Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki

P R A C A
O R Y G I N A L N A
Original Article
Acta Haematologica Polonica
2006, 37, Nr 1 str. 67–73
BEATA ZALEWSKA-SZEWCZYK, KRYSTYNA WYKA, WITALIJ ANDRZEJEWSKI,
JERZY BODALSKI
Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na
komórki śródbłonka u dzieci z chorobą nowotworową
— doniesienie wstępne
The influence of chosen anticancer agents on endothetial cells in children with
neoplasms — pretitninary data
Klinika Chorób Dzieci Katedry Pediatrii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Jerzy Bodalski
SŁOWA KLUCZOWE: Śródbłonek - Chemioterapia - Dzieci
KEY WORDS:
Endothelium - Chemotherapy - Children
STRESZCZENIE: Celem pracy była ocena wpływu wybranych leków przeciwnowotworowych na stan komórek śródbłonka. U 14 dzieci z ostrą białaczką limfoblastyczną i nieziarniczymi chloniakami złośliwymi oznaczono stężenie markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego przed i po zakończeniu 7-dniowej kuracji z użyciem prednizonu, a także bezpośrednio
przed i po zakończeniu infuzji doksorubicyny i L-asparaginazy. Badano stężenie inhibitora
aktywatora plazminogenu (PAI), tkankowego aktywatora plaztninogenu (tPA), czynnika von
Willebranda (vWF) oraz endoteliny (ENA-1). W analizowanej grupie nie zaobserwowano
istotnych różnic w stężeniu wymienionych markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego
po zastosowaniu kuracji z prednizonem. Zanotowano nieznaczny wzrost stężenia PAI-1 i t-PA.
Po zastosowaniu L-asparaginazy zanotowano obniżenie VWF, co wiązano z bezpośrednim
wpływem L-asparaginazy na syntezę czynników krzepnięcia; stężenie pozostałych markerów
nie wykazywało istotnych różnic. Po zastosowaniu daunorubicyny stwierdzono istotny wzrost
stężenia VWF i endoteliny (średnie wartości odpowiednio 0,59 vs 1,77; 0,5 vs 0,9, p,0.02).
Wstępna analiza wskazuje na prawdopodobieństwo bezpośredniego toksycznego działania
doksorubicyny na komórki śródbłonka.
SUMMARY: The aim of the study was evaluation of the influence of some anticancer drugs on
endothelial cells. The concentration of endothelial injury markers i.e. the concentration of
plasminogen activator inhibitor (PAI-1), plasminogen tissue activator (t-PA), von Willebrand
factor (vWF) and endothelin (ENA-1), was estimated in 14 children with acute lymphoblastic
Pracę zrealizowano w ramach prac własnych UM nr 502-11-175
[67]
68
B. ZALEWSKA-SZEWCZYK, K. WYKA, W. ANDRZEJEWSKI, J. BODALSKI
leukemia or non-Hodgkin lymphoma. The blood samples were collected at following timepoints: before and after one-week prednisone therapy, immediately before and after intravenous
infusion of doxorubicin and L-asparaginase. There were no signiilcant differences in the
concentration of those markers after prednisone therapy, only slight increase of PAI-1 and t-PA
was noted. After L-asparaginase infusion a signiilcant decrease of vWF concentration was
observed; there were no differences in the concentration of other markers. After doxorubicin
infusion, we noted a significant increase of vWF and ENA-1 (mean values 0,59 vs 1,77 and 0,5
vs 0,9; p,0.02). Our observation indicates that doxorubicin may have a direct toxic effect on
endothelial cells.
Dzieci leczone z powodu chorób nowotworowych stanowią grupę zwiększonego
ryzyka wystąpienia żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Etiopatogeneza zakrzepicy w tej grupie pacjentów jest wieloczynnikowa i nie do końca wyjaśniona. Na jej
rozwój może wpływać zarówno obecność nowotworu, jak też i stosowane leczenie (8,
13). Dotychczasowe badania dotyczące tego problemu koncentrowały się głównie na
zaburzeniach osoczowej składowej układu hemostazy. Mimo teoretycznych przesłanek oraz danych klinicznych niewiele wiadomo na temat udziału uszkodzenia
śródbłonka naczyniowego w patogenezie procesu zakrzepowego, który może towarzyszyć samej chorobie nowotworowej i stosowaniu leków cytostatycznych.
