Rola przeszczepienia autologicznych krwiotwórczych komórek

PRACA ORYGINALNA
Original Article
Acta Haematologica Polonica
2006, 37, Nr 3 str. 373–386
MARTA ZUBKOWICZ, BARBARA CEBULA, ANNA LINKE, AGNIESZKA JANUS,
TADEUSZ ROBAK, PIOTR SMOLEWSKI
Cytotoksyczne działanie rapamycyny, inhibitora kinazy mTOR,
stosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z bortezomibem,
inhibitorem proteasomu, na komórki szpiczaka mnogiego
in vitro
Cytotoxic activity of rapamycin, the mTOR kinase inhibitor, used alone or in
combination with bortezomib, proteasome inhibitor, on multiple myeloma cells
in vitro
Klinika Hematologii Instytutu Medycyny Wewnętrznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. med. Tadeusz Robak
SŁOWA KLUCZOWE: Szpiczak mnogi – Bortezomib – Proteasom – Rapamycyna – Kinaza mTOR –
Komórki RPMI 8226
KEY WORDS:
Multiple myeloma – Bortezomib – Proteasome – Rapamycin – mTOR kinase –
– RPMI 8226 cells
STRESZCZENIE: W ostatnich latach do terapii chorób nowotworowych, w tym szpiczaka mnogiego
(multiple myeloma, MM), wprowadzono koncepcję leczenia biologicznego, skierowanego na ważne
mechanizmy regulacyjne, decydujące o przeżyciu lub śmierci komórki guza. Jednym z przedstawicieli tej
grupy leków jest specyficzny inhibitor proteasomu, bortezomib (BOR), ostatnio coraz częściej testowany
w MM w skojarzeniach z innymi lekami przeciwnowotworowymi. Z drugiej strony, bardzo obiecujące
wydaje się hamowanie kluczowego dla wzrostu i proliferacji komórki szlaku kinazy mTOR. Do inhibitorów mTOR należy rapamycyna (RAPA), która nie była dotąd stosowana w MM.
Przedmiotem pracy była ocena efektu cytotoksycznego RAPA, stosowanej osobno oraz w skojarzeniu
z BOR, na komórki linii szpiczakowej RPMI 8226 in vitro. W 24-godzinnych hodowlach komórki te inkubowano z różnymi stężeniami RAPA i BOR. Badano efekt cytotoksyczny leków (odsetek komórek dodatnich w barwieniu z jodkiem propydyny; JP+), ich wpływ na indukcję apoptozy oraz na cykl komórkowy.
Określano także ekspresję białek związanych z kinazą mTOR [Akt, ph-Akt, p70(S6K1), ph-p70(S6K1),
4E-BP1] oraz wybranych białek regulujących proces apoptozy z rodziny Bcl-2 (Bcl-2 i Bax) oraz p53
(p53 i p73).
Cytotoksyczny efekt RAPA i BOR na komórki MM in vitro był zależny od dawki. Obydwa leki znamiennie indukowały apoptozę komórek RPMI 8226. Wykazano wysoki stopień korelacji pomiędzy odsetkiem
komórek JP+ a odsetkiem komórek apoptotycznych (frakcja subG1) (R=0,87 dla RAPA, R=0.92 dla BOR;
dla obydwu leków p<0.001). W przypadku RAPA obserwowano także zahamowanie cyklu komórkowego
w fazie G1, z zablokowaniem progresji do fazy S i G 2M. Połączenie 1nM BOR z 100nM RAPA powo-dowało statystycznie znamienny wzrost cytotoksyczności w porównaniu do leków stosowanych osobno (p <
0.05). Efekt ten w głównej mierze polegał na zahamowaniu ekspresji czynnika transkrypcyjnego 4E-B-
118
M. ZUBKOWICZ i wsp.
P1 (p<0.031 w stosunku do kontroli). Ponadto, zarówno BOR jak i RAPA zwiększały ekspresję białek p73
oraz p53, jednak kombinacja tych leków nie zwiększała dalej tego efektu. Nie stwierdzono statystycznie
istotnych zmian w ekspresji białek z rodziny Bcl-2 pod wpływem skojarzonego działania RAPA i BOR.
Wyniki te wskazują na znamienną cytotoksyczność łącznego stosowania RAPA i BOR na szpiczakowe
komórki RPMI 8226. Potencjalna korzyść ze skojarzonego stosowania RAPA i BOR w MM wymagała
jednak potwierdzenia w dalszych badaniach.
SUMMARY: In the recent years the concept of biological, targeted treatment of malignancies has been
introduced. Among the biological drugs a specific proteasome inhibitor - bortezomib (BOR), has been
found to be very active in multiple myeloma (MM). It is now being often tested in MM for combinations
with other drugs. Targeting the mTOR kinase pathway, important for the cell growth and proliferation, is
another very promising anti-tumor approach. One of the mTOR inhibitors is rapamycin (RAPA), which
has not been used in MM so far.
We investigated cytoxic effect of RAPA alone or in combination with BOR on MM-derived RPMI 8226
cell line in vitro. Cells were treated for 24 hours with different concentrations of RAPA and BOR. Cytotoxicity (percentage of cells positive in propydium iodide staining; PI+ cells), apoptosis (hypoploid, subG1
fraction in a DNA content histogram) and cell cycle were assessed. Additionally, we measured expression
of several proteins associated with the Akt-mTOR kinase pathway [Akt, ph-Akt, p70(S6K1), php70(S6K1), 4E-BP1] as well as apoptosis-regulating proteins from Bcl-2 and p53 families (Bcl-2, Bax,
p53 and p73).
