schemat powstawania popromiennych aberracji chromosomowych
może prowadzić
do procesu
nowotworzenia
prowadzi do śmierci
komórki
dicentryk
fragmenty
acentryczne
translokacja
Komórka z chromosomem dicentrycznym
ace
dic
Jeszcze trochę o cyklu i podziale mitotycznym...
Podział chromosomu podczas mitozy
podział chromosomu
na dwie chromatydy
M
G0
G1
G2
cytoplazma
jądro
S
wrzeciona
mitotyczne
Schemat powstawania mikrojąder popromiennych
wrzeciono mitotyczne
fragment acentryczny
mikrojądro
mikrojądra są przyczyną śmierci mitotycznej komórki
Komórki dwujądrzaste z mikrojądrami
Mn
Mn
Rzut oka na całość: los komórki napromienionej
Gy
po wysokiej dawce
A
DN
a
raw
a
nap błędn
bez
na
pr
aw
a
błę
dn DNA
a
efekt
somatyczny
komórka z uszkodzonym DNA
komórka zdrowa
brak
efektu
śmierć
nekrotyczna
niestabilne
aberracje
chromosomowe
mikrojądra
śmierć mitotyczna
efekt
somatyczny
stabilne
aberracje
chromosomowe,
mutacje
tor
mutacyjny
nowotwór
efekt
kancerogenny
śmierć apoptotyczna
brak efektu
w komórkach
rozrodczych
efekt
genetyczny
efekt
somatyczny
Dlaczego i w jaki sposób umierają
komórki z uszkodzonym DNA?
śmierć mitotyczna
śmierć interfazalna
śmierć jest konsekwencją błędów
podczas podziału komórkowego
komórka umiera zanim zdoła
się podzielić
śmierć apoptotyczna
komórka umiera ponieważ włącza
program autodestrukcji
śmierć nekrotyczna
komórka umiera ponieważ traci zdolność
do zachowania równowagi
wodno-elektrolitowej
Historia hodowli tkankowej
Alexis Carrel (1873 – 1944) chirurg francuski
Laureat nagrody Nobla
1912 – hodowla tkanki sercowej wyizolowanej z
18-dniowego zarodka kurczaka – do 1946.
Hodowla w osoczu krwi zwierzęcej
Scientific Amercian January 1942
1951: pierwsza stała linia komórkowa HeLa
Założona przez George’a i Margaretę Gey
Wyizolowana z wycinka nowotworu szyjki macicy
Henrietty Lacks
Komórki HeLa
Ważny punkt końcowy w radiobiologii: ocena przeżywalności komórek
Test przeż ywalności - schemat eksperymentu
komórki w hodowli
trypsyna
2 Gy
1 Gy
0 Gy
3 Gy
rozsianie
zawiesina
komórek
100
300
400
inkubacja: 1 - 2 tygodnie
frakcja przeżywalności (SF)
SF =
200
liczba kolonii
liczba komórek x PE/100
PE = wydajność klonowania
liczba kolonii:
wydajność klonowania:
frakcja przeżywalności:
70
70%
1
60
0,42
50
0,23
40
0,14
Pierwsza krzywa przeżywalności
Puck i Markus, 1956
skala log
ramię krzywej (shoulder)
eksponencjalna
część krzywej
krzywa przeżywalności
DQ = miara szerokości ramienia
DQ
1
D0 = miara promieniowrażliwości
= dawka, która powoduje obniżenie
przeżywalności do e-1
= do 37% mierzonej na prostej
Przeżywalność
krzywa 1
D = 0,6 Gy
0
krzywa 2
D0 = 1,5 Gy
0,1
duże D0
0,037
D0
małe D0
0
1,0
D0
2,0
3,0
Dawka (Gy)
4,0
5,0
Jak wytłumaczyć eksponencjalną
część krzywej?
Prawdopodobieństwo przeżycia komórek nie
trafionych jako funkcja średniej liczby trafień
na komórkę
Według równania Poissona:
P(0) = e-λ
liczba trafień w komórkę
(λ = średnia trafień na komórkę)
zależność dawka-efekt
liczba trafień w komórkę
liczba trafień w komórkę
Modele wyjaśniające przebieg krzywej
Model wysyconej naprawy (repair saturation model)
DQ = miarą zdolności naprawy uszkodzeń subletalnych
naprawa sprawna
ale nie w 100%
=> część komórek ginie
naprawa
naprawa
naprawa wysycona
=> przeżywalność zależy
od liczby trafień
Modele wyjaśniające przebieg krzywej
Model liniowo-kwadratowy (LQ model, Douglas and Fowler 1976)
P(0) = e
(-αD - βD2)
uszkodzenia typu one-hit (zależność liniowa)
– prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D
uszkodzenia typu two-hit (zależność liniowo-kwadratowa)
– prawdopodobieństwo wystąpienia zależy od D2
Dose (Gy)