metody wykrywania zjawiska apoptozy w komórkach wątrobowych
advertisement
Nowiny Lekarskie 2008, 77, 3, 223–226 MARCIN CHMIELEWSKI1, KRZYSZTOF LINKE1, MACIEJ ZABEL2 METODY WYKRYWANIA ZJAWISKA APOPTOZY W KOMÓRKACH WĄTROBOWYCH IN SITU METHODS OF APOPTOSIS DETECTION IN HEPATOCYTES IN SITU 1 Katedra i Klinika Gastroenterologii, Żywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. Krzysztof Linke 2 Katedra Histologii i Embriologii Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik: prof. dr hab. Maciej Zabel Streszczenie Wykrywanie apoptozy w komórkach i tkankach staje się coraz częstszym zjawiskiem badawczym nowoczesnej biologii, włączając w to badania rozwoju embriologicznego, chorób i biologii nowotworzenia. Metody histochemiczne – ostatnio często stosowane na skrawkach tkankowych – wykorzystują właściwości umierającej komórki. Właściwości te w procesie apoptozy są mniej lub bardziej specyficzne, stąd też ich interpretacja i użyteczność bywa dyskusyjna i niejednoznaczna. Założyliśmy, że apoptoza istnieje w wątrobie, w której toczą się procesy patologiczne. W związku z tym użyliśmy metody TUNEL i przeciwciał przeciw aktywnej postaci kaspazy-3-ej, aby udowodnić istnienie programowanej śmierci komórkowej. SŁOWA KLUCZOWE: apoptoza, wątroba. Summary Detection of apoptotic cell death in cells and tissues has become of paramount importance in many fields of modern biology, including studies of embryonic development, degenerative disease and cancer biology. Histochemical methods have recently been extensively used in tissues. Most of these methods exploit properties of dying cells that are more or less specific for apoptotic process. However, considerable confusion exists over the interpretation of some these methods and their usefullness in all settings. We have taken into account apoptosis that exists in liver during pathological changes. That is why both methods TUNEL and antibody anti-caspase-3 have been used to prove apoptosis. KEY WORDS: apoptosis, liver. Badania nad śmiercią komórki przeżywają w ostatnich latach ogromny rozwój. Jest to spowodowane m.in. chęcią poznania procesów rządzących w organizmie ludzkim. Programowana śmierć komórki przebiega według ściśle zaplanowanych mechanizmów. Wydaje się uczestniczyć w wielu procesach patologicznych i dlatego jej wykrycie stanowiłoby podstawę do dalszych rozważań medycznych, jak również biologicznych. Chęć obserwacji zjawiska apoptozy spowodowała rozwój badań nad metodyką oceny śmierci komórkowej m.in. w preparatach tkankowych. Obecnie metody te są szeroko stosowane w badaniach szeregu patologii, fizjologii i embriologii [1], choć ich interpretacja opiera się na spekulacyjnych uzgodnieniach grona badaczy. ZJAWISKO APOPTOZY Apoptoza jest programowaną śmiercią komórki i różni się od martwicy. Komórka ulega zmianom morfologicznym dobrze widocznym w mikroskopie elektronowym, a przy odpowiednim doświadczeniu można dostrzec ją również w mikroskopie świetlnym. Do zmian tych w pierwszej fazie zalicza się: obwodowe ułożenie chromatyny jądrowej i jej kondensacja, rozpad jąderka [2], zagęszczenie cytoplazmy, przerwanie połączeń mię- dzykomórkowych. W drugiej zaś dochodzi do fragmentacji jądra i cytoplazmy komórki na tzw. ciałka apoptotyczne. Natomiast w trzeciej fazie dochodzi do degeneracji wszystkich struktur komórkowych. Ciałka apoptotyczne zazwyczaj są fagocytowane, bądź przez komórki sąsiednie, bądź przez makrofagi. Proces ten przebiega zwykle bez reakcji zapalnej i trwa krótko (od kilku minut do kilkunastu godzin) [3]. Mechanizmy rządzące