Cytotoxic effect of RAPA and BOR in vitro was dose-dependent. Both drugs significantly induced apoptosis of RPMI 8226 cells. There was a high correlation between the rate of PI+ and apoptotic cells
(R=0,87for RAPA and R=0.92 for BOR; both p<0.001). RAPA arrested RPMI 8226 cells in G1 phase of
the cell cycle and inhibited progression to S and G2M phases. Combination of 1nM of BOR and 100nM of
RAPA induced significant increase in cell cytotoxicity compared to those drugs used alone (p<0.05). The
combination inhibited expression of transcription factor 4E-BP1 (p<0.031 vs control). Moreover, both
RAPA and BOR increased expression of p53 and p73, however their combined use did not further enhance this effect. We did not observe any significant changes in Bcl-2 family protein expression in response to RAPA+BOR combination.
In conclusion, the results indicate a significant toxicity of combined treatment of RAPA and BOR on
MM-derived cells. This finding needs confirmation in further studies.
Szpiczak mnogi (MM) jest nowotworowym, klonalnym rozrostem patologicznych
plazmocytów, które produkują jeden typ immunoglobuliny bądź jej łańcucha lekkiego.
Przez wiele lat standardem w tej chorobie była terapia melfalanem, stosowanym w połączeniu z prednizonem, lub polichemioterapia, w tym najpopularniejszy w ostatnich
latach program VAD (wikrystyna, adriamycyna, deksametazon). Konsolidacja za pomocą wysokodawkowanej chemioterapii z następowym przeszczepieniem komórek
macierzystych spowodowała poprawę odpowiedzi i wydłużenie czasu przeżycia chorych na MM, jednak choroba pozostaje nieuleczalna. Dlatego trwają intensywne poszukiwania nowych sposobów skutecznej terapii. Obecnie wiele nadziei wiąże się ze
specyficznym inhibitorem proteosomu, bortezomibem (BOR). Lek ten został zarejestrowany do leczenia chorych na oporną i/lub nawrotową postać MM (1–3). Pomimo
niewątpliwej aktywności BOR u większości chorych, monoterapia nie pozwala na uzyskanie istotnej i trwałej odpowiedzi (4). Dlatego wciąż poszukuje się nowych, skuteczniejszych metod leczenia, między innymi kojarząc BOR z cytostatykami lub innymi lekami biologicznymi. Korzystne efekty przeciwnowotworowe różnych skojarzeń BOR,
Cytotoksyczne działanie rapamycyny
119
między innymi z deksametazonem, wykazano w szeregu badań przedklinicznych i klinicznych (4–6).
Szlak sygnalizacji wewnątrzkomórkowej poprzez kinazę serynowo-treoninową
mTOR odgrywa nadrzędną rolę w kontroli cyklu komórkowego i proliferacji. Dlatego
też hamowanie mTOR za pomocą specyficznych inhibitorów, do których należy rapamycyna (RAPA), stanowi w ostatnich latach jedną z najbardziej obiecujących metod
leczenia przeciwnowotworowego (7). RAPA nie była dotychczas stosowana w MM,
a w piśmiennictwie istnieje tylko jedno doniesienie dotyczące efektu jej skojarzenia
z BOR in vitro (8). Wpłynęło to na podjęcie przez nas badań, których celem była ocena
efektu cytotoksycznego RAPA, stosowanej osobno oraz w skojarzeniu z BOR, na komórki MM w warunkach in vitro. Ponadto w pracy podjeliśmy próbę określenia mechanizmów działania RAPA, BOR oraz ich kombinacji.
MATERIAŁY I METODYKA
Hodowle komórkowe
Materiał do badań stanowiły komórki linii szpiczakowej RPMI 8226 (ATCC,
USA). Hodowle komórkowe zakładano na 48-studzienkowych płytkach lub w 25 ml
i 75 ml naczyniach hodowlanych (Nunc, Dania). Wszystkie doświadczenia przeprowadzono ze stężeniem komórek w hodowli na poziomie 0,45–0,5×106/ml, a żywotność ich nie była mniejsza niż 90%. Komórki hodowano w medium RPMI 1640 z dodatkiem 20% surowicy bydlęcej i 3 ml L-glutaminy oraz 5 ml antybiotyku (streptomycyna lub penicylina). Hodowle prowadzono w cieplarce w 370C, w atmosferze wzbogaconej o 5% CO2.
Komórki RPMI 8226 inkubowano z RAPA (sirolimus, Dako, Dania) oraz BOR
(VELCADE, Millenium Pharmaceuticals, USA), stosując powyższe leki pojedynczo
oraz w skojarzeniu. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w hodowlach 24-godzinnych. Kontrolę w poszczególnych badaniach stanowiły komórki hodowane równolegle bez dodatku leków. Każde doświadczenie powtarzano od 3 do 7 razy.
Po serii wstępnych doświadczeń, w głównej części badań stosowano następujące
stężenia leków: RAPA w dawkach 1nM-100nM, BOR w dawkach 1nM–10nM.
Ocena żywotności komórek
Oceny cytotoksyczności dokonywano w oparciu o pomiar ich żywotności przed założeniem hodowli oraz po inkubacji z lekami, przy użyciu jodku propydyny (JP). JP
jest kationowym związkiem wykazującym autofluorescencję, który jest aktywnie eliminowany przez komórki zdrowe (JP-ujemne, JP-), z zachowaną integralnością błony
komórkowej. Natomiast komórki ginące w mechanizmie apoptozy bądź martwicy nie
są w stanie uwolnić JP do środowiska zewnętrznego (JP-dodatnie, JP+). Badane próbki
płukano dwukrotnie, zawieszając je w 5ml PBS (Sigma Aldrich, Niemcy) i odwirowując przez 5 minut przy 1100 obrotów/minutę. Następnie komórki zawieszano w mieszaninie 50µl PBS i 10µl JP (Sigma-Aldrich, Niemcy). Po 10 minutowej inkubacji
w temperaturze pokojowej, w ciemności, oceniano żywotność komórek przy użyciu
120
M. ZUBKOWICZ i wsp.
cytometru przepływowego. Żywotność była oceniana w odniesieniu do odpowiednich
kontroli, czyli komórek hodowanych równolegle bez dodatku leku.