Celem pracy była ocena wpływu wybranych leków przeciwnowotworowych
(glikokortykoidów, L-asparaginazy, antybiotyków antracyklinowych) na stan komórek układu śródbłonka u dzieci poddanych chemioterapii z powodu złośliwych
nowotworów.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono u 14 dzieci (9 chłopców i 5 dziewczynek), średnia wieku
9,7. Jedenaścioro dzieci było leczonych z powodu ostrej białaczki limfoblastycznej,
troje z powodu nieziarniczego chłoniaka złośliwego, T-komórkowego. W badanej
grupie oznaczano stężenie markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego: czynnika von Willebranda (vWF), endoteliny (ENA-1), tkankowego aktywatora plazminogenu (t-PA) oraz inhibitora aktywatora plazminogenu (PAI-1).
U badanych dzieci pobierano 4 ml krwi przed rozpoczęciem 7-dniowej fazy
terapii z udziałem prednizonu oraz po jej zakończeniu, a także bezpośrednio przed i
po zakończeniu 2-godzinnej infuzji L-asparaginazy oraz bezpośrednio przed i po
zakończeniu 6-godzinnej infuzji doksorubicyny. Krew pobierano do probówek
z dodatkiem antykoagulantu (2% EDTA), wirowano (2000 rpm/4°C), uzyskaną
surowicę przechowywano w — 70°C do momentu analizy. Oznaczenie wybranych
markerów przeprowadzano za pomocą komercyjnych testów American Diagnostic,
USA.
Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy pomocy programu Statistica.
W analizie wykorzystano dokładny test Fishera oraz test znaków.
Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródblonka
69
WYNIKI
W badanej grupie po zastosowaniu siedmiodniowej kuracji steroidowej zaobserwowano wzrost stężenia PAI-1 (p < 0,03) i t-PA (p < 0,02). Nie zanotowano
istotnych zmian w stężeniu pozostałych parametrów. Po zakończeniu infuzji Lasparaginazy wystąpił spadek stężenia wszystkich badanych markerów, jednak
tylko obniżenie stężenia vWF było istotne statystycznie (p < 0,0001). Po zakończeniu
infuzji doksoubicyny stwierdzono wzrost stężenia vWF i endoteliny (p < 0,02).
Uzyskane wyniki ilustrują ryciny 1–3.
22
140
120
18
100
14
80
10
60
40
6
20
2
0
-20
PAI przed ENC
PAI po ENC
±Odch. std.
±Błąd std.
Średnia
40
-2
vVVF przed ENC
vWF po ENC
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
t-PA przed ENC
t-PA po ENC
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
28
35
22
30
25
16
20
15
10
10
5
4
0
-5
ENDOTELINA przed ENC
ENDOTELINA po ENC
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
-2
Ryc. 1. Wybrane markery uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w grupie badanej przed I po
tygodniowej kuracji z prednizonem
Fig. 1. Chosen markers of endothelium damage in the study group before and after one-week prednisone
therapy
70
B. ZALEWSKA-SZEWCZYK, K. WYKA, W. ANDRZEJEWSKI, J. BODALSKI
160
22
140
18
120
14
100
10
80
6
60
40
2
PAI przed ASP
PAI po ASP
±Odch. std.
±Błąd std.
Średnia
-2
9
18
7
14
5
10
3
6
vWF po ASP
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
t-PA przed ASP
t-PA po ASP
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
2
1
-1
vWF przed ASP
ENDOTELINA przed ASP
ENDOTELINA po ASP
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
-2
Ryc. 2. Wybrane markery uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w grupie badanej przed i po infuzji L-asparaginazy
Fig. 2. Chosen markers of endothelium damage in the study group before and after L-asparaginase infusion
180
5,5
160
4,5
140
120
3,5
100
2,5
80
60
1,5
40
0,5
20
0
PAI przed RUB
PAI po RUB
±Odch. std.
