Bionawozy zawierające izolowane, rizobiowe czynniki Nod jako

Bionawozy zawierające rizobiowe czynniki Nod jako nowy trend w uprawie roślin
motylkowatych
Dominika Kidaj*
*
Zakład Genetyki i Mikrobiologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet Marii
Curie-Skłodowskiej, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin;
[email protected]
Teoretycznie uprawy roślin motylkowatych, w tym gatunków charakterystycznych dla
Polski takich jak wyka, groch i koniczyna, są samowystarczalne pod kątem
zapotrzebowania na azot. Jednak pomimo wiedzy o niskich wymaganiach tych roślin,
wielu rolników rezygnuje z ich uprawiania. Wynika to z faktu, że uprawy te są mało
stabilne, tzn. zmienne w kolejnych latach, głównie z powodu niekorzystnej pogody i
braku,
lub
nieodpowiedniej
formy
dodatkowych
zabiegów
agrotechnicznych.
Jednocześnie w Polsce istnieje kilkudziesięcioprocentowy deficyt surowców białkowych
potrzebnych do produkcji pasz dla zwierząt, który zaspokajany jest poprzez import
śruty sojowej. Równie dobrym źródłem białka jest nasz rodzimy gatunek rośliny
strączkowej – groch i stąd potrzeba opracowania nowych bionawozów promujących
wzrost i plonowanie roślin motylkowatych.
Znaczenie biologicznego wiązania azotu
Azot to pierwiastek wchodzący w skład wszystkich najważniejszych związków
budujących każdą żywą komórkę – aminokwasów białkowych i nukleotydów kwasów
nukleinowych (DNA i RNA). Na Ziemi azot występuje w formie nieorganicznej (poza
organizmami żywymi) w ilości 98% całkowitej ilości tego pierwiastka oraz w postaci
biotycznej (w ciałach organizmów żywych i ich otoczeniu) w ilości zaledwie 2% (Krug i
Winstanley, 2002). Niestety forma gazowa azotu (N2) nie jest bezpośrednio przyswajalna
przez organizmy żywe. W naturalnych ekosystemach to proces biologicznego wiązania azotu
jest jedyną drogą wprowadzania do gleby zredukowanych związków azotowych dostępnych
dla roślin. Zjawisko biologicznej redukcji azotu jest szeroko wykorzystywane zgodnie z
założeniami nowoczesnego zrównoważonego rolnictwa, które równocześnie ogranicza
stosowanie sztucznych nawozów azotowych oraz chemicznych środków ochrony roślin.
Biologiczna redukcja azotu atmosferycznego do jonów amonowych, przyswajanych przez
1
rośliny, prowadzona jest wyłącznie przez bakterie nazwane diazotrofami (Mancinelli i in.,
1996; Mancinelli i in., 1999). Najlepiej poznaną grupą tych mikroorganizmów są bakterie z
rodzaju Rhizobium.
Rizobia występują powszechnie praktycznie we wszystkich typach gleb, ale nie mogą
wiązać azotu pozostając w formie wolnożyjącej. Dopiero symbioza tych bakterii z roślinami
motylkowatymi skutkuje redukcją azotu atmosferycznego w ilości kilkuset kg/N/ha/rok (dane
zależne od gatunków obu partnerów symbiozy oraz warunków klimatyczno-glebowych).
Symbioza z rizobiami zmniejsza zatem zapotrzebowanie roślin motylkowatych na sztuczne
nawozy azotowe, a w idealnym układzie czyni uprawy samowystarczalnymi. Uprawy roślin
motylkowatych, stosowane w płodozmianie, wzbogacają glebę w azot, który w kolejnym
sezonie wegetacyjnym wykorzystują rośliny następcze. Plony zbóż uprawianych po roślinach
motylkowatych są wyższe i powtarzalne w kolejnych latach mimo braku nawożenia
sztucznego (Hatano i Lipiec, 2004). Uprawa motylkowatych przyczynia się również do
ograniczania zanieczyszczenia środowiska, które związane jest z silnym wymywaniem z
gleby sztucznie wprowadzonego azotu. Straty te sięgają nawet 60% dawki nawozu azotowego
wprowadzonego do gleby (von Richthofen 2006) i mogą wywoływać eutrofizację
okolicznych zbiorników wodnych. Również wysokie ceny nawozów mineralnych powinny
zachęcać rolników do uprawy roślin współżyjących z bakteriami azotowymi.