Ocena apoptozy oraz cyklu komórkowego
Apoptozę oraz cykl komórkowy badano w oparciu o analizę rozkładu DNA w komórce (9). Indeks apoptotyczny (IA) określano na podstawie odsetka komórek
o zmniejszonej zawartości DNA (frakcja hypoploidalna, tzw. subG1). W trakcie tej samej analizy określano odsetek komórek w fazie G1, S oraz G2M cyklu komórkowego.
W tym celu używano komórek, które po inkubacji z lekami zostały utrwalone w 85%
alkoholu etylowym (przez 30 minut w temperaturze 00C), a następnie przechowywano
w temperaturze -200C. Przed barwieniem komórki płukano dwukrotnie w 5 ml PBS i
wirowano w opisanych wyżej warunkach. Po odwirowaniu każdej z próbek dodawano
po 1 ml mieszaniny 5ng/ml JP oraz 100 ng/ml RNA-azy w PBS (Sigma Aldrich, Niemcy) inkubując je następnie przez 30 min w temperaturze pokojowej, w ciemności. Bezpośrednio po inkubacji dokonywano pomiarów fluorescencji komórek w cytometrze
przepływowym.
Badanie ekspresji białek
Ekspresję białek szlaku Akt/mTOR oraz białek regulujących apoptozę badano
w komórkach, które po hodowli z lekami utrwalono w 1% formaldehydzie (inkubując
je przez 15 minut, w temperaturze 40C), a następnie w 85% alkoholu (30 minut w 00C)
i przechowywano w temperaturze –200C. W celu dodatkowej permabilizacji, po dwukrotnym przepłukaniu w PBS i odwirowaniu (5 minut przy 1100 obrotów/min) komórki inkubowano dodatkowo z 0,25% Triton-100 (5 minut w temperaturze 4 0C). Po
ponownym odpłukaniu w PBS przystępowano do inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami.
Badanie ekspresji białek szlaku mTOR
Oceniano ekspresję następujących białek: Akt, fosforylowanego Akt (ph-Akt),
p70(S6K1), fosforylowanej formy p-70(S6K1) [ph-p70(S6K1)] oraz 4E-BP1 za pomocą odpowiednich przeciwciał I-rzędowych (przeciwciała królicze; wszystkie białka
z Cell Signalling, USA). Przeciwciała anty-ph-Akt, anty-p70(S6K1), anty-php70(S6K1) i anty-4E-BP1 dodawano w rozcieńczeniu 1:25, natomiast przeciwciało anty-Akt w rozcieńczeniu 1:50. We wszystkich przypadkach inkubację prowadzono
przez 30 minut, w ciemności, w temperaturze pokojowej. Po dwukrotnym przepłukaniu w PBS i odwirowaniu do próbek (w podanych wyżej warunkach) dodawano przeciwciało II-rzędowe (anty-królicze; Dako, Dania) w rozcieńczeniu 1:20, a następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Po ponownym płukaniu komórek w PBS dokonywano pomiarów fluorescencji przy użyciu cytometru
przepływowego.
Badanie ekspresji wybranych białek regulujących apoptozę
Oceniano ekspresję wybranych białek regulujących apoptozę z rodzin Bcl-2 (Bcl-2,
Bax) oraz p53 (p53 i p73). W tym celu używano następujące rozcieńczenia odpowiednich przeciwciał I-rzędowych: mysie anty-Bcl-2 (Sigma Aldrich, Niemcy) – 1:15, kró-
Cytotoksyczne działanie rapamycyny
121
licze anty-Bax (Dako, Dania) – 1:400 oraz mysie anty-p53 (Sigma Aldrich, Niemcy)
i anty-p73 (Dako, Dania) – 1:30. Próbki inkubowano przez 60 minut w temperaturze
pokojowej, w ciemności. Rozcieńczenia wszystkich przeciwciał przygotowywano w
PBS z dodatkiem 1% surowicy bydlęcej (BSA). Następnie, po odpłukaniu
w PBS/BSA, w zależności od typu użytego przeciwciała I-rzędowego dodawano przeciwciało II-rzędowe anty-królicze lub anty-mysie (obydwa Dako, Dania) w rozcieńczeniach 1:20 (30 minut, w temperaturze pokojowej, w ciemności). Po ponownym płukaniu komórek w PBS/BSA mierzono ekspresję białek przy użyciu cytometru przepływowego.
Pomiar cytometryczny
Wszystkie pomiary fluorescencji wykonywano za pomocą cytometru przepływowego FASCalibur (Becton Dickinson, USA), analizując dane za pomocą programu
komputerowego CellQuestPro (Becton Dickinson, USA). Przy pomiarach używano
standardowych filtrów: FL1 (barwa zielona, długość fali 515–545nm), FL2 (barwa pomarańczowa, długość fali 564–606 nm), FL3 (barwa czerwona, długość fali >650 nm).
W ocenie ekspresji białek regulujących apoptozę analizowano średnie wartości fluorescencji (mean fluorescence intensity, MFI). Podczas każdego pomiaru cytometrycznego w jednej próbce mierzono fluorescencję 10000 komórek.
Analiza statystyczna
W celu przeprowadzenia analizy wyliczano wartości średnie, mediany oraz odchylenia standardowe. Dla porównania wyników uzyskanych w próbkach kontrolnych
oraz poddanych działania leków zastosowano testy nieparametryczne: test Mann Whitney’a oraz test par Wilcoxon’a. Dla oceny stopnia korelacji pomiędzy wybranymi parametrami używano test korelacji rang Spearmana. Wszystkie obliczenia statystyczne
wykonano za pomocą programu Statistica 7.0. Wartości p mniejsze niż 0.05 przyjmowano za istotne statystycznie.