±Błąd std.
Średnia
2,8
-0,5
vWF przed RUB
vWF po RUB
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
t-PA przed RUB
t-PA po RUB
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
220
180
2,2
140
1,6
100
1,0
60
0,4
-0,2
20
ENDOTELINA przed RUB
ENDOTELINA po RUB
Min-Maks.
25%-75%
Mediana
-20
Ryc. 3. Wybrane markery uszkodzenia śródbłonka naczyniowego w grupie badanej przed i po daunorubicyny
Fig. 3. Chosen markers of endothelium damage in the study group before and after daunorubicin infusion
Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródbłonka
71
DYSKUSJA
Zwiększone ryzyko wystąpienia choroby zakrzepowo-zatorowej u pacjentów
z chorobą nowotworową wynika zarówno z samej choroby, jak również może być
uwarunkowane innymi czynnikami, m.in. centralnym cewnikiem dożylnym, ciężką
infekcją, unieruchomieniem, czynnikami genetycznymi (5, 7, 9, 13). Czynnikiem
ryzyka może być również stosowana chemioterapia (4, 11). Z praktyki klinicznej
wiadomo, że stosowanie leków cytotoksycznych drogą dożylną często wiąże się
z miejscowym podrażnieniem naczynia, czego wyrazem jest miejscowy ból, zaczerwienienie skóry na przebiegu naczynia, może również prowadzić do zapalenia żyły
{thrombophlebitis). Do objawów takich dochodzi nawet przy braku wynaczynienia
leku poza światło naczynia. Szczególnie często takie niepożądane objawy są
notowane po podaniu alkaloidów Vinca oraz po zastosowaniu antybiotyków
antracyklinowych (6).
Ściana naczyń krwionośnych jest czynnym biochemicznie narządem, biorącym
udział w procesach krzepnięcia i fibrynolizy. W badaniach in vitro wykazano, że
komórki śródbłonka syntetyzują i uwalniają do światła naczynia enzymy bezpośrednio biorące udział w procesach hemostazy, a zwłaszcza aktywatory fibrynolizy (t-PA i
u-PA), inhibitory fibrynolizy (PAI), a także kofaktory uczestniczące w procesach
krzepnięcia (2, 3). Należy podkreślić, że w przypadku przerwania ciągłości ściany
naczynia uwalniany z podścieliska czynnik tkankowy TF odgrywa kluczową rolę
w aktywacji kaskady krzepnięcia krwi (3). Stąd też powstaje pytanie, na ile leki
cytotoksyczne po osiągnięciu światła naczynia wpływają na funkcję śródbłonka
naczyniowego i czy może to mieć wpływ na rozwój powikłań zakrzepowych. Z uwagi
na złożony charakter zaburzeń hemostazy u chorych z chorobą nowotworową,
potwierdzenie takiego patomechanizmu jest niezwykle trudne. W badaniach własnych wnioskowano o stanie i funkcji śródbłonka naczyniowego na podstawie oceny
stężenia wybranych parametrów układu fibrynolizy (tPA oraz PAI), a także
markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego (czynnika vWF i endoteliny).
Spośród wymienionych związków tPA, vWF oraz endotelina są substancjami
w przeważającej mierze syntetyzowanymi przez komórki śródbłonka naczyniowego i
najczęściej wykorzystywanymi w jego ocenie. Endotelina jest peptydem wpływającym
na skurcz naczyń i powodującym wzrost ciśnienia tętniczego krwi. PAI również jest
wytwarzany w śróbłonku, a zwiększenie jego stężenia wiąże się ze zwiększonym
ryzykiem rozwoju zakrzepicy i choroby wieńcowej. Wzrost stężenia tych związków
jest obserwowany w różnych sytuacjach klinicznych, np. zawale mięśnia sercowego,
hiperglikemii i jest uważany za marker uszkodzenia struktury śródbłonka.
W analizowanej grupie, po zastosowaniu wybranych leków o działaniu przeciwnowotworowym zaobserwowano zmiany w stężeniu markerów uszkodzenia śródbłonka naczyniowego, choć w większości różnice te nie były istotne statystycznie.
