0ROCESAPOPTOZYWKOMÌRKACHZAINFEKOWANYCHBAKTERIAMI ZRODZAJU#HLAMYDIA 4HEAPOPTOSISINCELLSINFECTEDWITHMICROBESOFTHEGENUS#HLAMYDIA MGR2OBERT+UBINAMGR-ARTA3MYCZDRNMED2OBERT$7OJTYCZKADRNMED!GATA+ABAAp$ZIK DRHAB*ERZY0ACHAPROFNADZW35- 3TUDENCKIE+OO.AUKOWEPRZY+ATEDRZEI:AKADZIE-IKROBIOLOGII7YDZIAU&ARMACEUTYCZNEGOZ/DDZIAEM -EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCUgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD-IKROBIOLOGII7YDZIAU&ARMACEUTYCZNEGOZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOW CUgLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH +ATEDRAI:AKAD0ATOLOGII7YDZIAU&ARMACEUTYCZNEGOZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU gLSKI5NIWERSYTET-EDYCZNYW+ATOWICACH +IEROWNIK+ATEDRYI:AKADUDRHABNMED*ERZY0ACHAPROFNADZW35- Streszczenie Apoptoza odgrywa ważną rolę w patomechanizmie różnych chorób zakaźnych. Zaprogramowana śmierć komórki jest ważnym mechanizmem zarówno w rozwoju jak i utrzymaniu homeostazy w rozwiniętych tkankach poprzez usuwanie komórek niepotrzebnych organizmowi, zainfekowanych, transformowanych bądź uszkodzonych. W wyniku apoptozy komórki wykazują charakterystyczną morfologię. Komórka ulega fragmentacji, jej jądro i cytoplazma ulegają kondensacji a DNA występuje w postaci oligonukleosomalnych fragmentów. Niektóre bakterie np. z rodzaju Chlamydia posiadają zdolność indukowania i blokowania apoptozy. Drobnoustroje z rodzaju Chlamydia należą do wewnątrzkomórkowych bakterii niewystępujących zewnętrznie i są transportowane z komórki do komórki tylko jako nieaktywne formy metaboliczne. Abstract Apoptosis plays an important role in the patomechanizm of various infectious disease. The microbes of genus Chlamydia have the ability to induce or block apoptosis. Programmed cell death is an important mechanism in both development and homeostasis in adult tissues for the removal of either superfluous, infected, transformed or damaged cells by activation of an intrinsic suicide program. Cells undergoing apoptosis usually exhibit a characteristic morphology, including fragmentation of the cell into membrane-bound apoptotic bodies, nuclear and cytoplasmic condensation and endolytic cleavage of the DNA into small oligonucleosomal fragments. Chlamydiae are obligate intercellular bacteria, that is to say they cannot grow outside host cells and are transmitted from cell to cell only as metabolically inert forms. Key words: apoptosis, Chlamydia Słowa kluczowe: apoptoza, Chlamydia Proces apoptozy odgrywa ważną rolę w obronie organizmu przed zakażeniem drobnoustrojami. Apoptoza to zaprogramowana śmierć komórki różna od martwicy. Stanowi ciąg zdarzeń morfologicznych, biochemicznych i molekularnych prowadzących do śmierci komórki. Słowo to zostało wprowadzone w 1972 r. przez australijskiego patologa J. Kerrego [1,2,3]. Synonimy apoptozy to aktywna, fizjologiczna, zaprogramowana śmierć komórki. Proces ten jest niezbędny do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Odgrywa podstawową rolę w utrzymaniu homeostazy dzięki zachowaniu równowagi między proliferacją, a eliminacją zużytych lub patologicznych komórek z organizmu. Jej głównymi cechami są: zmiana wielkości i kształtu komórki, zmniejszenie objętości, a także kondensacja chromatyny w jądrze. Podczas zaprogramowanej śmierci komórki orgaCOPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. nelle