sprawozdane merytoryczne „poszukiwanie genów kodujących

SPRAWOZDANE MERYTORYCZNE
„POSZUKIWANIE GENÓW KODUJĄCYCH CZYNNIKI WIRULENCJI PROTOTHECA
WICKERHAMII, OPORTUNISTYCZNEGO PATOGENU DLA LUDZI. BADANIE PILOTAŻOWE
OTWIERAJĄCE PROJEKT SEKWENCJONOWANIA GENOMU PROTOTHECA WICKERHAMII”.
1. NAJWAŻNIEJSZE OSIĄGNIĘCIA PROJEKTU:
a) Dobranie odpowiednich warunków dla wzrostu szczepu Prototheca wickerhamii PL1
b) Optymalizacja protokołu izolacji całkowitego DNA ze szczepu P. wickerhamii PL1 na dużą skalę
c) Ustalenie metody oddzielania DNA jądrowego i pozajądrowego
d) Izolacja genomowego DNA z P. wickerhamii PL1 na dużą skalę
e) Rozpoczęcie Zadania 2 (Sekwencjonowanie oraz składanie sekwencji)
f) Otrzymanie około 10 milionów odczytów
g) Oszacowanie wielkości genomu P. wickerhamii PL1
2. OPIS UZYSKANYCH WYNIKÓW:
ZADANIE 1. PRZYGOTOWANIE MATERIAŁU BADAWCZEGO. IZOLACJA
GENOMOWEGO DNA.
Przedmiotem badania jest szczep P. wickerhamii PL1 zdeponowany w kolekcji Zakładu Mikrobiologii
Stosowanej (Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski). Szczep wyizolowany został w Zakładzie
Mikrobiologii Klinicznej Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie, od 6-miesięcznego
dziecka, pierwszego udokumentowanego przypadku ludzkiej prototekozy w Polsce [1].
Pierwszy etap projektu obejmował rewitalizację szczepu na pożywce hodowlanej. Żywa kultura została
wyprowadzona ze stanu zamrożenia (temp. –80°C). Ponieważ do izolacji genomowego DNA na dużą
skalę niezbędne było otrzymanie znacznej ilości świeżego materiału biologicznego, optymalizowano
warunki wzrostu szczepu (szczep P. wickerhamii PL1 charakteryzuję się stosunkowo wolnym wzrostem
w standardowych warunkach hodowli Prototheca spp. opisywanych w literaturze). Hodowle były
prowadzone z lub bez wytrząsania, w temp. 37°C, na płynnych pożywkach: Lysogeny Broth (LB;
BioShop), Sabouraud Dextrose Broth (Becton, Dickinson), Potato Dexstorese Broth (PDB; BioShop),
Yeast extract Peptone Dextrose Broth (YPD; Becton, Dickinson) oraz Glucose-Peptone-Yeast extract
Broth (GPY; Becton, Dickinson). Gęstość optyczna hodowli była mierzona spektrofotometrycznie co
12 godzin (do 72 godziny) przy długości fali λ=600 nm. Najlepszy wzrost zaobserwowano dla hodowli
na pożywce YPD, inkubowanej z wytrząsaniem w temp. 37°C.
Kolejnym etapem projektu była optymalizacja protokołu izolacji całkowitego DNA ze szczepu
P. wickerhamii PL1. Początkowo DNA był izolowany z hodowli metodą z użyciem chlorku
heksadecylotrimetyloamoniowego (CTAB), jak opisano wcześniej w literaturze [2]. Metoda ta okazała
się jednak nieskuteczna (otrzymywano zbyt małą ilość DNA). Zastosowano także zestaw
GeneMATRIX Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit (Qiagen) oraz GeneMATRIX Plant &
Fungi DNA Purification Kit (Qiagen) z różnymi modyfikacjami sugerowanymi przez producenta
(dodatek enzymu lytikazy bądź β-merkaptotanolu). Jednak próby te także nie przyniosły oczekiwanych
efektów. Wykorzystano więc metodę opisaną przez Van Burik i wsp. [3], do której wprowadzano
własne modyfikacje. Ostatecznie udało się ustalić protokół do izolacji całkowitego DNA
z P. wickerhamii na dużą skalę, oparty na modyfikacji protokołu van Burik i wsp. [3].
Po etapie optymalizacji, przeprowadzono izolację jądrowego DNA zgodnie z opisanym wyżej
protokołem dla szczepu P. wickerhamii PL1 na skalę wystarczającą do dalszych analiz genomicznych
i tym samym zakończono realizację pierwszego zadania projektu.
Szczegółowy protokół izolacji DNA jądrowego z komórek Prototheca spp. będzie integralną częścią
przygotowywanej publikacji metodycznej.
ZADANIE 2. SEKWENCJONOWANIE ORAZ SKŁADANIE SEKWENCJI.