WYNIKI
Ocena cytotoksycznego działania RAPA i BOR na komórki szpiczakowe
Cytotoksyczność badanych leków była oceniana na podstawie 24-godzinnych hodowli komórek linii szpiczakowej RPMI 8226 z różnymi dawkami leków. Na tej podstawie ustalono stężenia RAPA i BOR optymalnych do przeprowadzenia dalszych
eksperymentów.
Cytotoksyczność RAPA zwiększała się wraz z dawką leku, osiągając różnicę istotną statystycznie w odniesieniu do kontroli dopiero przy stężeniu 100nM (28.6%±8,0%;
p= 0.006) (Tab. 1).
Cytotoksyczny efekt BOR na komórki RPMI 8226 był wyraźny już przy niskich
dawkach leku. Znamienny efekt cytotoksyczny w porównaniu do kontroli uzyskano
począwszy od dawki 1nM (20.2%±7.1%; p=0.032) (Tab.1).
122
M. ZUBKOWICZ i wsp.
Tabela 1. Cytotoksyczność różnych dawek BOR i RAPA, oceniana jako odsetek komórek dodatnich
w barwieniu z jodkiem propydyny (JP+). Podane wartości stanowią różnicę pomiędzy odsetkiem komórek
JP+ obecnych w próbkach inkubowanych z badanymi lekami oraz w równoległych próbkach kontrolnych
Table 1. Cytotoxicity of different doses of RAPA and BOR assessed as a percentage of propydium iodide
(PI) – positive (PI+). Presented rates of PI+ cells are compensated by the percentage of PI+ found in the
parallel negative controls
Dawka leku
(nM)
Cytotoksyczność
(% komórek JP+)
X±SD
RAPA 1 nM
4,6±4,0
RAPA 10 nM
10,9±6,4
RAPA 100 nM
28,6±8,0
BOR 1 nM
20,2±7,1
BOR 2,5 nM
22,7±8,1
BOR 10 nM
34,4±3,9
NS – brak istotności statystycznej (p>0.05)
X – średnia arytmetyczna, SD – odchylenie standardowe
P=
(lek vs. kontrola)
NS
NS
0.006
0.032
0.022
0.017
Wpływ RAPA i BOR na apoptozę i cykl komórkowy
Dawki 100nM RAPA oraz1nM BOR, optymalne dla uzyskania istotnego statystycznie efektu cytototoksycznego, zostały wybrane do dalszych doświadczeń. Stwierdzono znamienny wzrost odsetka komórek apoptotycznych (frakcja subG1 na histogramie DNA) w odpowiedzi na działanie zarówno 100nM RAPA jak i 1nM BOR. Wykazano wysoki stopień korelacji pomiędzy cytotoksycznością mierzoną odsetkiem komórek JP+ a procentem komórek apoptotycznych (dla RAPA: R=0,87, p<0.001; dla BOR:
R=0,92, p<0.001). Widoczny był także wpływ RAPA na zahamowanie fazy G 1 cyklu
komórkowego, a w konsekwencji na zahamowanie progresji do fazy S i G 2M. (Ryc.1,
Tab.2). BOR w badanej dawce wywoływał wzrost odsetka komórek frakcji subG1 wraz
ze spadkiem liczby komórek w fazie S. Wynika z tego, że cytotoksyczne działanie
BOR na komórki RMPI 8226 opiera się na indukcji apoptozy wybiórczo w fazie S cyklu komórkowego.
Ocena cytotoksyczności skojarzenia RAPA+BOR na komórki linii RPMI 8226
Cytotoksyczność skojarzenia RAPA+BOR była oceniana na podstawie hodowli
z różnymi dawkami leków. Stwierdzono wzrost liczby komórek JP-dodatnich pod
wpływem skojarzonego działania niższych dawek RAPA (1–10 nM) i BOR (1–10
nM), jednak wyniki te nie osiągnęły istotności statystycznej. Połączenie 100 nM
RAPA z 1nM BOR spowodowało statystycznie znamienny wzrost cytotoksyczności
w porównaniu do leków stosowanych osobno (p<0,05) (Ryc. 2).
Wpływ RAPA+ BOR na ekspresję białek szlaku Akt – mTOR
W szpiczakowych komórkach RPMI 8226 poddanych działaniu leków badano ekspresję białek szlaku mTOR (Akt, ph-Akt, p70(S6K1), ph-p70(S6K1), 4E-BP). Wykazano znaczący spadek ekspresji białka 4E-BP1 pod wpływem połączenia RAPA i BOR
Cytotoksyczne działanie rapamycyny
Liczba komórek
kontrola
RAPA
G1
123
BOR
subG1
subG1
S
G2M
0
200
400
600
F L 3 -A
800
1000 0
200
400
600
F L 3 -A
800
1000 0
200
400
600
F L 3 -A
800
1000
Zawartość DNA (fluorescencja JP)
Ryc. 1. Cytometryczny pomiar odsetka komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego. RAPA
w dawce 100nM powoduje wzrost apoptozy oraz wyraźne zahamowanie progresji do S i G2M cyklu komórkowego. BOR (1nM) powoduje zwiększenie odsetka komórek apoptotycznych (frakcja subG1), działając wybiórczo w fazie S cyklu komórkowego.
Fig. 1. Measurement of cell distribution in particular phases of the cell cycle. 100nM of RAPA induces
apoptosis and inhibits progression to S and G2M phases of the cell cycle.1nM of BOR induce apoptosis
(subG1 fraction), acting selectively in S phase of the cell cycle.
Tabela 2. Odsetek komórek linii RPMI 8226 w poszczególnych fazach cyklu komórkowego w odpowiedzi na działanie BOR i RAPA. Podano wartości średnie ± odchylenia standardowe.