oraz błona komórkowa zachowują integralność przez dłuższy czas, niż w przypadku nekrozy. W wyniku zachodzących zmian powstają ciałka apoptotyczne, które ulegają w organizmie fagocytozie. W przeciwieństwie do nekrozy nie towarzyszy temu odczyn zapalny ze strony otaczających tkanek, gdyż nie dochodzi w niej do uszkodzenia błony komórkowej i przedostania się składników wnętrza komórki do otoczenia. Życie komórki zależy od homeostazy pomiędzy inhibitorami apoptozy, a aktywatorami tego procesu. Poznanych zostało wiele czynników wpływających na inhibicję oraz aktywacje procesu apoptozy. Czynniki te mogą być zarówno pochodzenia zewnątrz- jak i wewnątrzkomórkowego. Do sygnałów pobudzających komórkę do zapoczątkowania procesu programowanej śmierci komórki zaliczamy między &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY kU¤°°U innymi indukcję białka p53, oraz białek z rodziny Bcl-2 [4,5]. Wiadomo jednak, iż bakterie, wykształciły wiele mechanizmów prowadzących do zahamowania programowanej śmierci komórki. Apoptoza może przebiegać jedną z dwóch dróg: zewnątrzpochodną, do której zaliczana jest ścieżka receptorowa oraz szlak zależny od perforyn i granzymów, a także wewnątrzpochodną, zależną od mitochondrium lub siateczki śródplazmatycznej. Niezależnie jednak od źródła sygnału w wyniku inicjacji następuje aktywacja enzymów proteolitycznych – kaspaz. Są to enzymy z grupy proteaz cysteinowych rozszczepiających polipeptydy po reszcie kwasu aspargninowego. Syntetyzowane są w komórkach jako prokaspazy. Ze względu na funkcje w procesie apoptozy możemy wyróżnić kaspazy inicjujące kaspaza-2,8,9,10,12 , oraz kaspazy efektorowe - kaspaza 3,6,7 [4,5]. Szlak receptorowy zostaje zapoczątkowany na skutek związania liganda z receptorem śmierci na powierzchni komórki, należącym do nadrodziny receptorów TNF [6]. Podstawowym etapem przekazania sygnału jest formowanie kompleksu DISC w przypadku drogi zewnątrzpochodnej oraz apoptosomu w przypadku drogi wewnątrzpochodnej. Do kompleksów tych zostają przyłączone i aktywowane w następnej kolejności kaspazy inicjujące. W wyniku tej reakcji następuje aktywacja kaspaz efektortowych odpowiedzialnych za bezpośrednią destrukcje komórki. Ogniwem łączącym oba szlaki jest białko Bid należące do rodziny białek bcl-2. Do rodziny tej należą białka proapoptotyczne (podrodzina BH3 oraz Bax) oraz białka antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-x). Zlokalizowane są one w obrębie błony mitochondrialnej. Ich zasadniczą funkcją jest regulacja przepuszczalności błony. Do białek zwiększających przepuszczalność należą proteiny z podrodziny BH3 oraz Bax [4,5,7]. Przykładem może być tu białko Bid, które ulega proteolizie i w formie skróconej t-Bid przedostaje się do mitochondrium, gdzie doprowadza do uwolnienia białek apoptogennych, co w konsekwencji prowadzi do aktywacji szlaku wewnątrzpochodnego. W skutek uwolnienia cytochromu c do cytozolu następuje jego wiązanie się z czynnikami aktywującymi proteazy apoptozy (Apaf-1) i wraz z prokaspazą-9 tworzą apoptosom, co prowadzi do aktywacji kaskady kaspaz. Przewaga Bcl-2 w zewnętrznej błonie mitochondrium uniemożliwia ucieczkę białek do cytozolu, co chroni komórkę przez śmiercią [4,5]. Trzecia dość słabo poznana droga aktywacji apoptozy przebiega z udziałem zlokalizowanych w błonie komórkowej perforyn, które wiążą wybiórczo