Po zastosowaniu tygodniowej kuracji glikokortykoidami zaobserwowano w grupie
badanej niewielki wzrost stężenia tPA (p<0.02) i stężenia PAI-1 (p<0.03).
Jednocześnie stwierdzono, że stężenie czynnika vWF uległo podwyższeniu, jednak
zmiana ta nie była istotna statystycznie. Stężenie endoteliny nie uległo istotnej
72
B. ZALEWSKA-SZEWCZYK, K. WYKA, W. ANDRZEJEWSKI, J. BODALSKI
zmianie po siedmiodniowej kuracji z zastosowaniem steroidów. Obserwacje powyższe mogą wskazywać, że stosowanie steroidów zaburzyło procesy fibrynolizy.
Podejmując próbę interpretacji uzyskanych wyników po zastosowaniu terapii
prednizonem, można zauważyć, że stosowanie steroidów może prowadzić do stanu
prozakrzepowego, na skutek wzrostu stężenia inhibitora aktywatora plazminogenu,
a także na skutek wzrostu stężenia vWF. Na podstawie uzyskanych danych trudno
jednak wnioskować, czy stosowanie steroidów ma wpływ na stan śródbłonka
naczyniowego.
Po zastosowaniu L-asparaginazy zaobserwowano w grupie badanej obniżenie
stężenia wszystkich badanych parametrów, jednak tylko w przypadku vWF zmiana
ta była istotna statystycznie. L-asparaginaza jest enzymem, prowadzącym po
dożylnym podaniu do natychmiastowej eliminacji z osocza i płynów ustrojowych
aminokwasu L-asparaginy i tą drogą prowadzi do zahamowania biosyntezy białek.
Po zastosowaniu L-asparaginazy notuje się zarówno obniżenie całkowitego stężenia
albumin, jak w szczególności obniżenie produkowanych przez komórki wątrobowe
czynników i inhibitorów osoczowego układu krzepnięcia. Nie można jednak
jednoznacznie przesądzić, czy obserwowane zmiany w stężeniu badanych parametrów wynikały z wpływu leku na komórki śródbłonka, czy też z upośledzenia
biosyntezy białek. Wydaje się jednak, że oprócz upośledzenia syntezy białek
u podłoża tak głębokiego obniżenia stężenia vWF leży prawdopodobnie inny
mechanizm. Czas połtrwania czynnika von Willebranda w osoczu wynosi ponad 16
godzin, a próbki krwi były pobierane bezpośrednio po zakończeniu dwugodzinnej
infuzji leku (10).
W badaniach własnych wzbudzają zainteresowanie obserwacje dotyczące doksorubicyny. Po jej zastosowaniu zaobserwowano wzrost stężenia vWF, jak również
endoteliny (p < 0.02). Być może obserwacja ta wskazuje na bezpośredni toksyczny
wpływ antybiotyków antracyklinowych na integralność śródbłonka naczyniowego
u pacjentów poddanych chemioterapii. W badaniach własnych nie zaobserwowano
wpływu doksorubicyny na proces fibrynolizy. Zanotowano jedynie nieistotny
statystycznie spadek stężenia PAI-1. Ze względu na niską liczebność grupy badanej
wskazane są dalsze badania dotyczące tego zagadnienia.
Z dotychczasowych doniesień wynika, że antracykliny mogą powodować retrakcję komórek śródbłonka, prowadząc do ekspozycji macierzy podśródbłonkowej,
zwiększonej adhezji płytek i w konsekwencji do aktywacji krzepnięcia (12).
U żadnego z obserwowanych pacjentów nie doszło do rozwoju klinicznie jawnej
zakrzepicy. Nie znaczy to jednak, że obserwowane zaburzenia nie mają klinicznego
znaczenia. Jak wynika z obserwacji innych autorów, zarówno obniżenie osoczowego
tPA, jak i wzrost stężenia osoczowego PAI-1 może mieć udział w rozwoju zakrzepicy
zależnej od cewników centralnych u małych dzieci, jak również przedłużać przebieg
zakrzepicy u nastolatków (1). Zaobserwowano również, że u dzieci z bezobjawową
hiperlipidemią dochodzi do osłabienia aktywności fibrynolitycznej na skutek upośledzonego uwalniania tPA z komórek śródbłonka. Zjawisko to skutkuje zwiększonym ryzykiem rozwoju chorób układu sercowo-naczyniowego we wczesnym
wieku dorosłym (1).