Table 2. The percentage of RPMI 8226 cells in particular phases of cell cycle in response to RAPA. or
BOR. The mean values and standard deviations are presented.
Frakcja
Kontrola
RAPA
p=
BOR
p=
komórek
(%)
(%)
(lek vs. kontrola)
(%)
(lek vs. kontrola)
SubG1
9,9±4,5
21,1±17,8
0.01
16,5±5,5
0.037
G1
35,9±18,0
45,5±2,6
NS
37,8±12,7
NS
S
29,2±9,9
17,6±6,5
NS
21,9±11,3
NS
G 2M
19,6±8,7
7,2±4,8
0.003
17,5±8,6
NS
NS – brak istotności statystycznej (p>0.05)
X – średnia arytmetyczna, SD – odchylenie standardowe
(p<0.04), jednakże leki te zastosowane osobno nie powodowały statystycznie istotnych zmian w ekspresji tego białka.
Zaobserwowano jedynie nieznaczny spadek ekspresji białka Akt zarówno pod
wpływem samego RAPA i BOR jak i ich skojarzenia (NS). Nie stwierdzono także
istotnych zmian w ekspresji białek ph-Akt, p70(S6K1) i ph-p70(S6K1), mimo, że
RAPA indukowała niewielki spadek ekspresji zarówno p70(S6K1) i jak i php70(S6K1) w stosunku do kontroli (Tab. 3).
124
M. ZUBKOWICZ i wsp.
Tabela 3. Ekspresja białek szlaku Akt-mTOR w komórkach RPMI 8226 po 24-godzinnej inkubacji
z RAPA, BOR oraz ich kombinacji. Podano wartości średniej intensywności fluorescencji (MFI).
Table 3. Expression of Akt-mTOR pathway proteins after 24-hour incubation with RAPA, BOR or their
combinations. The mean fluorescence intensity (MFI) values are presented.
RAPA+ BOR
RAPA
RAPA+ BOR
Kontrola
BOR
Białko
vs. kontrola
X±SD
X±SD
X±SD
X±SD
P=
Akt
114.0±30,7
88,9±20,2
14O,4±29,0
109,7±17,8
NS
Ph-Akt
72,1±14,9
64,5±19,2
69,8±17,8
67±17,9
NS
p70(S6K1)
66,2±10,7
68,9±19,6
75,7±15,6
74,4±14,2
NS
Ph-p70(S6K1)
55,6±11,0
66,4±10,1
77,0±10,7
80,3±12,8
NS
4E-BP1
175,5±39,9
142,1±48,6
229,3±86,9
224,5±52,7
0.031
Cytotoksyczność (% komórek JP+)
NS – brak istotności statystycznej (p>0.05)
X – średnia arytmetyczna, SD – odchylenie standardowe
45
40
35
30
p=0.003
p=0.041
25
20
15
10
5
0
RAPA 100nM
BOR 1nM
BOR 1nM+RAPA 100nM
Ryc. 2. Cytoksyczność RAPA (w dawce 100nM) i BOR (w dawce 1nM) stosowanych w 24-godzinnych
hodowlach komórek RPMI 8226 pojedynczo i w skojarzeniu. Podane wartości stanowią różnicę pomiędzy
odsetkiem komórek JP+ w próbkach inkubowanych z badanymi lekami oraz w równoległych próbkach
kontrolnych.
Fig. 2. Cytotoxicity of 100nM of RAPA and 1nM of BOR in 24-hour cultures of RPMI 8226 cells. Presented rates of PI+ cells are compensated by the percentage of PI+ found in the parallel negative controls.
Wpływ RAPA+ BOR na ekspresję białek regulujących apoptozę
W kolejnej serii doświadczeń badano ekspresję głównych białek regulujących
apoptozę z rodzin Bcl-2 (Bcl-2 i Bax) oraz p53 (p53 i p73) w odpowiedzi na działanie
BOR, RAPA i ich skojarzenia.
Ekspresja Bcl-2 nieznacznie wzrosła w odpowiedzi na RAPA, jednak po skojarzeniu RAPA+BOR nie zaobserwowano istotnych zmian w stosunku do równolegle prowadzonych kontroli. Ekspresja Bcl-2 nie uległa zmianie także pod wpływem samego BOR. Nie obserwowano również znamiennego wzrostu ekspresji białka Bax
w komórkach inkubowanych z samym RAPA i BOR a także w ich połączeniu
(Ryc. 3).
Cytotoksyczne działanie rapamycyny
125
Ekspresja białka (MFI)
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrola
Bcl-2
RAPA
Bax
BOR
p53
BOR+RAPA
p73
Ryc. 3. Ekspresja białek regulujących apoptozę po 24-godzinnej ekspozycji komórek RPMI 8226 na
RAPA (100nM) i BOR (1nM) stosowane osobno oraz w skojarzeniu. Podano wartości średniej intensywności fluorescencji (MFI).
Fig. 3. Expression of Akt-mTOR pathway proteins after 24-hour incubation with of 100nM of RAPA and
1nM of BOR used alone or in the combination. Mean fluorescence intensity (MFI) values are presented.
Ekspresja p73 była wyższa w próbkach inkubowanych osobno zarówno z RAPA
jak i z BOR, natomiast połączenie tych leków nie spowodowało istotnych statystycznie
zmian w ekspresji tego białka.
Nie stwierdzono statystycznie istotnych zmian w ekspresji białka p53 w odpowiedzi na badane skojarzenie lekowe.
DYSKUSJA
Przedstawione wyniki wskazują na efektywność skojarzonego działania RAPA
i BOR in vitro na komórki szpiczakowe linii RPMI 8226. Wprawdzie RAPA w niskich
dawkach nie powoduje wyraźnego zwiększenia efektywności BOR, prawdopodobnie
w wyniku zahamowania progresji komórek nowotworowych do fazy S cyklu komórkowego, ale jej wyższe dawki znamiennie zwiększają cytotoksyczność BOR.