granzym B w wyniku czego dochodzi do uszkodzenia błony komórkowej i bezpośredniej aktywacji kaspazy-3. Drobnoustrojami, o których wiadomo, że wykształciły mechanizmy antyapoptotyczne są bakterie z rodzaju Chlamydia. Wśród tej grupy możemy wyróżnić trzy patogenne dla człowieka gatunki takie jak Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci oraz Chlamydia pneumoniae. Ch. trachomatis jest patogenem wywołującym wiele różnych chorób między innymi stany zapalne narządów płciowych kobiet, a w krajach tropikalnych odpowiedzialna jest za ciężką postać infekcji rogówki i spojówek [8]. Ch. pneumoniae odpowiedzialna jest za infekcje górnych dróg oddechowych, zapalenie płuc oraz może być przyczyną miażdżycy. Bak- &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY terie z rodziny Chlamydia są to drobnoustroje Gram-ujemne o kulistym kształcie i trójwarstwowej budowie błony. Ich wielkość nie przekracza 1,3 μm. Posiadają wiele enzymów i są zdolne do samodzielnego przeprowadzania procesów metabolicznych, jednak mimo to są całkowicie zależne od ATP dostarczanego przez gospodarza. Bakterie te charakteryzuje oryginalny, wewnątrzkomórkowy cykl rozwojowy [9,10,11]. Bakterie te mogą wywierać silny antyapoptyczny efekt w komórkach, który jest rezultatem nadekspresji genów kodujących białko Bcl-2. Zmniejszenie zdolności do indukcji apoptozy zwiększa szanse transformacji nowotworowej komórki. Najczęstszą postacią kliniczną zakażenia Ch. trachomatis u kobiet w jest zapalenie szyjki macicy . Dane epidemiologiczne sugerują, że Ch. trachomatis stanowi jeden z głównych czynników predysponujący do rozwoju procesu nowotworowego szyjki macicy. Istnieją także dowody wykazujące związek przewlekłej infekcji Ch. pneumoniae z rakiem płuc [12]. Mechanizmy hamujące proces apoptozy mogą działać pośrednio lub bezpośrednio na śmierć komórki. Bezpośrednie oddziałanie bakterii Ch. trachomatis na apoptozę polega na hamowaniu lub uszkodzeniu białek biorących czynny udział w programowanej śmierci komórki. Natomiast działanie pośrednie następuje na poziomie szlaków przekaźnikowych zlokalizowanych wewnątrz zainfekowanej komórki gospodarza takich jak NFκB np. Ch. pneumoniae, oraz PI3K/Akt np. Ch. trachomatis. Badania wykazały, że główna droga hamowania procesu apoptozy w komórkach zainfekowanych drobnoustrojami z rodziny Chlamydia polega na inhibicji uwalniania cytochromu c w mitochondriach. Bezpośrednie oddziaływanie z elementami szlaku apoptozy wykazują także inne bakterie takie jak Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis oraz Escherichia coli. Bakterie z rodziny Chlamydia hamują proces apoptozy poprzez czynną proteolizę białek proapoptotycznych należących do nadrodziny Bcl-2 takich jak: Bad, t-Bid, Bik, Bak oraz Bax. Przypuszcza się, że drobnoustroje te wydzielają do cytozolu proteazy odpowiedzialne za degradację tych białek [13,14]. Sygnał do aktywacji apoptozy następuje w efekcie nagromadzenia się białek proapoptotyczych na zewnętrznej błonie mitochondrialnej. W procesie proteolizy tych białek przewagę uzyskują białka antyapoptotyczne w wyniku czego zahamowane zostaje otwarcie kanałów w błonie mitochondrialnej, co uniemożliwia przedostawanie się czynnika aktywującego apoptozę AIF oraz cytochromu c do cytozolu. W wyniku tych zaburzeń nie dochodzi do tworzenia się apoptosomu, odpowiedzialnego za aktywację