Sekwencjonowanie genomu P. wickerhamii zostało podzielone na dwa etapy. Pierwszy etap to
sekwencjonowanie DNA metodą „shotgun” celem określenia zanieczyszczenia DNA jądrowego DNA
plastydowym i mitochondrialnym. W drugim etapie pojedyncze odczyty zostaną złożone w kontigi
i zostanie stworzony pierwszy szkic genomu.
Jądrowy DNA został poddany fragmentacji. Biblioteki DNA przygotowano z wykorzystaniem
odczynników TruSeq (Illumina), zgodnie z zaleceniami producenta. Sekwencjonowanie prowadzone
było w trybie sparowanych końców (Paired-End) na platformie MiSeq z wykorzystaniem MiSeq
Reagent Kit 600-cycle v.3 (Illumina) w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy
Oligonukleotydów Instytutu Biochemii i Biofizyki P.A.N. Otrzymano około 10 milionów odczytów,
które następnie były filtrowane z wykorzystaniem FastX Toolkit (HannonLab). Trzy miliardy
nukleotydów zostały złożone z wykorzystaniem programu Newbler de novo (Roche). Otrzymano
łącznie 2860 rusztowań („scaffolds”) dla genomu, całkowita długość „scaffoldów” to 29 Mb.
Szacunkowa wielkość genomu wynosi około 35 milionów par zasad. Wielkość genomu może ulec
zwiększeniu na skutek uszeregowania występujących w nim powtórzeń sekwencji po przeprowadzeniu
kolejnych etapów sekwencjonowania.
Przyrównywanie odczytów do plastydowego oraz mitochondrialnego DNA alg wykazało, że
zanieczyszczenie jądrowego DNA DNA pozajądrowym wynosi poniżej 1%. Oznacza to, że metoda
zastosowana do oddzielania DNA jądrowego od DNA organelli okazała się skuteczna.
3. KTÓRE CELE ZAŁOŻONE WE WNIOSKU O FINANSOWANIE PROJEKTU UDAŁO
SIĘ ZREALIZOWAĆ, A KTÓRYCH NIE I DLACZEGO; CZY I JAKIE DODATKOWE
CELE OSIĄGNIĘTO.
Pierwsze zadanie projektu obejmowało etapy optymalizacji procesów (hodowli szczepu, izolacji
całkowitego DNA, izolacji jądrowego DNA), których realizacja zajęła więcej czasu niż przewidziano w
harmonogramie. W czasie trwania projektu udało się jednak zrealizować wszystkie założone etapy
optymalizacji i rozpocząć Zadanie 2. Tym samym zrealizowane zostały wszystkie cele założone we
wniosku i mimo powstałego opóźnienia, harmonogram dalszych prac jak i również termin zakończenia
realizacji projektu pozostaje niezagrożony.
4. AKTUALNY I OCZEKIWANY WPŁYW PROJEKTU NA ROZWÓJ DYSCYPLINY
NAUKOWEJ ORAZ ROZWÓJ INNYCH DYSCYPLIN
Do tej pory nie podjęto jeszcze próby sekwencjonowania genomowego DNA dla żadnego
z przedstawicieli rodzaju Prototheca. Ustalenie protokołu izolacji całkowitego DNA P. wickerhamii na
dużą skalę, jak również ustalenie metody oddzielania DNA jądrowego od DNA pozajądrowego dla tego
gatunku jest dużym sukcesem. Opracowany w trakcie trwania projektu protokół będzie przedmiotem
oryginalnej publikacji metodycznej (po raz pierwszy stworzono oryginalny protokół pozwalający na
izolację jądrowego DNA, a nie całkowitego DNA, z komórek Prototheca).
W sprawozdawanym okresie uzyskano też już pierwsze odczyty jak również oszacowano wielkość
genomu P. wickerhamii PL1. Znaczenie informacji jakich dostarczy sekwencjonowanie genomu
P. wickerhamii trudno przecenić. Realizacja projektu nie tylko pozwoli rozpoznać istotne cechy
struktury genetycznej gatunku, ale także przybliżyć jego patofizjologię i ewolucję. Uzyskana wiedza
będzie miała kapitalne znaczenie dla badań sterujących w kierunku opracowania nowych testów
diagnostycznych, wykrywających zakażania Prototheca spp., a także nowych, efektywnych leków
przeciwko temu patogenowi.
Literatura:
1. Żak I, Jagielski T, Kwiatkowski S, Bielecki J. Prototheca wickerhamii as a cause of neuroinfection
in a child with congenital hydrocephalus. First case of human protothecosis in Poland. Diagn.
Microbiol. Infect. Dis. 2012; 74:186-189
2. Roesler U, Scholz H, Hensel A. Immunodiagnostic identification of dairy cows infected
with Prototheca zopfii at various clinical stages and discrimination between infected and uninfected
cows. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 539–543
3. van Burik JA, Schreckhise RW, White TC, Bowden RA, Myerson D. Comparison of six extraction
techniques for isolation of DNA from filamentous fungi. Med. Mycol. 1998; 36: 299-303
4. Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning - a laboratory manual. Wyd.3, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001