Niewiele jest doniesień na temat potencjalnego cytotoksycznego działania RAPA
na komórki szpiczakowe. W dostępnych w piśmiennictwie badaniach eksperymentalnych na komórkach z linii szpiczakowej stwierdzono, że RAPA wpływa hamująco na
ich proliferację (7, 10). Stwierdzono także synergizm działania przeciwnowotworowego na komórki MM RAPA w skojarzeniu z CC-5013 (revlimid) ( 11).
W przeprowadzonych badaniach wykazaliśmy wyraźny efekt cytotoksyczny
RAPA na komórki szpiczakowe. Pod wpływem dawki 100nM apoptozie ulegało około
126
M. ZUBKOWICZ i wsp.
30% komórek. Głównym mechanizmem działania RAPA w stosowanej dawce była
apoptoza. Stwierdzono także jej wyraźny wpływ na cykl komórkowy, w postaci zwiększenia odsetka komórek w fazie G1 oraz zahamowania progresji do fazy S cyklu.
Badania przedkliniczne z użyciem BOR potwierdziły jego wysoką aktywność przeciwnowotworową, polegającą na hamowaniu wzrostu komórek nowotworowych i indukcji apoptozy między innymi w raku płuc, prostaty, trzustki, jajników, w nowotworach głowy i szyi, w komórkach białaczkowych, a także w liniach szpiczakowych (12–
16). Szczególnie wysoką aktywność cytotoksyczną BOR stwierdzono w stosunku do
komórek MM (17).
Wykazano, że BOR blokuje proteolizę wewnątrzkomórkową i proliferację ko-mórek. Indukuje on apoptozę komórek nowotworowych na drodze zależnej od kaspaz
(18–21). Istnieją także doniesienia o aktywacji apoptozy niezależnej od kaspaz w wyniku działania tego leku. Stwierdzono aktywność BOR również w stosunku do komórek opornych na działanie tradycyjnych cytostatyków (5, 18). Ponadto stwierdzono, że
BOR hamuje angiogenezę komórek nowotworowych.
Wysoką aktywność przeciwnowotworową BOR stwierdzono w odniesieniu do komórek MM w badaniach przedklinicznych zarówno in vitro jak i in vivo (18, 19).
W badaniach przeprowadzonych na myszach z wszczepionym MM, opornym na deksametazon, wykazano wyraźne zahamowanie wzrostu nowotworu po podaniu BOR
(17). Leczenie to znamiennie przedłużało medianę czasu przeżycia w stosunku do grupy kontrolnej myszy nieleczonych. Badano także aktywność BOR w liniach komórkowych MM opornych na mitoxantron, melfalan, deksametazon i doksorubicynę. Wykazano, że BOR jest aktywny w tych komórkach, działając bezpośrednio cytotoksycznie,
hamując ich wzrost oraz indukując apoptozę (15).
W przeprowadzonych badaniach potwierdziliśmy cytotoksyczne działanie BOR na
komórki szpiczakowe. Już w dawce 1 nM, po 24-godzinnej inkubacji, BOR wywoływał apoptozę znamiennie wyższą niż w kontroli. Przy dawce BOR 10nM stwierdzano
w tych warunkach około 35% komórek apoptotycznych w hodowli komórkowej.
Przeprowadzono dotąd szereg badań nad aktywnością skojarzeń BOR z innymi lekami. Wykazano synergizm lub działanie addytywne kombinacji BOR z deksametazonem, analogami nukleozydów purynowych czy przeciwciałami monoklonalnymi, zarówno w stosunku do komórek szpiczakowych jak i innych nowotworów układu
krwiotwórczego (5, 15, 16).
W naszych badaniach ocenialiśmy efektywność skojarzenia RAPA i BOR. Połączenie 1nM BOR i 100 nM RAPA indukowało efekt cytotoksyczny w stosunku do komórek szpiczakowych, działając znamiennie silniej niż każdy z leków osobno. Kombinację BOR z RAPA badali dotychczas tylko Shi i wsp. (8). Autorzy ci wykazali, że
RAPA hamuje apoptozę komórek szpiczakowych indukowaną przez BOR. Jakkolwiek, w pracy tej stosowano jedynie niskie dawki RAPA (do 1nM). W tych dawkach,
jak wiadomo, RAPA wywołuje zahamowanie cyklu komórkowego w fazie G1, nie wykazując bezpośredniego wpływu na apoptozę. W tym kontekście wyniki badań własnych oraz Shi i wsp. (8) są zgodne. W naszej pracy wykazaliśmy natomiast po raz
pierwszy, że efekt RAPA na komórki MM jest zależny od dawki i w wyższych stęże-
Cytotoksyczne działanie rapamycyny
127
niach (100nM) indukuje ona w tym modelu doświadczalnym apoptozę. Jednocześnie
w dalszym ciągu zaznacza się hamujący wpływ tego stężenia RAPA na fazę G 1 oraz
progresję do dalszych faz cyklu komórkowego.
RAPA jest lekiem należącym do inhibitorów kinazy mTOR. Stwierdzono hamujący wpływ RAPA na ekspresję dwóch głównych przekaźników mTOR: białek transkrypcyjnych p70(S6K1) i 4E-BP1 (22, 23). Nasze badania wykazały zmniejszenie ekspresji p70(S6K1) i 4E-BP1 pod wpływem skojarzenia RAPA i BOR. Jednakże leki te
stosowane osobno hamowały istotnie jedynie ekspresję 4E-BP1. Nie stwierdzono
zmian dotyczących białka p70(S6K1) i jego fosforylowanej formy pod wpływem działania kombinacji RAPA+BOR.
Nadmierna ekspresja Akt jest stosunkowo często stwierdzana u chorych na nowotwory, szczególnie na raka okrężnicy, nowotwory skóry, prostaty, tarczycy i płuc (24).