kaskady kaspaz, czego konsekwencją jest zahamowanie procesu programowanej śmierci komórki. Najprawdopodobniej nie jest to jedyny bezpośredni mechanizm hamowania apoptozy [4,5,15,16,17,18]. Duże znaczenie w hamowaniu apoptozy przypisuje się oddziaływaniu bakterii poprzez czynnik jądrowy NFκB. Jest to czynnik pośrednio wpływający na proces apoptozy poprzez białko cFLIP będące inhibitorem kaspazy 8 oraz białko cIAP. NFκB jest regulatorem wielu genów antyapoptotycznych. Aktywacja tego czynnika prowadzi do powstania dużej ilości produktów ekspresji genów kontrolowanych poprzez NFκB, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania procesu apoptozy. Zidentyfikowano szereg produktów ekspresji genu NFκB o działaniu antyapoptotycznym. Wśród COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. kU¤°°U tych produktów na uwagę zasługują inhibitory apoptozy IAPs, (do których zalicza się komórkowy inhibitor apoptozy cIAP) oraz inhibitory kaspazy-8 (FADD oraz cFLIP). Białko cIAP wiąże się bezpośrednio z kaspazami efektorowymi zapobiegając tym samym aktywacji proteolitycznej kaspazy 6 oraz 9. Hamowanie apoptozy jest więc skutkiem oddziaływań genomowych NFκB. Białko cFLIP hamuje apoptozę poprzez bezpośrednie oddziaływanie na prokaspazę-8. Dodatkowo aktywowane białko cFLIP jest silnym aktywatorem uwalniania jądrowego czynnika –κB [15,16,19,20]. Z antyapoptotycznym działaniem bakterii z rodzaju Chlamydia związane są szlaki przekaźnikowe obejmujące 3-kinazę fosfatydylinozytolu oraz kinezę białkową B (Akt). Akt aktywowana jest za pośrednictwem PI-3K w skutek ufosforylowania tyrozyny w jej podjednostce katalitycznej p85. Aktywowany enzym Akt odgrywa w życiu komórki wiele funkcji m.in. odpowiedzialny jest za proliferację, metabolizm oraz apoptozę komórki. Kinaza Akt może być inhibitorem apoptozy poprzez bezpośrednie oddziaływanie na czynniki proapoptotyczne. W komórkach zakażonych Chlamydia trachomatis następuje aktywacja kinezy PI3K, która wpływa z kolei na aktywację enzymy Akt. Następuje zahamowanie uwalniania cytochromu c i w konsekwencji dochodzi do zaburzenia procesu apoptozy w komórkach zainfekowanych bakteriami z rodzaju Chlamydia. Kinaza Akt hamuje apoptozę komórek także poprzez pobudzenie potencjału transaktywacyjnego p50/p65 (NFκB). Podwyższona aktywność PI3K/Akt oraz wynikająca z niej aktywacja NFκB jest potrzebna komórce do poprawienia jej przeżywalności [16,21,22]. Proces apoptozy odgrywa ogromne znaczenie z patogenezie schorzeń wywoływanych przez bakterie. Zaburzenia procesu naturalnej apoptozy prowadzą do szerzenia się zakażenia i nasilenia odpowiedzi przeciwzapalnej. Konsekwencją tego może być jeszcze większe uszkodzenie zakażonych tkanek [2] lub nabywanie przez komórki cech nowotworowych co obserwuje się w przypadku zakażeń np. Chlamydia trachomatis [16]. Przypuszcza się, że dokładne poznanie procesów indukcji programowanej śmierci komórki poprzez bakterie z rodzaju Chlamydia przyczyni się do zahamowania infekcji przez nie wywoływanych oraz skuteczniejszego leczenia zakażeń. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Piśmiennictwo: 19. 1. 2. 3. 4. 