przemianami komórkowymi są ściśle powiązane ze szlakami enzymatycznymi. Dziś wiemy, że proces apoptozy jest skomplikowany, a reakcje enzymatyczne ściśle ze sobą skoordynowane. Skuteczna inicjacja programowanej śmierci komórkowej przez czynniki zewnętrzne i/lub wewnętrzne doprowadza w efekcie końcowym do ostatecznych etapów apoptozy. Jest to faza, którą można podzielić na trzy stadia: uwolnienia, uwypuklenia i kondensacji. Stadium uwolnienia polega na przerwaniu połączeń z komórkami sąsiadującymi. Doprowadza to do przybrania przez komórkę kształtu najbardziej energooszczędnego, a więc kulistego. Wzbudzona nukleaza CAD (Caspase Acivated DNA-se) dokonuje cięcia DNA na odcinki 180 par zasad [4]. Fragmenty te ulegają dalszemu strawieniu przez enzymy lizosomalne makrofagów tak, aby nie do- 224 Marcin Chmielewski i inni prowadzić do wzbudzenia choroby autoimmunologicznej przez pozostałości jądrowe. W stadium uwypuklenia następuje seria skurczów włókien aktynowych oddziaływujących z miozyną, co doprowadza do uwypuklania się błony komórkowej. W stadium kondensacji tworzą się ostatecznie ciałka apoptotyczne [5]. Egzekucja apoptozy jest więc o tyle ważna metodologicznie, że jedynie w tym czasie jesteśmy pewni, że komórka ulega programowanej śmierci. Wydaje się to więc jasnym, że większość metod badawczych skupia się na tej właśnie fazie. METODA OPARTA NA ZASTOSOWANIU PRZECIWCIAŁ PRZECIW AKTYWNEJ POSTACI KASPAZY-3-CIEJ Wiadomo, że w ostatnim etapie apoptozy następuje wzbudzenie kaskady kaspaz. Do tej pory odkryto ich 14, ale chyba najważniejszą z nich jest kaspaza-3. Ona to bowiem uaktywnia bezpośrednio DFF (DNA Fragmentation Factor) doprowadzając do trawienia DNA. Rozkłada PARP (Poly ADP-Ribose Polymarse) inaktywując możliwość naprawy uszkodzonego genomu. Jest końcowym etapem przemian kaspaz i w związku z tym stanowi prosty i właściwy punkt wykrywania apoptozy. Do jej wykrywania używa się przeciwciał monoklonalnych skierowanych selektywnie przeciwko wybranemu epitopowi antygenowemu aktywnej kaspazy-3. Wydaje się to ważnym, ponieważ kaspaza-3 występuje w komórkach niezmienionych apoptotycznie w formie prokaspazy. Gdybyśmy więc dysponowali przeciwciałami nieselektywnymi tzn. takimi, które znakują zarówno kaspazę-3 i prokaspazę-3 znakowalibyśmy wszystkie niemal komórki. Doszłoby wtedy do zafałszowania wyników, a co istotniejsze – do mylnego odczytu programowanej śmierci komórkowej. Bantel i wsp. uważają, że uszkodzenie wątroby w przebiegu zakażenia wirusem C następuje głównie przez indukcję apoptozy. Opierają się na badaniach immunohistochemicznych i Western-blot aktywacji kaskady kaspaz, w tym przede wszystkim ksapazy-3-ciej. Autorzy wykazują, że kaspazy w przewlekłym zapaleniu wątroby na podłożu wirusa C są aktywowane w znacznej ilości [6]. Aktywna postać kaspazy-3-ciej winna być znakowana głównie w cytoplazmie komórek zmienionych apoptotycznie z uwagi na jej duże stężenie w tej przestrzeni. Logicznym jest fakt, że niekiedy jest ona obserwowana również w jądrze komórkowym, ponieważ jest to enzym uaktywniający bezpośrednio endonukleazy jądrowe. Mamy więc do czynienia z dwoma, a nawet trzema obrazami histologicznymi: homogenne zabarwienie bądź cytoplazmy, bądź jądra lub też obu struktur. Prawdopodobnie użycie przeciwciał poliklonalnych przeciw aktywnej kaspazie-3-ciej w badaniach immunocytochemicznych apoptozy komórkowej byłoby precyzyjniejsze ze względu na to, że jest to mieszanina przeciwciał skierowanych przeciw różnym epitopom jednego białka. Wybarwianie takich przeciwciał głównych było- by intensywniejsze, jak również bardziej obiektywne. Mieszanina reakcyjna przeciwciał poliklonalnych łączyłaby się z wieloma miejscami białka stanowiącego właściwy antygen. Znakowanie takie byłoby pewniejsze, a efekt tła w preparatach histologicznych uległby redukcji. Tym samym prawdopodobieństwo znakowania innych białek byłoby minimalne albo wręcz niemożliwe. W doświadczeniach własnych na hepatocytach, stosując przeciwciała przeciw aktywnej kaspazie-3-ciej uwidoczniliśmy pojedyncze komórki, które weszły w przemiany programowanej śmierci komórkowej. Doświadczenia swe opieramy na schorzeniach przewlekłych, gdzie dynamika zmian apoptotycznych w tych patologiach jest niewielka, a niejednokrotnie żadna. Można więc wstępnie powiedzieć, że indeks apoptotyczny nie ma istotności statystycznej w porównaniu ze zdrową wątrobą. Zastosowaliśmy metodę immunocytochemii [7] na skrawkach parafinowych uwidaczniając aktywną kaspazę-3 za pomocą barwnej reakcji DAB (DiAminoBenzydyna) (Ryc. 1.). Przyłączenie swoistego przeciwciała Przyłączenie przeciwciała biotynylowanego Antygen w skrawku Przyłączenie DAB I reakcja z peroksydazą Antygen w skrawku Przyłączenie kompleksu streptawidyna-biotynylowana peroksydaza Biotynylowana peroksydaza Streptawidyna Swoiste przeciwciało Przeciwciało biotynylowane DAB (3,3’ DiAminoBenzydyna) Ryc. 1. Schemat reakcji immunohistochemicznej. Fig. 1. Immunohistochemical reaction scheme. W metodzie tej stosuje się H2O2 hamując aktywność endogennej peroksydazy, nakłada przeciwciała blokujące (korzystaliśmy z normalnych przeciwciał kozich w rozcieńczeniu 1:20), aby doprowadzić do zlikwidowania miejsc niespecyficznie wiążących. Doprowadzaliśmy do wiązania przeciwciał biotynylowanych z przeciwciałami głównymi, a następnie nakładaliśmy kompleks streptawidyna-biotynylowana peroksydaza oraz DAB, aby uzyskać reakcję barwną. Otrzymane przez nas preparaty miały barwę brązową w miejscach dużego wychwytu znacznika DAB w komórkach wątrobowych. Pozostałe traktowaliśmy hematoksyliną w celu wybarwienia jąder komórkowych i ustanowienia tła całości bioptatów wątrobowych. Biopunktaty wątroby pobierane były standardowo igłą Manghiniego 1,6 mm, a wycinki miały przeciętnie 2–3 cm długości. Ilość ta stanowi około 1/50 tys. masy wątroby. Biopsja wykonywana była ściśle według norm gastroenterologicznych ustanowionych przez AGA (American Gastroenterology Association). Wybiórczo zastosowaliśmy eksperymentalnie metodę ImmunoMax opierającą się na zastosowaniu tyrami- 225 Metody wykrywania zjawiska apoptozy w komórkach wątrobowych in situ ny, która miała wspomóc reakcję barwną. Jednak ze względu na dobre wyniki metod standardowych (praktycznie nie odbiegających od metody ImmunoMax), zaniechaliśmy dalszego wykorzystywania tej rozszerzonej metody immunocytochemicznej. (Nota bene stosuje się ją głównie w sytuacjach słabych reakcji barwnych, gdy antygenu jest mało). Zastosowaliśmy barwienie DAB na skrawkach mrożeniowych utrwalanych w formaldehydzie i w roztworze aceton-alkohol w stosunku 1:1. Niestety, nie uzyskaliśmy żadnej reakcji barwnej, co sugeruje, że zastosowanie skrawków mrożeniowych dla tej metody nie ma uzasadnienia naukowego i jest praktycznie bezużyteczne. Ze względu na krótki okres doświadczeń z przeciwciałami przeciw kaspazie-3-ej i jej niejasnym obrazem morfologicznym w mikroskopie świetlnym, ustanowiliśmy kontrolę na skrawkach parafinowych sztucznie wzbudzanych procesów apoptozy. Były to preparaty jelita grubego, na których zauważyliśmy homogenne wybarwianie cytoplazmy przeciwciałami typu antykaspaza-3 (Ryc. 2.). Nie można zapomnieć o fakcie, że proces apoptozy przebiega szybko, precyzyjnie i bez reakcji zapalnej. W związku z tym jest słabo obserwowalny, a może być w ogóle niezauważony, gdy nie stosuje się metod specyficznych. Uchwycenie apoptozy na poziomie kaskady kaspaz jest prawie niemożliwe, a jednak w pojedynczych przypadkach obserwowalne. Zjawisko kaskady kaspaz jest łańcuchem zdarzeń, który przebiega szybko, bo w zakresie kilkunastu minut do paru godzin. METODA OPARTA NA ZASTOSOWANIU TUNEL Chyba najlepiej poznaną i przebadaną metodą wykrywania zjawiska apoptozy jest metoda TUNEL (Tdtmediated deoxyUridine triphosphate-biotin/digoxigenin Nick End-Labeling) [8]. Opiera się ona na najistotniejszej cesze apoptozy, którą jest fragmentacja DNA na stałe odcinki 180 par zasad. Tak małe fragmenty zawierają wolne końce 3’-OH i właśnie one są odpowiedzialne za przyłączenie znakowanych nukleotydów. Reakcja katalizowana jest przy udziale nukleotydylotransferazy (TdT –Termainal deoxynucleotidyl Transferase), a nukleotydy znakowane są digoksygeniną (digoksynadUTP) (Ryc. 3.). DNA Rozcięcie DNA na odcinki 200-300 par zasad TdT dołącza digoksyna-dUTP Przeciwciała znakowane peroksydazą wykrywają digoksygeninę Wybarwienie za pomocą DAB Ryc. 3. Schemat metody TUNEL. Fig. 3. TUNEL method scheme. Ryc. 2. Metoda z zastosowaniem przeciwciał antykaspaza-3. Fig. 2. Anticaspase-3 staining method. Zgodność obrazów kontrolnych na jelicie grubym i badanych skrawków wątrobowych stanowiła podstawę do orzekania o apoptozie komórkowej. Niestety, przeciwciała monoklonalne przeciw kaspazie-3-ciej w naszych doświadczeniach doprowadziły do wybarwiania białek cytoplazmatycznych o nieznanym pochodzeniu. Prowadziło to do zamazania obrazu mikroskopowego, jednak dobrze odróżnialnego w większych powiększeniach od właściwych zmian apoptotycznych. Otrzymywane obrazy, fałszywie wybarwiane, miały charakter ziarnistości komórkowych, a nie homogennej masy cytoplazmatycznej komórek zmienionych apoptotycznie i znamiennie się odróżniały. W doświadczeniach własnych stosowaliśmy metodę TUNEL na skrawkach mrożeniowych wątroby, utrwalanych w roztworach acetonu z alkoholem w stosunku 1:1. Stosowaliśmy roztwór enzymu w buforze zawierającym znakowane nukleotydy. Dodawaliśmy przeciwciała znakowane peroksydazą przeciwko digoksygeninie, a następnie wykrywaliśmy je za pomocą substratu DAB uzyskując brązową barwę jąder zmienionych apoptotycznie. Dzieje się to dlatego, że głównie w tych jądrach jest wystarczająco duże stężenie fragmentów z wolnym końcem 3’-OH DNA. Pozostałe jądra hepatocytów w skrawkach in situ wybarwialiśmy przy pomocy hematoksyliny, która jest roztworem zasadowym łatwo łączącym się z kwasami jądrowymi (Ryc. 4.). 226 Marcin Chmielewski i inni zastosowanie kilku starannie dobranych metod stanowi podstawę orzekania o zachodzących zjawiskach apoptozy. Co wydaje się być najbardziej zaskakujące to to, że te najstarsze metody są często najlepsze i najbardziej specyficzne. Zwykła ocena zmian morfologii jądra komórkowego, całości komórki w mikroskopie daje nam niepodważalną podstawę o zachodzących zjawiskach programowanej śmierci komórkowej. Wydaje się więc, że połączenie oceny morfologicznej z nowoczesnymi technikami histochemicznymi i metodą TUNEL prowadzi do najbardziej obiektywnych interpretacji zmian zachodzących w tych komórkach. Ocena apoptozy winna przebiegać z dużą ostrożnością, a pewność interpretatorów powinna być obarczona dużą dozą sceptycyzmu. Powtarzanie starych prawd o za chodzących zjawiskach, w szczególności przez teoretyków, budzi kontrowersje. Piśmiennictwo Ryc. 4. Barwienie jądra za pomocą metody TUNEL. Fig. 4. TUNEL staining of cell nucleus. Powszechnie znany jest fakt, że metoda ta ma swoich zwolenników, jak również i przeciwników. Tłumaczy się to tym, że w jądrach zmienionych martwiczo występują fragmenty DNA 180 par zasad z wolnym końcem 3’-OH. Dzieje się to wówczas, gdy materiał jądrowy martwiczo zmienionej komórki ulega cięciu przez uaktywnione nukleazy [9]. Cięcie to jednakże jest chaotyczne i nieskoordynowane, co doprowadza do występowania odcinków 3’-OH, ale stanowczo w mniejszym stężeniu. Sam obraz morfologii komórkowej przemawia za zmianami martwiczymi, ponieważ jądro komórkowe jest duże, chromatyna ulega rozmyciu, a błona jądrowa w wielu miejscach jest przerwana. Jądra hepatocytów zmienionych pod wpływem programowanej śmierci komórkowej są małe, ze skondensowaną obwodowo chromatyną, a w etapie końcowym ulegają podziałowi i fagocytozie. Obserwując, więc preparaty in situ winniśmy oceniać oprócz zabarwienia również jego natężenie, rozmieszczenie jądrowe i kształt morfologiczny komórki. W wielu przypadkach może bowiem dojść do zafałszowania wyników. Do podobnej konkluzji doszli Negoescu i wsp., którzy badając zachowanie komórek hodowlanych w różnych utrwalaczach wykazali różniące się wyniki [10]. Co prawda zmiana kształtu komórki stanowi jeden z końcowych etapów apoptozy, ale wówczas, gdy ona współistnieje łącznie z jedną z metod immunohistochemicznych prawdopodobieństwo stwierdzenia zjawiska apoptozy jest większe. WNIOSKI Choć metody wykrywania apoptozy są stale modyfikowane, a ich odkrywanie jakoby nie miało końca, dziś możemy powiedzieć, że pojedyncze testy nie zapewniają nam maksymalnej specyficzności i czułości. Dopiero 1. Willingham M.C.: Cytochemical methods for the detection of apoptosis. J. Histochem. Cytochem., 1999, 47(9), 1101-09. 2. Wyllie A.H., Kerr J.F.R., Currie A.R.: Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol., 1980, 68, 251-306. 3. Bursch W., Taper H.S., Lauer B. et al.: Determination of length of the histological stages of apoptosis in normal liver and in altered hepatic foci of rats. Carcinogenesis, 1990, 11, 847-53. 4. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H. et al.: A caspaseactivated Dnase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD. Nature, 1998, 391, 43-50. 5. Wójcik C.: Seminaria z cytofizjologii. Apoptoza. Wydawnictwo Medyczne Urban & Partner, 2002, 4,88-101. 6. Bantel H., Lugering A., Poremba C. et al.: Caspase activation correlates with the degree of inflammatory liver injury in chronic hepatitis C virus infection. Hepatology, 2001, 34, 758-767. 7. Zabel M.: Immunocytochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, 1999, 6, 135-157. 8. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A.: Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell. Biol., 1992, 119, 493-501. 9. Kerr J.F.R., Harmon B.V.: Definition an incidence of apoptosis: an historical perspective. In apoptosis In: the molecular basis of cell death (Tornet L.D., Cope F.O., eds), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992, 5-29. 10. Negoescu A., Lorimier P., Labat-Moleur F. et al.: TUNEL: Improvement and evaluation of the method for in situ apoptotic cell identification. Biochemica, 1997, 2, 12-17. Adres do korespondencji: Dr n. med. Marcin Chmielewski Katedra i Klinika Gastroenterologii, Żywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych UM w Poznaniu ul. Przybyszewskiego 49 60-355 Poznań tel. 061 8691343, fax. 061 8691686 e-mail: [email protected]