Nadekspresję Akt wykazano także w komórkach linii szpiczakowych in vitro. Shi
i wsp. (8) stwierdzili, że w niektórych typach komórek RAPA powoduje wzrost aktywacji kinazy Akt w komórkach MM już w dawce RAPA wynoszącej 0,1 nM, co może
powodować oporność na działanie inhibitorów mTOR. Zjawisko to tłumaczy się pobudzeniem ekspresji Akt na zasadzie negatywnego sprzężenia zwrotnego pomiędzy
mTOR, S6K, IRS1 oraz Akt (7). Ci sami autorzy stwierdzili natomiast, że inhibitory
proteasomu nie wywołują aktywacji Akt. Nasze badania potwierdzają te doniesienia
tylko częściowo. RAPA nie spowodowała zmiany ekspresji zarówno Akt i ph-Akt.
Zgodnie z obserwacjami Shi i wsp. (8) nie stwierdzono natomiast wzrostu aktywności
Akt pod wpływem BOR.
W komórkach nowotworowych bardzo często obserwowane są zakłócenia w przekazywaniu sygnału indukującego apoptozę, co daje tym komórkom „nieśmiertelność”,
a często także oporność na leczenie. Przyczyną tego jest często nadekspresja białka
Bcl-2. Badania na wielu liniach komórkowych, w tym na komórkach raka prostaty czy
linii białaczki/chłoniaka T-komórkowego (Jurkat) wykazały, że inhibitory proteasomu
przełamują ochronną, antyapoptotyczną funkcję Bcl-2 (25, 26). Dochodzi przy tym do
zahamowania degradacji i wtórnego nagromadzenia w komórce proapoptotycznego
białka Bax.
Hamowanie szlaku kinazy mTOR przez RAPA powoduje zahamowanie ekspresji
antyapoptotycznego białka Bcl-2 (7). W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono publikacji na temat wpływu RAPA na ekspresję innych badanych białek apoptotycznych.
Poprzez hamowanie czynności proteasomu, który jest odpowiedzialny za degradację 80% białek w tym tych, które regulują proces apoptozy, BOR indukuje ten proces
w komórce nowotworowej (24). W przeprowadzonych badaniach nie stwierdzono jednak statystycznie istotnego wpływu BOR, RAPA oraz ich skojarzenia na ekspresję białek Bcl-2 i Bax.
Wykazano, iż jednym z następstw działania inhibitorów proteasomu jest wzrost
ekspresji białka p53 w komórce (26, 27). Raz zaktywowane białko nie podlega wychwytowi przez proteasom, co prowadzi do jego nagromadzenia w komórce. p53 koordynuje ten proces na różnych poziomach (26). Jest także regulatorem ekspresji białek
proapoptotycznych, m.in. Bax, hamując także ekspresję białka Bcl-2.
128
M. ZUBKOWICZ i wsp.
W części doświadczeń badaliśmy także wpływ tych leków na ekspresję białek z rodziny p53 a mianowicie p53 i p73. Wyniki badań własnych nie potwierdziły do końca
powyższych obserwacji, nieznacznie tylko wzrosła ekspresja białka p53 pod wpływem
BOR. RAPA i połączenie jej z BOR nie miały wpływu na zmianę ekspresji tego białka.
W dostępnych publikacjach nie znaleźliśmy żadnych informacji na temat wpływu
RAPA i BOR na poziom p73, białka którego roli w chorobach nowotworowych krwi
i odpowiedzi na leczenie poświęca się ostatnio wiele uwagi (28). Z naszych badań wynika, że RAPA i BOR tylko w nieznaczny sposób powodują wzrost ekspresji tego białka. Dane te sugerują, że apoptoza indukowana skojarzeniem RAPA i BOR jest regulowana przez inne mechanizmy. Problem ten wymaga z pewnością dalszych badań.
Podsumowując, przeprowadzone badania wskazują na aktywność cytotoksyczną
RAPA w odniesieniu do komórek szpiczakowej linii RPMI 8226. Mechanizm tego
działania polega głównie na indukcji apoptozy. Ponadto, obserwuje się tendencję do
hamowania przez RAPA komórek w fazie G1 oraz progresji do fazy S cyklu komórkowego. Uzyskane wyniki wskazują ponadto, że skojarzenie RAPA z BOR może znacząco zwiększyć jego działanie przeciwnowotworowe, przy możliwości zastosowania niskich dawek BOR. Efektem kombinacji RAPA+BOR jest zahamowanie szlaku kinazy
mTOR, głównie ekspresji czynnika trankrypcyjnego 4E-BP1. Wyniki te wymagają dalszego potwierdzenia w badaniach przedklinicznych, włączając w to badania in vivo na
modelu zwierzęcym.
Praca finansowana z Grantu KBN Nr 507-11-248
PIŚMIENNICTWO
1. Richardson PG, Barlogie B, Berenson J i wsp. A phase 2 study of bortezomib in relapsed, refractory myeloma. N Engl J Med 2003; 348: 2609–2617.
2. Jagannath S, Barlogie B, Berenson JR i wsp. SUMMIT/CREST Investigators. Bortezomib in recurrent and/or refractory multiple myeloma. Initial clinical experience in patients with impaired renal function. Cancer 2005; 103: 1195–2000.
3. Richardson PG, Schlossman R, Mitsiades C, Hideshima T, Munshi N, Anderson K. Emerging
trends in the clinical use of bortezomib in multiple myeloma. Clin Lymphoma Myeloma. 2005; 6(2):
84–88.
4. Richardson PG, Mitsiades C, Ghobrial I, Anderson K. Beyond single-agent bortezomib: combination regimens in relapsed multiple myeloma. Curr Opin Oncol 2006; 18: 598–608.