Wpływ wybranych leków przeciwnowotworowych na komórki śródbłonka
73
PODSUMOWANIE
W grupie badanej nie zaobserwowano wpływu glikokortykoidów i L-asparaginazy na stan komórek śródbłonka. Wstępna analiza pozwala przypuszczać, że
antybiotyki antracyklinowe mogą wywierać bezpośredni toksyczny wpływ na
komórki śródbłonka naczyniowego. Ze względu na niską liczebność grupy, wskazane są dalsze badania.
PIŚMIENNICTWO
1. Albisetti M. The fibrinolytic system in children. Seminars Thromb Hemostasis 2003; 29: 339-347.
2. Albisetti M, Chan AKC, McCrindle BW, Wong D, Vegh P, Adams M, Monagle P, Andrew M.
Fibrinolytic response to venous occlusion is decreased in patients after Kawasaki disease. Blood
Coagulation and Fibrinolysis 2003; 14: 181-186.
3. Kopeć M, Łopaciuk S. Hemostaza fizjologiczna. W. Zakrzepy i zatory, Red. Łopaciuk S,
Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2002; 19-52.
4. Kuenen BC, Levi M, Meijers JCM, van Hinsbergh ZWM, Berkhof J, Kakkar AK, Hoekman K,
Pinedo HM. J Clin Oncol 2003; 21: 2192-2198
5. Lersch C, Kotowa W, Janssen D. Thromboembolieprophylaxe mit Dalteparin-Na (Fragmin.) bei
onkologischen Patienten nach Port-Implantationen. TumorDiagn u Ther 2002; 23: 104-110.
6. Marę M, Maisano R, Caristi N, Adamo V, Altavilla G, Carboni R, Munao S, La Torre F. Venous
damade prevention by defibrotide in vinorelbine-treated patients. Support Care Cancer 2003; 11:
593-596.
7. Nowak-Gottl U, Kosch A, Schlegel N, Salem M, Manco-Johnson M. Thromboembolism in
children. Current opinion in Hematology, 2002; 9: 448-453
8. Van Ommen CH, Peters M. Venous thromboembolic disease in childhood. Seminars Thromb
Hemost 2003; 29: 391-403.
9. Pihusch R, Danzl G, Scholz M, Harisch D, Pihusch M, Lohse P, Hiller E. Impact of thrombophilic
gene mutation on thrombosis in patients with gastrointestinal carcinoma. Cancer 2002; 94: 3120—3126.
10. Scheja A, Akesson A, Geborek P, WUdt M, Wollheim CB, wollheim FA, Vischer UM. Von
Willebrandt factor propeptide as a marker of disease activity in systemie selerosis. Arthritis Res 2001; 3:
178-182.
11. Sodhi A, Pai K: Increased produetion of interleukin-1 and tumor necrosis factor by human
monocytes treated in vitro with cisplatin or other biological responce modifiers. Immunology Letters 1992;
34: 183-188.
IZ Wojtukiewicz MZ. Zakrzepy a nowotwory. W: Zakrzepy i zatory. Red. Łopaciuk S., Wydawnictwo
Lekarskie PZWL Warszawa 2002; 105-124.
13. Zalewska-Szewczyk B, Bodalski J. Zakrzepica u dzieci z chorobą nowotworową aktualny problem
kliniczny Przegl Pediatr 2004; 34: 3/4 184-187.
Praca wpłynęła do Redakcji 30.10.2005 r. i została zakwalifikowana do druku 10.012006 r.
Adres Autorów:
Beata Zalewska-Szewczyk
Klinika Chorób Dzieci UM
91-738 Łódź
ul. Sporna 36/50
tel. 0-42 617-77-91
fax. QA2 617-77-98
e-mail: [email protected]