Zarys przebiegu symbiozy
Interakcja roślin motylkowatych i rizobiów jest specyficzna. Dany gatunek rośliny
motylkowatej może nawiązać symbiozę jedynie z wybranym/wybranymi gatunkami rizobiów.
Wzajemne rozpoznanie się partnerów symbiozy opiera się na wymianie specyficznych
sygnałów molekularnych pochodzenia roślinnego – flawonoidów oraz bakteryjnego – czynnik
Nod (Rys. 1) (Perret i in., 2000; Spaink 2000; Jones i in., 2007).
2
Rys. 1. Proces inicjacji symbiozy w układzie Rhizobium - roślina motylkowata polegający
kolejno na: wydzielaniu induktorów flawonoidowych przez korzenie rośliny; indukcji
transkrypcji rizobiowych genów nod poprzez aktywowane specyficznym flawonoidem
regulatorowe białko NodD; uwalnianiu do środowiska glebowego czynników Nod przez
bakterie zaadsorbowane na powierzchni włośników korzeniowych; deformacjach i skręcaniu
się włośników korzeniowych w odpowiedzi na czynniki Nod; rozwoju nici infekcyjnej i
wnikaniu rizobiów do systemu korzeniowego; indukcji podziałów mitotycznych w
komórkach kory korzenia i powstaniu zawiązków brodawek, wewnątrz których bakteroidy
wiążą azot atmosferyczny.
W reakcji na swoiste flawonoidy, produkowane przez rizobia regulatorowe białko
NodD indukuje ekspresję genów nodulacji (geny nod), w wyniku czego syntetyzowany jest
niskocząsteczkowy chitolipooligosacharyd zwany czynnikiem Nod (Spaink 2000; D’Haeze i
Holsters, 2002). Sekrecja czynników Nod do środowiska glebowego wywołuje aktywację
roślinnych białek tzw. nodulin, indukcję podziałów komórkowych kory korzenia,
powstawanie brodawek i nici infekcyjnych, poprzez które następuje wnikanie rizobiów do
tworzącej się brodawki (Jones i in., 2007). Brodawki korzeniowe stanowią dla rizobiów
rodzaj „niszy ekologicznej”, wewnątrz której panują warunki beztlenowe, a bakterie
3
przyjmują postać tzw. bakteroidów – komórek redukujących azot atmosferyczny przy udziale
enzymu nitrogenazy (Kaminski i in., 1998; Patriarca i in., 2002). W zamian za zredukowane
związki azotu roślina dostarcza swoim bakteryjnym symbiontom związki węgla wytworzone
podczas fotosyntezy. Zapewniają one bakteroidom energię niezbędną do redukcji azotu
atmosferycznego (Karunakaran i in., 2009; Prell i in., 2009).
Czynniki wpływające na spadek efektywności procesu symbiozy
Wydajność
procesu
symbiozy,
czyli
po
prostu
ilość
związanego
azotu
atmosferycznego, najczęściej określa się poprzez zważenie otrzymanej biomasy uprawianej
rośliny motylkowatej, podanie ilości brodawek korzeniowych oraz liczby i masy nasion w
przypadku roślin grubonasiennych, np. fasola, groch. Niestety większość rolników w Polsce
rezygnuje z upraw motylkowatych, gdyż plony tych roślin w warunkach klimatycznoglebowych tej części Europy są raczej niestabilne i mało przewidywalne. Taki stan rzeczy
wynika z kilku przyczyn. Po pierwsze, dostępności nawet niewielkich ilości azotu
mineralnego, który pozostał w glebie po poprzedniej uprawie wspomaganej nawozami
sztucznymi. Łatwy dostęp do azotu glebowego czyni proces nawiązywania symbiozy
niekorzystnym energetycznie dla roślin. Po drugie, stosowania pestycydów, które często
niszczą lub ograniczają rozwój mikroflory glebowej, w tym populacji rizobiów (Martyniuk i
in., 1999). Po trzecie, warunków glebowo-klimatycznych w danym sezonie wegetacyjnym
takich jak: pH gleby, ilość dostępnych składników pokarmowych innych niż azot, wilgotności
i struktury gleby, temperatury itp. (Streeter 1994). I w końcu, gatunku i odmiany rośliny oraz
konkurencyjności poszczególnych szczepów rizobiów w stosunku do innych rizobiów
wchodzących w skład danej populacji glebowej. Wniosek stąd, że wbrew powszechnej opinii
rośliny motylkowate wymagają nieco większej uwagi niż sądzi o tym typowy polski rolnik.
Tradycyjne zabiegi wspomagające symbiozę
Samowystarczalność azotowa uprawy jest skutkiem wysokoefektywnej współpracy
obu partnerów symbiozy: rośliny i bakterii. Zwykle, aby zapewnić infekcję brodawek
korzeniowych przez szczepy wysokowydajne w redukcji N 2 rolnicy decydują się na
zastosowanie tradycyjnych szczepionek rizobiowych, zawierających żywe komórki bakterii.
Jest to jedna z najstarszych metod agrobiotechnologicznych. Bakterie selekcjonowane są z
populacji glebowej danego regionu rolnego, co wynika z wysokiej specyficzności doboru
symbiontów. Stąd też, np. firma BIOFOOD z Wałcza produkuje na zamówienie szczepionki
rizobiowe, które znajdują zastosowanie jedynie na terenie Polski, a działająca w Finlandii
4
firma Elomestari Ltd. wytwarza podobne szczepionki tylko na rynek skandynawski
(Lindström i in., 2010). Stosowanie szczepionek z żywymi rizobiami ma jednak sens tylko w
sytuacji, gdy dany gatunek rośliny motylkowatej nigdy nie był uprawiany na danym terenie
lub też nie był tam uprawiany przez kilka lat z rzędu. Wtedy szczep szczepionkowy nie
napotyka silnej konkurencji ze strony rizobiów lokalnej populacji glebowej (Streeter 1994;
Brockwell i in., 1995; Giller i Cadish, 1995; Skorupska i in., 2010). Doskonały przykład
stanowią uprawy soji (roślina pochodząca z Azji) w Ameryce Północnej, gdzie jak dotąd z
powodzeniem stosuje się preparat żywych kultur Bradyrhizobium japonicum (Souleimanov i
in., 2002). Natomiast charakterystyczne dla polskiego rolnictwa wyka, groch i koniczyna
uprawiane są w Polsce od dawna, a dodatkowo ich dzicy krewni są pospolitymi
przedstawicielami flory obszarów pozarolniczych. Stąd wysoka liczebność szczepów
Rhizobium leguminosarum bv. trifolii (symbiont koniczyny) i Rhizobium leguminosarum bv.
viciae (symbiont wyki, peluszki i grochu) w polskich glebach (Martyniuk i in., 2005). A
zatem głównym problemem w próbach wykorzystania szczepionek z żywymi komórkami
rizobiów w polskim rolnictwie jest brak konkurencyjności szczepów wprowadzanych do
gleby względem dużo liczniejszych autochtonów, które są jednocześnie lepiej przystosowane
do zmiennych warunków panujących w glebie.
Czynnik Nod jako składnik aktywny biopreparatu promującego wzrost roślin
motylkowatych
Obecnie, najnowszym światowym trendem w badaniach nad zwiększaniem
efektywności biologicznej redukcji N2 jest rezygnacja z tradycyjnych szczepionek z żywymi
bakteriami na rzecz biopreparatów, których substancję aktywną stanowią czynniki Nod,
izolowane
ze
specjalnie
wyselekcjonowanych
szczepów
o
wysokiej
wydajności
symbiotycznej. Podanie czynników Nod bezpośrednio na nasiona przed siewem lub
opryskanie ich roztworem kilkudniowych siewek wywołuje przyspieszenie procesu
nawiązywania symbiozy oraz zwiększenie liczby brodawek korzeniowych zasiedlanych przez
obecne w glebie rizobia autochtoniczne (Prithiviraj i in., 2003; Macchiavelli i Belles-Marino,
2004; Maj i in., 2009; Kidaj i in., 2011). Rozwiązanie takie prowadzi do zwiększenia ilości
zredukowanego
azotu
nawet
przy
niskiej
wydajności
symbiotycznej
szczepów
autochtonicznych zakażających poszczególne brodawki jednej rośliny. Omija też główne
wady inokulacji roślin tradycyjnymi żywymi kulturami rizobiów związane z wysoką
wrażliwością żywych komórek na ewentualne niekorzystne warunki występujące podczas
przechowywania oraz dozowania szczepionki (np. niedobór lub nadmiar wody, niewłaściwa
5
temperatura, pH) oraz konkurencją szczepów szczepionkowych z naturalnymi szczepami
autochtonicznymi (Streeter 1994). Dodatkowo działanie morfogenne czynników Nod
przyspiesza kiełkowanie i wzrost siewek oraz stymuluje wzrost biomasy korzeni roślin
motylkowatych (Prithiviraj i in., 2003; Macchiavelli i Belles-Marino, 2004; Maj i in., 2009;
Kidaj i in., 2011) jak i niemotylkowatych (bawełna, kukurydza) (Souleimanov i in. 2002;
Prithiviraj i in. 2003). Rizobiowe czynniki Nod okazały się również skutecznym aktywatorem
merystemów wtórnych w doświadczeniach z Daucus carota (de Jong i in. 1993), Nicotiana
tabacum (Schmidt i in. 1993), czy Picea abies (Dyachok i in. 2000). Wspomniane
eksperymenty sugerują możliwość dość uniwersalnego zastosowania czynników Nod również
na roślinach niemotylkowatych w celu skrócenia czasu kiełkowania nasion i wzrostu siewek
oraz prawdopodobnie łatwiejszego ukorzeniania roślin rozmnażanych wegetatywnie. Co
ważne, czynniki Nod wykazują aktywność biologiczną w bardzo niskich stężeniach (10 -9 10-12 M), a ich produkcja jest dość prosta i tania w porównaniu z kosztami produkcyjnymi
sztucznych nawozów azotowych.
W Polsce pionierem w badaniach nad tego typu rozwiązaniem jest Zakład Genetyki i
Mikrobiologii Wydziału Biologii i Nauk o Ziemi UMCS w Lublinie, w którym opracowano
dwa biopreparaty, zawierające czynniki Nod izolowane ze szczepów R. leguminosarum bv.
viciae GR09 oraz R. leguminosarum bv. trifolii KO17 z powodzeniem stosowane
odpowiednio w uprawach grochu i wyki oraz koniczyny (P 391 304; P 388 372). W projekt
ten zaangażowane są również Instytut Agrofizyki PAN w Lublinie oraz Instytut Uprawy
Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach.
Literatura
1. De Jong A. J., Heidstra R., Spaink H. P., Hartog M. V., Meijer E. A., Hendriks T.,
Schiavo F.L., Terzi M., Bisseling T., Van Kammen A., De Vries S. C. (1993)
Rhizobium lipooligosaccharides rescue a carot somatic embryo mutant. Plant Cell 5:
615–620
2.
D'Haeze W., Holsters M. (2002) Nod factors structures, responses and perception
during initiation of nodule development. Glycobiol 12: 79-105
3.
Dyachok J. V., Tobin A. E., Price N. P. J., von Arnold S. (2000) Rhizobial Nod
factors stimulate somatic embryo development in Picea abies. Plant Cell Rep
19:290–297
4.
Hatano R., Lipiec J. (2004) Effects of land use and cultural practices on greenhouse
gas fluxes in soil. Acta Agrophysica 111: 5-51
6
5.
Jones K. M., Kobayashi H., Davies B. W., Taga M. E., Walker G. C. (2007) How
symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model. Nat Rev Microbiol
5:619–633
6.
Kaminski P. A., Batut J., Boistard P. (1998) A survay of symbiotic nitrogen fixation
by rhizobia. In: Spaink H. P., Kondorosi A., Hooykaas P. J. (eds) The Rhizobiaceae.
Molecular biology of model plant - associated bacteria. Kluver Academic Publisher,
Dordrecht, The Netherland, pp 426-490
7.
Karunakaran R., Ramachandran V. K., Seaman J. C., East A. K., Mouhsine B.,
Mauchline T. H., Prell J., Skeffington A., Poole P. S. (2009) Transcriptomic analysis
of Rhizobium leguminosarum biovar viciae in symbiosis with host plants Pisum
sativum and Vicia cracca. J Bacteriol 191: 4002-4014
8.
Kidaj D., Wielbo J., Skorupska A. (2011) Nod factors stimulate seed germination
and promote growth and nodulation of pea and vetch under competitive conditions.
Microbiol Res doi. 10.1016/j.micres.2011.06.001 (w druku)
9.
Krug E. C., Winstanley D. (2002) The need for comprehensive and consistent
treatment of the nitrogen cycle in nitrogen cycling mass balance studies: I. Terrestial
nitrogen cycle. Sci Total Environ 293: 1-29
10.
Lindström K., Murwira M., Willems A., Altier N. (2010) The biodiversity of
beneficial microbe-host mutualism: the case of rhizobia. Res Microbiol 161: 453463 doi: 10.1016/j.resmic.2010.05.005
11.
Macchiavelli R. E., Brelles-Marino G (2004) Nod factor-treated Medicago
truncatula roots and seeds show an increased number of nodules when inoculated
with a limiting population of Sinorhizobium meliloti. J Exp Bot 55: 2635-2640
12.
Maj D., Wielbo J., Marek-Kozaczuk M., Skorupska A. (2009) Pretreatment of
clover seeds with Nod factors improves growth and nodulation of Trifolium
pratense. J Chem Ecol 35: 479–487
13.
Mancinelli R. L. (1996) The nature of nitrogen: an overview. Life Support Biosph
Sci 3:17-24
14.
Mancinelli R. L., Smernoff D. T., White M. R. (1999) Controlling denitrification in
closed artificial ecosystems. Adv Space Res 24: 329-334
15.
Martyniuk S., Oroń J., Martyniuk M. (2005) Diversity and numbers of root-nodule
bacteria (Rhizobia) in Polish soils. Acta Soc Bot Polon 74: 83-86
16.
Martyniuk S., Woźniakowska A., Martyniuk M. (1999) Interakcje pomiędzy
zaprawami chemicznymi i szczepionką Rhizobium na nasionach grochu. Post. Ochr.
7
Rośl. 39: 120-125
17.
Patriarca E. J., Tate R., Iaccarino M. (2002) Key role of bacterial NH 4+ metabolism
in Rhizobium - plant symbiosis. Microbiol Mol Biol Rev 66: 203-222
18.
Perret X., Staehelin C., Broughton W. J. (2000) Molecular basis of symbiotic
promiscuity. Microbiol Mol Biol Rev 64: 180-201
19.
Prell J., White J. P., Bourdes A., Bunnewell S., Bougaerts R. J., Polle P. S. (2009)
Legumes regulate Rhizobium bacteroid development and persistance by the supply
of
branched-chain
amino
acids.
PNAS
106:
12477-12482
doi.
10.1073/pnas.0903653106
20.
Prithiviraj B., Zhou X., Souleimanov A., Khan W., Smith D. L. (2003) A host
specific bacteria-to-plant signal molecule (Nod Factor) enhances germination and
early growth of diverse crop plants. Planta 216: 437-445
21.
Schmidt J., Röhrig H., John M., Wieneke U., Stacey G., Koncz C., Schell J. (1993)
Alteration of plant growth and development by Rhizobium nodA and nodB genes
involved in the synthesis of oligosaccharide signal molecules. Plant J 4: 651–658
22.
Skorupska A., Wielbo J., Kidaj D., Marek-Kozaczuk M. (2010) Enhancing
Rhizobium-legume symbiosis using signaling factors. In: Khan M. S. et al. (eds)
Microbes for legume improvement. SringerWienNewYork, pp 27-54
23.
Souleimanov A., Prithiviraj B., Smith D. L. (2002) The major Nod factor of
Bradyrhizobium japonicum promotes early growth of soybean and corn. J Exp Bot
376: 1929-1934
24.
Spaink H. P. (2000) Root nodulation and infection factors produced by rhizobial
bacteria. Annu Rev Microbiol 54: 257-288
25.
Streeter J. G. (1994) Failure of inoculant rhizobia to overcome the dominance of
indigenous strains for nodule formation. Can J Microbiol 40: 513-522
26.
Von Richthofen J. S. (2006) Agro-economic benefits of grain legumes in cropping
system. In: Benefits of grain legumes for European agriculture and environment:
new results and prospects. GL-Pro Dissemination Event, Brussels pp 17-26
8