5. Ma MH, Yang HH, Parker KM i wsp. The proteasome inhibitor PS-341 markedly enhances sensitivity of multiple myeloma tumor cells to chemotherapeutic agents. Clin Cancer Res. 2003; 9: 1136–1144.
6. Jagannath S, Richardson PG, Barlogie B i wsp. SUMMIT/CREST Investigators. Bortezomib in
combination with dexamethasone for the treatment of patients with relapsed and/or refractory multiple
myeloma with less than optimal response to bortezomib alone. Haematologica 2006; 91: 929–934.
Cytotoksyczne działanie rapamycyny
129
7. Smolewski P. Investigating mTOR inhibitors for their anti-cancer properties. Exp Opin Invest
Drugs 2006; 15: 1201–1227.
8. Shi Y, Yan H, Frost P, Gera J, Lichtenstein A. Mammalian target of rapamycin inhibitors activate
the AKT kinase im multiple myeloma cells by up-regulating the insulin-like growth factor receptor/insulin
receptor substrate-1/phophhatidylinositol 3-kinase cascade. Mol Cancer 2005; 4: 1533–1540.
9. Smolewski P, Darzynkiewicz Z. Współczesne metody badania apoptozy. Acta Haematol Pol 2003;
34: 35-47.
10. Hidalgo M, Rowinsky EK. The rapamycin-sensitive signal transduction pathway as a target for
cancer therapy. Oncogene 2000; 27: 6680–6686.
11. Raje N, Kumar S, Hideshima T i wsp. Combination of the mTOR inhibitor rapamycin and CC5013 has synergistic activity in multiple myeloma. Blood. 2004; 104: 4188–4193.
12. Pei XY, Dai Y, Grant S. The proteasome inhibitor bortezomib promotes mitochondrial injury
apoptosis induced by the small molecule Bcl-2 inhibitor HA14-1 in multiple myeloma cells. Leukemia
2003; 17: 2036–2045.
13. O’Connor OA. The emerging role of bortezomib in the treatment of indolent non-Hodgkin’s and
mantle cell lymphomas. Curr Treat Opt Oncol 2004; 20: 4420–4427.
14. O’Connor OA, Wright J, Moskowitz C i wsp. Phase II Clinical Experience With the Novel Proteasome Inhibitor Bortezomib in Patients With Indolent Non-Hodgkin’s Lymphoma and Mantle Cell
Lymphoma. J Clin Oncol 2005; 23: 676–684.
15. Richardson PG, Hideshima T, Mitsiades C, Anderson K. Proteasome inhibition in hematologic
malignancies. Ann Med 2004; 36: 304–314.
16. Richardson PG, Mitsiades C, Hideshima T, Anderson KC. Proteasome inhibition in the treatment
of cancer. Cell Cycle 2005; 4: 290–296.
17. LeBlanc R, Catley LP, Hideshima T i wsp. Proteasome inhibitor PS-341 inhibits human myeloma
cell growth in vivo and prolongs survival in a murine model. Cancer Res. 2002; 62(17): 4996–5000.
18. Hideshima T, Mitsiades C, Akiyama M i wsp. Molecular mechanisms mediating antimyeloma
activity of proteasome inhibitor PS-341. Blood. 2003; 101: 1530–1534.
19. Smolewski P, Duechler M, Linke A i wsp. Additive cytotoxic effect of bortezomib in combination
with anti-CD20 or anti-CD52 monoclonal antibodies on chronic lymphocytic leukemia cells. Leuk Res
2006; Apr 18, Epub ahead of print.
20. Duechler M, Linke A, Cebula B, Shehata M, Schwarzmeier JD, Robak T, Smolewski P. In vitro
cytotoxic effect of proteasome inhibitor bortezomib in combination with purine nucleoside analogues on
chronic lymphocytic leukaemia cells. Eur J Haematol 2005; 74: 407–417.
21. Pei XY, Dai Y, Grant S. Synergistic induction of oxidative injury and apoptosis in human multiple myeloma cells by the proteasome inhibitor bortezomib and histone deacetylase inhibitors. Clin Cancer Res 2004; 10: 3839–3852.
22. Rowinsky EK. Targeting the molecular target of rapamycin (mTOR). Curr Opin Oncol 2004; 16:
564–575.
23. Fingar DC, Richardson CJ, Tee AR, Cheatham L, Tsou C, Blenis J. mTOR controls cell cycle
progression through its cell growth effectors S6K1 and 4E-BP1/eukaryotic translation initiation factor 4E.
Mol Cell Biol. 2004; 24: 200–216.
24. Royl HK, Olusolal BF, Clemens DL. AKT proto-oncogene overexpression is an early event during sporadic colon carcinogenesis. Carcinogenesis 2002; 23: 201-205.
25. Herrmann JL, Briones F, Brisbay S, Logothetis CJ, McDonnell TJ. Prostate carcinoma cell death
resulting from inhibition of proteasome activity is independent of functional Bcl-2 and p53. Oncogene
1998; 17: 2889–2899.
130
M. ZUBKOWICZ i wsp.
26. Voges D, Zwickl P, Baumeister W. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu Rev Biochem 1999; 68: 1015–1068.
27. Maki CG, Huibregtse JM, Howley PM. In vivo ubiquitination and proteasome-mediated degradation of p53. Cancer Res 1996; 56: 2649–2654
28. Pluta A, Nyman U, Joseph B, Robak T, Zhivotovsky B, Smolewski P. The role of p73 in hematological malignancies. Leukemia 2006; 20: 757–766.
Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 10.10.2006 r.
Adres do korespondencji:
Dr hab. med. Piotr Smolewski
Katedra i Klinika Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Wojewódzki szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika
ul. Ciołkowskiego 2
93-510 Łódź
Tel: 42-6895191, 42-689-50-59, 42-689-55-83
Fax: 42-6895192
e-mail: [email protected]