5. Urbanek T. i wsp. Apoptoza w schorzeniach układu naczyniowego – implikacje kliniczne, przegląd piśmiennictwa. Chir. Pol. 2003; 5, 47 – 58. Baś M i wsp., Apoptoza – programowana śmierć komórki. Część III. Rola apoptozy w procesach fizjologicznych i patologicznych. Życie Wet. 2004; 79, 671 – 675. Maruniewicz M., Wojtaszka P. Pochodzenie i ewolucja śmierci komórki. Post. Biol. Kom. 2007; 34(4), 651-667. Kopaczewska M., Kopaczewski B. Apoptoza – genetycznie zaprogramowana śmierć komórki. Nowiny Lek. 2004; 73, 389 – 392. Kopczewska M., Kopczewski B. Apoptoza – podstawy molekularne patogenezy guzów mózgu. Neuroskop 2004; 6, 132 – 135. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. 20. 21. 22. Grygorczuk S i wsp., Stężenie białka sFas I sFasL w hodowli komórek jednojądrzastych krwi obwodowej chorych z późną Boleriozą z Lyme. Przegl. Epidemiol. 2007, 61, 51 – 58. Dworakowska D. Rola białka p53, pRb, p21 WAF1/CIP1, PCNA, mdm2 oraz cykliny D1 w regulacji cyklu komórkowego oraz apoptozy. Okol. Pol. 2005; 8, 223 – 228. Fischer S. Protection against CD95 – Induced Apoptosis by Chlamydial Infection at a Mitochondrial Step. . Infect. Immun. 2004; 72, 1107 – 1115. Gornowicz J. Chlamydia trachomatis - charakterystyka patogenu i diagnostyka zakażeń. Post. Dermatol. Alergol. 2008; 25, 125 – 128. Balsara Z R. Chlamydia trachomatis Infection Induces Cleavage of the Mitotic Cyclin B1. Infec. Immun. 2006; 74, 5602 – 5608. Yaraei K i wsp. Chlamydia pneumoniae Augments the Oxidized Low – Dentisity Lipoprotein – Induced Death of Mouse Macrophages by a Caspase – Independent Pathway. Infec. Immun. 2005; 73, 4315 – 4322. Szkaradkiewicz A. Drobnoustroje i onkogeneza. Wsp. Onkol. 2003; 7, 2, 96 – 101. Dong F. i wsp. Degradation of the proapoptotic proteins Dik, Puma and Bik with Bcl-2 domain 3 homology In Chlamydia trachomatis infected cells. Infect. Immun. 2005; 73,1861-1864. Kwiecińska J i wsp., Rola pałeczek gram – ujemnych w indukcji / regulacji apoptozy. Post. Mikrobiol. 2007; 46, 2: 125 – 137. Węglarczyk K. i wsp. Caspase-8 activation precedes alterations of mitochondria membrane potential during monocyte apoptosis induced by phagocytosis and killing of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 2004; 72, 2590-97 Reśliński A i wsp., Właściwości antyapoptyczne bakterii. Post. Mikrobiol. 2008; 47(1), 23 – 33. Eickhoff M. Host Cell Responses to Chlamydia pneumoniae in Gamma Interferon - Induced Persistence Overlap Those of Productive Infection and Are Linked to Genes Involved in Apoptosis, Cell Cycle, and Metabolism. Infect. Immun. 2007; 75, 2853 – 2863. Fischer S. i wsp. Characterization of antiapoptotic activities of Chlamydia pneumoniae in human cells. Infect. Immun. 2001; 69, 7121-7129. Appelt D M. Inhibition of apoptosis in neuronal cells infected with Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae. BMC Neurosci 2008; 9, 13. Perfettini J L i wsp. Inhibition of Apoptosis by Gamma Interferon in Cells and Mice Infected with Chlamydia muridarum (the Mouse Pneumonitis Strain of Chlamydia trachomatis). Infec. Immun. 2002; 70, 2559 – 2565. Pająk B., Orzechowski A. Złożony charakter niewrażliwości immunologicznej ludzkiego raka jelita grubego na niektóre cytokiny ( TNF- alfa, interferony) na przykładzie linii komórkowej COLO 205. Mechanizm niewrażliwości- z uwzględnieniem białek sygnałowych. Post. Hig. Med. Dośw. 2004, 58, 428 – 437. Piotrkowska A. i wsp. Budowa białek z rodziny NF-κB i ich rola w procesie apoptozy. Postępy Hig Med. Dość. 2008; 62:64-74. &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY