19.ODWROTNA TRANSKRYPCJA (RT) I DO CZEGO SŁUŻY? RT – odwrotna transkrypcja (mRNA🡪cDNA) Na matrycy mRNA syntetyzowany jest komplementarny DNA (cDNA), co pozwala na: ❖ stwierdzenie obecności lub nieobecności transkryptów (mRNA) w danej tkance lub grupie hodowanych komórek ❖ stwierdzenie poziomu ekspresji genów = czyli określanie ilości mRNA wybranego genu w różnych analizowanych transkryptomach (tkankach) - badanych (z potencjalną ekspresją), wobec wybranych genów referencyjnych (wg tkanki) - jak również kontroli negatywnych (bez ekspresji) i pozytywnych (z ekspresją) ❖ wykrywanie patogenów, których materiałem genetycznym jest RNA (np. wirusów: HIV, zapalenia wątroby typu C-HCV, itd.) W PRZYPADKU PATOGENÓW – PCR JEST POPRZEDZONA ODWROTNĄ TRANSKRYPCJĄ (RT-PCR) ❖ RT jest wykonywana niezależnie od następującej po niej PCR, ❖ możliwe jest także wykonanie zarówno RT jak PCR przy użyciu tego samego enzymu, jednak wymaga to zmiany warunków reakcji po zakończeniu procesu RT ❖ coraz częściej pojawiają się jednak metody, w których RT oraz PCR wykonywane są przez ten sam enzym w jednej probówce – istotne znaczenie ze względu na zmniejszenie ryzyka kontaminacji CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA JAKOŚĆ RT: wybór enzymu – odwrotna transkryptaza: AMV – avian myeloblastosis virus M-MuLV – Moloney murine leukemia virus ❖ naturalne typy enzymów mają właściwości RNazy-H, która degraduje RNA zhybrydyzowane do DNA, a ponadto zmniejsza długość oraz ilość produktu cDNA, dlatego rekombinantowe M-MuLV – są najlepsze, ponieważ pozbawione aktywności RNazy-H (brak degradacji RNA w hybrydzie mRNA:cDNA) Tth DNA polimeraza + Mn 2+, w temp. 55-70°C, pozwala na zmniejszenie kłopotów: ❖ spowodowanych występowaniem struktury drugorzędowej RNA ❖ spowodowanych nieprawidłowym przyłączeniem primerów ❖ katalizuje amplifikacje cDNA JEDNA PROBÓWKA/JEDNA REAKCJA – PROTOKÓŁ: RT: ✔ Tth 60°C przez 30 min ✔ Titan 50°C przez 30 min PCR: Denaturacja wstępna - 94°C przez 2 min 35 cykli: ✔ denaturacja - 94°C przez 30 sekund ✔ przyłączenie primerów/synteza – 60-66°C przez 30 sekund ✔ wydłużanie - 72/68°C przez 30 sekund – dla Tth/Tytan ✔ końcowe wydłużanie - 72/68°C przez 7 minut dla Tth/Tytan ✔ zakończenie w 4°C 20.MODYFIKACJE PCR. AMPLIFIKACJA DNA RÓŻNYMI METODAMI PCR OGÓLNIE: ❖ powielenie fragmentu DNA (jeden gen/genom) bez konieczności jego klonowania ❖ niezbędna jest znajomość sekwencji nukleotydów DNA, który zamierza się amplifikować (wyjątek: startery wektorowe dla różnych insertów/klonów wyizolowanych z bibliotek). Na podstawie sekwencji projektuje się krótkie, kilkunasto-nukleotydowe odcinki DNA (oligonukleotydy), tzw. startery (primery), z których każdy jest komplementarny do jednej z nici badanego DNA (sensownej lub antysensownej) ❖ sekwencje rozpoznawane przez startery znajdują się zazwyczaj w odległości kilkuset lub mniej par zasad od siebie, zatem powstający amplikon ma taką długość (pz), jaka odległość dzieli od siebie startery. PCR – PRZEPROWADZENIE OK. 30 CYKLI (3 ETAPY – 1 CYKL) ❖ 92-96°C – denaturacja (topnienie) – rozdzielenie dsDNA Wstępna denaturacja powinna trwać od 2 do 10 min, w zależności od czystości matrycy, termostabilności enzymu, długości amplifikowanego produktu (krótsze fragmenty DNA są łatwiej denaturowane niż dłuższe). Denaturacja matrycy w kolejnych cyklach może być skrócona do 20-60 sekund – dla zachowania aktywności polimerazy ❖ 55°C (37-72°C) – hybrydyzacja/przyłączanie starterów do matrycy Dobór temperatury jest najbardziej krytycznym etapem PCR (zbyt niska powoduje niespecyficzne przyłączanie starterów). Optymalne stężenie matrycy i starterów warunkuje efektywne przeszukiwanie genomu w celu znalezienia komplementarnej sekwencji. Przy nadmiarze starterów można amplifikować w wyższej temperaturze i uzyskiwać większą specyficzność tzw. czystość produktu. Optymalny czas to 20-40 sekund ❖ 72°C – wydłużanie łańcucha od końca 3’-OH poprzez dosyntetyzowanie kolejnych dNTP przez polimerazę DNA komplementarnych do matrycy Wydłużanie w ostatnim cyklu może trwać nawet 5-15 min, co pozwala na zakończenie amplifikacji wszystkich nowo-syntetyzowanych nici DNA PODSTAWOWE TYPY MODYFIKACJI PCR W ZAKRESIE: ❖ czasu trwania poszczególnych etapów ❖ liczby cykli ❖ zakresu temperatur ❖ stężenia i liczby substratów 1A. A MPLIFIKACJA WEWNĘTRZNA (NESTED – NPCR) Nested PCR to technika zmniejszająca niespecyficzną amplifikację matrycy DNA. Jest wykonywany przez dwa kolejne testy PCR. Pierwsza reakcja jest przeprowadzana ze starterami pokrywającymi sekwencję docelową i kilkoma dodatkowymi sekwencjami flankującymi oba końce sekwencji docelowej. Po pierwszej reakcji przeprowadza się drugą reakcję na produktach pierwszej reakcji PCR ze starterami, które wiążą się z sekwencją docelową i znajdują się w amplifikowanej sekwencji pierwszej reakcji PCR. Zmniejsza to ilość niespecyficznego wiązania, ponieważ w drugiej reakcji większość amplikonów pierwszej reakcji zawiera tylko sekwencję docelową i otaczające ją sekwencje. ❖ podstawa: pojawienie się w probówce fragmentu DNA o określonej długości (amplikon) z reguły oznacza powielenie fragmentu poszukiwanego genu ❖ cel: wewnętrzny PCR pozwala zwiększyć czułość, dzięki dodatkowej amplifikacji produktów wcześniejszej reakcji z drugą parą wewnętrznych primerów. ❖ jest metodą sprawdzającą specyficzność amplifikacji pierwszego etapu PCR ❖ primery mają sekwencje komplementarne do odcinków znajdujących się w obrębie już powielonego amplikon/fragmentu DNA w pierwszym etapie PCR ❖ uzasadnienie: bardzo niewielkie jest prawdopodobieństwo, że kolejność ułożenia zasad w innych genach będzie tworzyć taką samą sekwencje w badanym genie ❖ amplikony niespecyficzne różnią się długością od oczekiwanego amplikon specyficznego. Teoretycznie istnieje jednak prawdopodobieństwo pojawienia się produktów niespecyficznych ❖ konieczne jest zatem sprawdzenie czy powielono fragment badanego genu lub pseudogenu (southern lub sekwencjonowanie) Zalety modyfikacji nPCR: ❖ podnosi znacznie czułość detekcji umożliwiając wykrycie amplikonów niewykrywalnych elektroforetycznie po I etapie PCR ❖ stanowi dobrą weryfikację specyficzności powstałego amplikonu. Pomimo zgodnej z oczekiwaną długością amplikonu niespecyficznego (fałszywie dodatnim), o tyle prawdopodobieństwo uzyskania przypadkowego, niespecyficznego amplikonu po wewnętrznym PCR jest bardzo małe ❖ inna metoda potwierdzenia specyficzności amplifikacji – to hybrydyzacja Southern powielonego dsDNA (ssDNA związanego na membranach nylonowych) ze znakowaną sondą oligonukleotydową (lub sondą z fragmentu DNA), komplementarną do powielonego odcinka (amplikonu) ❖ zwiększenie czułości przeprowadzanej amplifikacji, umożliwiając np. ujawnienie obecności produktu (np. wirusa) w przypadku, gdy jego ilość była zbyt mała, by powielone fragmenty mogły być wykryte w żelu po zewnętrznej PCR (w 1 etapie) 2A. ILOŚCIOWY PCR ( QUANTITATIVE QPCR) Ilościowy PCR (qPCR) jest używany do wykrywania, charakteryzowania i ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych w wielu zastosowaniach. Zwykle w RT-qPCR transkrypty RNA są określane ilościowo przez odwrotną transkrypcję najpierw na cDNA, a następnie przeprowadza się qPCR. Podobnie jak w przypadku standardowego PCR, DNA jest amplifikowane w 3 powtarzających się etapach: denaturacja, renaturacja i elongacja. Jednak w qPCR znakowanie fluorescencyjne umożliwia gromadzenie danych w miarę postępu PCR. Technika ta ma wiele zalet ze względu na szereg dostępnych metod i chemii. W qPCR opartym na barwniku (zwykle zielonym), znakowanie fluorescencyjne pozwala na ilościowe oznaczenie amplifikowanych cząsteczek DNA poprzez zastosowanie barwnika wiążącego dsDNA. Podczas każdego cyklu mierzona jest fluorescencja. Sygnał fluorescencji wzrasta proporcjonalnie do ilości replikowanego DNA, a zatem DNA jest określane ilościowo w „czasie rzeczywistym”. Wadą qPCR opartego na barwniku jest to, że w danym momencie można zbadać tylko jeden cel i że barwnik będzie wiązał się z dowolnym ds-DNA obecnym w próbce. W qPCR opartym na sondach wiele celów można wykryć jednocześnie w każdej próbce, ale wymaga to optymalizacji i zaprojektowania sondy (s) specyficznej dla celu, używanej oprócz starterów. Dostępnych jest kilka typów konstrukcji sond, ale najpopularniejszym typem jest sonda hydrolizująca, która zawiera fluorofor i wygaszacz. ❖ pozwala na uzyskanie nie tylko wyniku jakościowego lecz także umożliwia ilościową ocenę wyjściowej zawartości poszukiwanego mRNA-cDNA. ❖ ze względu na niejednakową amplifikację tego samego materiału w różnych reakcjach czy nawet w tej samej reakcji lecz w różnych probówkach (zależy od ilości dodanej matrycy), konieczna jest kontrola procesu amplifikacji ❖ taką kontrolę PCR zapewnia ko-amplifikacja tzw. standardu (np. B-aktyna) wraz z badanym cDNA/mRNA, przy użyciu dwóch par tych samych primerów amplifikujących różne geny (badany/referencyjny) Zalety qPCR: ❖ ponieważ ilość amplikonu zależy od stosunku niezmiennej ilości standardu (tylko teoretycznie – ponieważ zależnej od ilości dodanej matrycy, tzn. kontroli) w stosunku do zmiennej ilości (ekspresji) matrycy badanego genu, a więc na podstawie stosunku ilości powstałych amplikonów można oszacować rzeczywistą zawartość poszukiwanej matrycy/genu w badanej próbce (programy spektrofotometrii) ❖ jako standard w ilościowej RT-PCR można stosować wybrane cDNA/ jako RNA-kontrolne ❖ stosowanie cDNA jest łatwiejsze (bardziej stabilne, łatwiejsze do syntezy i utrzymania), jednak bardziej miarodajne wyniki zapewnia wybranie zastosowania standardu RNA- wprowadzonego lub głównie już obecnego na etapie odwrotnej transkrypcji (zależy od metody – tj. typu starterów używanych do RT) INNE BADANIA TRANSKRYPTÓW 🡪 CDNA 2B. QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QRT-PCR) ❖ to metoda badania transkryptów w czasie rzeczywistym ❖ z użyciem barwników fluorescencyjnych – fluorochromów (np. Sybr Green lub TagMan) ❖ pozwalających na pomiary wzrostu ilości amplikonów cDNA 3. TD PCR (TOUCH DOWN) Touchdown (TD) PCR oferuje prosty i szybki sposób optymalizacji reakcji PCR, zwiększając specyficzność, czułość i wydajność, bez konieczności długotrwałej optymalizacji i / lub przeprojektowywania starterów. TD-PCR wykorzystuje początkową temperaturę przyłączania powyżej przewidywanej temperatury topnienia ( T m ) stosowanych starterów, a następnie stopniowo przechodzi do niższej, bardziej permisywnej temperatury przyłączania w trakcie kolejnych cykli. Każda różnica w T m pomiędzy prawidłowym i nieprawidłowym przyłączaniem „annealingiem” da podwójną przewagę na cykl. TD-PCR znalazł szerokie zastosowanie w standardowych protokołach PCR, w tym PCR zależnym od odwrotnej transkryptazy, a także w generowaniu bibliotek cDNA i skriningu polimorfizmu pojedynczego nukleotydu. TD-PCR jest szczególnie przydatny w przypadku szablonów, które są trudne do amplifikacji, ale można je również standardowo stosować do zwiększania specyficzności i tworzenia produktu. Procedura trwa od 90 do 120 minut, w zależności od długości szablonu. wysoka temperatura „annealingu” podczas kilku pierwszych cykli (3-5°C > Tm) a następnie obniżanie temp. (o kilka °C / co kilka cykli) 4. PCR – IN SITU ❖ metoda ta polega na amplifikacji poszukiwanego RNA bezpośrednio w komórkach (ISH/FISH) ❖ poszukiwany transkrypt/ISH lub gen/FISH jest wykrywany przy wykorzystaniu metod autoradiograficznych (emulsje Kodak), immunohistochemicznych (substraty do aktywności enzymów) lub fluorescencyjnych (emisja) ❖ zmiana koncentracji starterów 5. A SYMETRYCZNY PCR – TYLKO 1 STARTER NP. DO SEKWENCJONOWANIA, MUTAGENEZY LUB PRODUKCJI SOND ❖ sense – na matrycy linearyzowanego plazmidu (za insertem) ❖ anty-sense – na innej matrycy linearyzowanego plazmidu (przed insertem) ❖ Lub dwa PCRy dwustopniowe (re-amplifikacja na matrycach amplikonów z dwóch różnych amplifikacji) INNE MODYFIKACJE PCR: Np. składników (innych niż startery): ❖ Hot-start PCR- polimeraza blokowana (INHIB): przeciwciała lub metale Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) to metoda amplifikacji określonych fragmentów DNA. Podczas przygotowywania testu, przed cyklem termicznym, reakcje PCR utrzymują się w temperaturze pokojowej, może wystąpić niespecyficzna amplifikacja, prowadząca do niepowodzenia PCR. Aby uniknąć niespecyficznej amplifikacji, opracowano kilka metod znanych jako hot start PCR , które hamują aktywność enzymatyczną PCR aż do zakończenia pierwszego etapu denaturacji. Metody PCR z gorącym startem osiągają to poprzez modyfikacje polimerazy DNA - w celu zablokowania amplifikacji i pozostania nieaktywnymi do czasu osiągnięcia wyższych temperatur. Typowe modyfikatory polimerazy DNA obejmują mechanizmy chemiczne, oparte na przeciwciałach lub aptamerach. W reakcji PCR masz swój szablon, który zawiera sekwencję docelową, która Cię interesuje. Potrzebujesz także starterów, dNTP i polimerazy DNA typu hot-start, którą wybierzesz. Polimeraza DNA hot-start pozostanie nieaktywna w temperaturze pokojowej, ponieważ został dodany enzym hot-start. Dlatego nie musisz martwić się o wzmocnienie rozpoczynające się przed wejściem do termocyklera ❖ Long PCR – długie amplikony wymagają większej koncentracji dNTP oraz Taq polimerazy ZASTOSOWANIA DIAGNOSTYCZNE: ❖ Duplex PCR – dwie pary starterów, amplikony tego samego genu ❖ HD PCR – więcej niż dwie pary starterów, amplikony różnych rejonów tego samego lub różnych genów ❖ Multiplex PCR – najczęściej więcej niż dwie pary starterów (min. 6), amplikony różnych rejonów tego samego genu (różne mutacje), DNA fingerprinting – kilka par starterów (3-4 specyficznych alleli dla badanej populacji (alu, SNP (single nucleotide polymorphism), STR (short tandem repeats), VNTR (variable numer of tandem repeats) ❖ PCR-RFLP – analiza amplikonów z wybranymi restryktazami w celu identyfikacji mutacji (genotypów) ❖ ASA PCR – allele specyfic amplification (jeden ze starterów jest wspólny (W), a drugi specyficzny (M-allelu zmutowanego, lub N – norma) ❖ ASO PCR – allele specyfic oligonucleotide (sondy oligo = southern) oligonukleotyd specyficzny względem allelu ❖ RACE PCR – szybka amplifikacja zakończeń cDNA PRZYKŁADY ZASTOSOWANIA PCR – ZALETY: Ułatwienia laboratoryjne: ❖ Amplifikacja fragmentu DNA o znanej sekwencji nukleotydowej (startery genomowe) ❖ Amplifikacja fragmentu DNA (tylko insertów) o nieznanej sekwencji nukleotydowej (startery wektorowe) ❖ Wprowadzenie „nowego miejsca sekwencji” dla wybranej restryktazy (startery modyfikowane) ❖ Mutageneza ukierunkowana – wprowadzenie nieznacznych zmian w sekwencji DNA (startery mutagenne) ❖ Asymetryczny PCR = amplifikacja jednoniciowych (ssDNA) znakowanych odcinków DNA (podczas sekwencjonowania oraz produkcji specyficznych sond sense lub antysense – do in situ hybrydyzacji) Badania przeszłości: ❖ Amplifikacja fragmentów genomu ludzkiego z kości liczących do 7,5 tysiąca lat (wystarczy 2-5% ekstraktu uzyskanego z 2 gramów kości) ❖ Amplifikacja DNA ze zbiorów zielnikowych, skór lub preparatów mikroskopowych 5µm zakonserwowanych formaliną w parafinie ❖ Podstawy do badań ewolucji i stosunków filogenetycznych (rodowych) pomiędzy gatunkami Diagnostyka medyczna (chorób medycznych i wirusowych) ❖ Analiza zmutowanej wersji genu (ASO, ASA PCR, RFLP itd.) ❖ Analiza obciążeń genetycznych poprzez analizę rodowodów ❖ Bezpośrednia metoda badania defektywnych alleli genów wielu chorób dziedzicznych (np. diagnostyka mukowiscydozy, dystrofii mięśniowej Duchennea, anemii sierpowatej, itd…) ❖ Analiza zmian ekspresji wybranego genu w wyniku działania czynników środowiskowych Kryminalistyka („fingerprints”) – charakterystyczne elementy genomu ludzkiego (STR – short tandem repeats, np. sekwencje Alu i inne typu SINEs i LINEs u naczelnych) umożliwiające określenie tożsamości osobniczej wynikają z różnorodności sekwencji polimorficznych (wyjątek bliźnięta jednojajowe) ❖ Ustalenie/wykluczenie ojcowska ❖ Udowodnienie tożsamości przestępcy np. PCR z włosa, cebulki (gDNA) lub trzonu (mtDNA) utraconych kilka miesięcy przez analizą lub kropli krwi, nasienia, śliny itd. Ale, np. z obfitych śladów pozostawionej krwi/nasienia można też stosować: ❖ RFLP – polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych ❖ ASO – hybrydyzacja z sondami allospecyficznymi ❖ STR i VNTR – badanie zmiennej liczby tandemowych powtórzeń w sekwencjach mikro-satelitarnych (indywidualizacja kryminalistyczna) ❖ I wiele innych testów w genetycznej diagnostyce medycznej 21.RODZAJE STARTERÓW STOSOWANYCH W RT-PCR ORAZ ZRÓŻNICOWANIE UZYSKIWANYCH PRODUKTÓW. Rodzaj startera Primer oligo(dT) Hybrydyzuje do: Endogenny ogon poli(A) eukariotycznego mRNA, zakotwiczone oligo(dT) mają jedną resztę G, C lub A na końcu 3’ (kotwica) Random Długość od hexamer-prim sześciu do er dziewięciu zasad, Zalety: Wady: Generuje cDNA pełnej długości z mRNA Dobry jeżeli mało jest materiału wyjściowego Kotwica zapewnia, że starter oligo (dT) wiąże się na końcu 5’ ogona poli (A) mRNA Najlepsza metoda do badania wielu różnych RNA Przyłączają się do wszystkich RNA Amplifikuje tylko sekwencję z ogonem poli (A) cDNA skrócone o wewnętrzne pierwotne położenie poli(A) cDNA składa się ze wszystkich RNA, co nie łączą się w wielu punktach wzdłuż transkryptu RNA Primery specyficzne dla sekwencji nukleotydowej Niestandardowe startery ukierunkowane na określoną sekwencję mRNA Dobry do stosowania w przypadku transkryptów ze znaczącymi strukturami drugorzędowymi lub jeśli mało jest materiału wyjściowego Wysoka wydajność cDNA Dobra metoda do zdegradowania RNA Specyficzna pula cDNA Zwiększona swoistość i czułość RT-PCR Najlepsza metoda do badania rodziny RNA 22.RODZAJE PRODUKTÓW RT W ZALEŻNOŚCI OD ZASTOSOWANEGO STARTERA. CO POWSTAJE PO RT? zawsze jest pożądane i może osłabiać sygnał mRNA cDNA może być skrócone Synteza jest ograniczona do jednego genu będącego przedmiotem zainteresowania A. random hexamer-primer (6-nukleotydowe) - cDNA wszystkich transkryptów (lub ich fragmentów) - dobra metoda do zdegradowania RNA B. oligo(dT) primer - cDNA wszystkich transkryptów (tylko tych bez ich fragmentaryzacji) - najlepsza metoda do badania wielu różnych RNA (czas/lokalizacja) C. primery specyficzne dla sekwencji nukleotydowej - cDNA wybranych transkryptów (tylko tych bez ich fragmentaryzacji) - najlepsza metoda do badania rodziny RNA (czas/lokalizacja) 23.WYMAGANIA WARUNKUJĄCE EFEKTYWNOŚĆ PCR. 1) matryca – analizowane jednoniciowe DNA powinno mieć znane już odcinki sekwencji nukleotydowej (ilość jakość, czystość i brak fragmentaryzacji) - optymalna ilość DNA > 10 4 cDNA = stężenie końcowe <10 ng/µl - częste błędy, za dużo plazmidowego DNA, lub zbyt mało genomowego DNA 2) startery (primery) – para syntetycznie skonstruowanych krótkich łańcuchów nukleotydowych komplementarnych do wektora (z insertami) lub do końców zdefiniowanej sekwencji matrycowego DNA (przygotowanych w stężeniu 10µM) - użyteczna długość starterów to 14-40 nt, optymalna 18-20 nt - optymalna zawartość zasad G oraz C = 40-75% - 3’ końce starterów powinny być wzajemnie niekomplementarne (dimery) - nie powinny tworzyć struktur drugorzędowych - należy unikać nierównej dystrybucji rejonów bogatych w G/C lub A/T - komplementarne do sekwencji genomu – wysoce konserwatywnych odcinków - powinny być specyficzne do pojedynczego locus w rodzinie genów 3) mieszanina czterech trójfosforanów deoksy-nukleotydów (dNTP, N=A, G, T, C – mieszanina zawierająca dATP, dCTP, dGTP, dTTP w stężeniu 2,5mM) 4) termostabilna polimeraza DNA – stężenie i jakość – polimerazy bakterii termofilnych, odpornych na działanie wysokich temperatur, np. polimeraza Taq bakterii Thermus aquaticus 5) termocykler: - duża dokładność utrzymania temperatury i powtarzalność działania - idealna zgodność zmian temperatury w każdej części bloku grzewczego, ok. 1-2°C/s - substancje zapewniające aktywność polimerazy – jakość buforu (10x stężony) - olej mineralny – zapobiegający parowaniu mieszaniny. Nie jest potrzebny w nowej generacji termocyklerów z podgrzewaną płytą górną 24.PODOBIEŃSTWA I RÓŻNICE METOD PRZESIEWANIA BIBLIOTEK. PRZESIEWANIE Z SONDAMI DNA LUB IMMUNOSCREENING OLIGONUKLEOTYDAMI (S) Rozcieńczanie biblioteki Infekowanie E.coli Mieszanie z agarozą i wylewanie na płytki Inkubacja Naniesienie membran na płytki z łysinkami Naniesienie membran nasączonych Xgal/IPTG na płytki z łysinkami - denaturacja dsDNA związanych z membranami Płukanie membran - neutralizacja membran - płukanie membran - wiązanie ssDNA do membran (+80 °C/2 h) Prehybrydyzacja Blokowanie membran Hybrydyzacja membran ze zdenaturyzowaną sondą Inkubacja membran z I-przeciwciałami w TBST Płukanie (usuwanie nadmiaru sondy) Płukanie membran w TBST Autoradiografia Inkubacja z II-przeciwciałami-koniugat (+enzym AP) Wywołanie klisz X-ray Płukanie i barwienie (NBT/BCIP Identyfikacja pozytywnych nowych klonów Porównanie filmów do płytek z klonami Porównanie membran do płytek z klonami Izolacja zidentyfikowanych klonów z płytek agarozowych Wypłukanie klonów z agarozy Przygotowanie „stocków” do kolejnych przesiewań (3-4x) Potwierdzenie homogeniczności pojedynczych klonów (jak przy przesiewaniu) 25.ETAPY KONSTRUKCJI BIBLIOTEK GENOMOWYCH (GDNA). TYPY BIBLIOTEK: ❖ Genowe (cDNA) – syntetyzowane na matrycach mRNA (mRNA>cDNA: zawierające 5’UTR, ORF oraz 3’UTR wielu różnych genów ulegających ekspresji w danej tkance wg okresowych zmian ekspresji podczas rozwoju) ❖ Genomowe (gDNA) – syntetyzowane na matrycy gDNA wybranego taxonu (zawierają fragmenty struktur wszystkich genów: promotory, eksony oraz introny itd., np. regulacyjne sekwencje 3’UTR/ do analizy miRNA) ❖ Ekspresyjne (cDNA>białko) – pozwalające na produkcje wybranego białka zrekombinowanego (w różnych systemach: E. coli, drożdże, bakulowirusy), zamiast izolacji białka natywnego (z tkanek) (najbezpieczniej syntetyzować biblioteki ekspresyjne na matrycy wybranego klonu wyizolowanego z biblioteki cDNA) 1) Pocięcie DNA enzymami restrykcyjnymi 2) Włączenie fragmentów DNA do plazmidów 3) Wprowadzenie zrekombinowanych plazmidów do komórek bakterii 3x wady restryktaz: ❖ Nie „tną” genów tak jak chciałby biotechnolog lub biolog ❖ Nie pozwalają na wycięcie całego genu z promotorem ❖ Niestety działają wyłącznie specyficznie w stosunku do sekwencji gDNA 26.ETAPY KONSTRUKCJI BIBLIOTEKI GENOWEJ (CDNA) W pierwszym etapie izoluje się RNA danej tkanki czy typu komórek. Następnie oddziela się mRNA, które stanowi tylko 1–5% całkowitego RNA komórki. Wykorzystuje się unikalną cechę mRNA polegającą na występowaniu ogona poliA na końcu 3’. Mogą one hybrydyzować łączyć się z syntetycznym oligonukleotydem złożonym z deoksytymidyny – oligodT. Można więc przykładowo przepuścić preparat RNA przez kolumnę z oligodT-celulozą lub dodać oligodT związany z magnetycznymi kuleczkami do lizatu komórkowego i odłączyć mRNA od reszty mieszaniny za pomocą silnego magnesu. Następnie sprawdza się, czy mRNA nie uległ degradacji. Można wykorzystać w tym celu bezkomórkowe systemy translacji np. lizat retikulocytów królika lub elektroforezę żelową. Do syntezy cDNA na matrycy mRNA wykorzystywany jest enzym odwrotna transkryptaza. Wymaga to startera, którym zwykle jest oligodT. Do syntezy drugiej nici, po zniszczeniu nici mRNA przez hydrolizę alkaliczną, można jako starter zastosować oligodG. Zwykle dokonuje się również obróbki końców cDNA, aby uzyskać lepkie końce ułatwiające wprowadzenie go do wektora. cDNA są stosunkowo krótkie 0.5–10 kpz, dlatego do klonowania często stosuje się wektory plazmidowe. Do uzyskania dużej liczby klonów stosowane są również wektory pochodne faga λ, głównie do konstruowania ekspresyjnych bibliotek cDNA. Są to biblioteki zaprojektowane w taki sposób, aby zoptymalizować ekspresję wprowadzonego fragmentu DNA. Etapy: 1) Izolacja mRNA z transkryptomów (różnych komórek), w których następuje ekspresja interesującego nas transkryptu 2) Przyłączenie do mRNA pierwszego syntetycznego startera-linkera (oligo dT + np. z wbudowaniem sekwencji dla Xho I 3) Synteza pierwszej nici cDNA z odwrotną transkryptazą 4) Usunięcie mRNA przez hydrolizę alkaliczną 5) Synteza 3’ końca pierwszej nici cDNA z transferazą końcową 6) Przyłączenie drugiego syntetycznego startera-linkera (np. dla EcoR I) 7) Synteza drugiej nici cDNA (z Klenow polimerazą lub odwrotną transkryptazą) z wbudowaną sekwencją restryktazy EcoR I 8) Podwójne trawienie restrykcyjne z EcoR I oraz Xho I 9) Ligacja cDNA (linker-cDNA-linker) do ramion bakteriofaga Lambda ZAP II 10) Pakowanie in vitro bakteriofaga 11) Transfekcja/transformacja odpowiednich/wybranych szczepów E.coli 12) Podwójna weryfikacja rekombinantów (XL 1-Blue tetraR/pBluescriptampR) 27.PRZESIEWANIE BIBLIOTEK Z ZASTOSOWANIEM SOND DNA LUB OLIGONUKLEOTYDOWYCH. Cel: izolacja specyficznych cDNA reprezentujących mRNA Metody: 1) Hybrydyzacja kwasów nukleinowych 2) Immunologiczna detekcja specyficznych antygenów 3) SIB – metoda stara i pracochłonna Preferowana jest 1. oraz 2. metoda, ale wymagane są : ❖ Specyficzne sondy (gatunkowe/międzygatunkowe) ❖ Specyficzne przeciwciała (brak natywnych lub zrekombinowanych antygenów do immunizacji HYBRYDYZACJA MEMBRANOWA Z SONDAMI (SOUTHERN – NAJLEPSZA): ❖ Pozwala na hybrydyzację w różnych warunkach restrykcyjnych ❖ Bardzo czuła, więc można selekcjonować mniejszą liczbę klonów Do przygotowania sond: ❖ Wymagane jest posiadanie jednorodnych matryc – chociaż krótkich odcinków homologicznych sekwencji DNA szukanych klonów, np. źródło – identyczny lub pokrewny gen sklonowany już u innego gatunku ❖ Czy homologia sekwencji DNA jest wystarczająca? – lepiej sprawdzić przed przystąpieniem do przesiewania cDNA biblioteki, tzn. Southern lub Northern hybrydyzacje ( w różnych warunkach) z dostępnymi sondami DNA innych gatunków ❖ Sondy cDNA – wbudowanie radioaktywnych nukleotydów (32P-dNTP podczas PCR/Southern) lub synteza 35S-UTP („sense lub antysense”/ISH) podczas odwrotnej transkrypcji na matrycy cDNA), ale tylko dla genów występujących z dużą częstotliwością, co najmniej 1/200 mRNA ❖ Podwójna hybrydyzacja daje najlepszą wiarygodność ❖ Sondy syntetycznych Oligonukleotydów (14-20) – utworzone in vitro z dNTP, zgodnie z fragmentami znanych sekwencji nukleotydowych lub z domniemanych sekwencji nukleotydowych znanych już sekwencji aminokwasów w interesujących nas białkach Autoradiograficzny screening (Southern) – najlepszy I. II. Infekcja XL 1 -blue bakteriofagami Hodowle na stałym podłożu III. Łysinki – odcisk na membrany NY lub NC 1. Etap – wybór klonów. Hybrydyzacja długich sond (3-4x) 2. Etap – potwierdzenie jednorodności klonów (hybrydyzacja sond specyficznych) 3. Etap – selekcja klonów (5’, 3’ – końce) hybrydyzacja z sondami „oligo” (metoda dot-blod) SIB selekcja klonów cDNA – stara metoda, najbardziej pracochłonna oraz często mało skuteczna. Skuteczność – ze 100 klonów cDNA – można wyselekcjonować produkt translacyjny, reprezentujący tylko 0,03% całkowitego komórkowego mRNA Produkcja in vitro biologicznie aktywnych białek w hodowanych komórkach ssaków – tylko dla małych białek pozwalających na uzyskanie prekursorów polipeptydowych o pełnej długości. Immunologiczna detekcja specyficznych antygenów Przeciwciała monoklonalne czy poliklonalne? ❖ Poliklonalne – możliwość znacznych reakcji krzyżowych z innymi antygenami – duże tło, tzn. niespecyficzne wiązanie ❖ Monoklonalne – rozpoznają tylko pojedyncze epitopy – wymagana więc duża liczba różnych przeciwciał Jest to metoda mało czuła – tylko 1/6 klonów ❖ Tylko dla klonów, w których cDNA zostało wklonowane do wektora w prawidłowym kierunku („in frame”) i ORF – cDNA muzą być pełnej długości, a ich produkt musi tworzyć biologicznie oraz antygenowo produkt w komórkach gospodarza ❖ Przeciwciała muszą rozpoznawać zdenaturowane białka, np. można to sprawdzić analizą Western ❖ Negatywna dla mRNA, którego jest 1 kopia na komórkę lub mniej ❖ Wymagany sposób selekcji, np. „drugie” przeciwciała koniugowane np. z fosfatazą alkaliczną + substraty NBT/BCIP PRZESIEWANIE BIBLIOTEKI (IZOLACJA POJEDYNCZYCH GENÓW) 1. Hodowle infekowanych bakterii na podłożu agarowym 2. Odcisk łysinek na membrany nylonowe (NY) lub nitrocelulozowe (NC, ale jedynie do immuno-przesiewania) 3. Hybrydyzacja membran z sondą (najlepiej znakowany fragment cDNA innego gatunku, lub sondy oligonukleotydowe) 4. Izolacja pozytywnych łysinek z agarozy 5. Pozyskiwanie – wypłukiwanie bakteriofagów (bakterie utylizujemy chloroformem) 6. Powyższe czynności (pkt 1-5 powtarzamy wielokrotnie, min. 3-4 razy), aż do etapu uzyskania pojedynczych łysinek – klonów 7. Potwierdzenie jednorodności klonów – hybrydyzacja 8. Amplifikacja hodowlana bakteriofagów obejmuje: infekcję bakterii kompetentnych, wypłukanie bakteriofagów i zabezpieczenie w -70 °C (główny zapas) oraz 4 °C (zapas na bieżące potrzeby) 9. IVE (in vivo excision) – wycięcie przyżyciowe pBluescripta z Lambda ZAP II 10.Wykorzystanie fagów pomocniczych (np. R408, M13KO7 itp.) 11.Selekcja klonów rekombinantowych na podłożu (X-gal/IPTG), białe kolonie zawierają interesujący nas gen, a niebieskie – to tylko sam pBluescript 12.Izolacja kolonii bakteryjnych i ich namnażanie – hodowla w LB lub NZY 13.Zabezpieczenie (glicerol, -70 °C) transformowanych bakterii jako źródła do izolacji plazmidów (materiału do tzw. mini-prepsów) 14.Hodowla rekombinantów – transformowanych bakterii ( z insertami interesujących nas genów) 15.Izolacja plazmidów rekombinantowych klonów) 16.Wstępna ocena ilości i jakości wyizolowanych plazmidów 17.Pomiary spektrofotometryczne 18.Elektroforeza agarozowa 19.Korekty (np. doczyszczanie plazmidowego DNA) 20.Trawienie enzymami restrykcyjnymi + elektroforeza (profil fragmentów służy do wstępnego określenia przynależności klonów do różnych podgrup) 21.Wstępna selekcja klonów (hybrydyzacja lub PCR) 22.Analiza kompletności sekwencji (czy mają końce 5’ i 3’) 23.Analiza specyficzności (poszczególnych podgrup klonów) 24.Sekwencjonowanie DNA wyselekcjonowanych klonów 25.Ustalenie/potwierdzenie sekwencji w obydwie strony (sense i antysense) 26.Porównanie homologii sekwencji w bazie GenBank (zestawienie różnic sekwencji ze znanymi już tzw. zdeponowanymi sekwencjami innych genów) CO UMOŻLIWIA PRZESIEWANIE BIBLIOTEK CDNA/GDNA Pozyskanie jednorodnej matrycy cDNA wymaganej do wielu kolejnych analiz: ❖ Ustalenie komórkowej lokalizacji ekspresji transkryptów (ISH-hybrydyzacja in situ/ różne sondy cDNA: diagnostyczna – AS i kontrolna – SE) ❖ Konstrukcja bibliotek ekspresyjnych (produkcja białka rekombinantowego) wg cDNA, zamiast izolacji białka natywnego z tkanek) ❖ Badanie funkcji produktów genów (wpływu białek) Pozyskanie jednorodnej matrycy gDNA (z biblioteki genomowej) wymaganej do: ❖ Ustalenia struktury organizacyjnej genów (sekwencji eksonów i intronów) ❖ Ustalenia sekwencji promotora (regulacja ekspresji) ❖ Ustalenia lokalizacji genów na chromosomach (FISH) 28.TYPY PRODUKCJI SOND MOLEKULARNYCH Z UDZIAŁEM RÓŻNYCH ENZYMÓW TYPY PRODUKCJI SOND (MOŻLIWE ZNAKOWANIE): ❖ Terminalne lub ❖ Równomierne rozmieszczenie znacznika/ izotopu w całej sekwencji sondy, przez wielokrotną inkorporację znakowanych nukleotydów NAJWAŻNIEJSZE METODY: 1. Znakowanie (3’ lub 5’) terminalne – wprowadzanie znakowanego nukleotydu na koniec 3’ lub 5’ sondy (najczęściej syntetycznego oligonukleotydu): - znakowanie końca 3’ – z zastosowaniem końcowej deoksynukleotydylo-transferazy (TdT) – dodanie serii znakowanych deoksynukleotydów do końca 3’ - znakowanie końca 5’ – z zastosowaniem [γ32]ATP przy pomocy polinukleotydowej kinazy faga T4 (PNK). Zamiana γ fosforanu w pozycji 5’ -hydroksylowej oligonukleotydu. Wymagania do produkcji sond oligo-nt: ❖ Musi być znana sekwencja nukleotydowa badanego genu – co pozwala na syntezę komplementarnego oligonukleotydu (>20-30 nt) ❖ Można zastosować kilka Oligonukleotydów, których sekwencje można przewidywać na podstawie znanej sekwencji aminokwasowej (-) 2. Znakowanie PCR Zalety: ❖ ❖ ❖ ❖ można produkować sondy dwuniciowe (inkorporacja wybranego znakowanego dNTP) można stosować tylko jeden (np. [α32P]-dNTP lub więcej znakowanych dNTP można produkować różne sondy +/- („SE i AS” 1x/3x) radioaktywność sond warunkuje bardzo dużą czułość detekcji Wady: ❖ musimy posiadać jednorodne matryce (cDNA) ❖ musimy znać sekwencje nukleotydowe badanego genu ❖ musimy posiadać syntetyczne startery (16-20 oligo-nt) 3. wydłużanie startera – polega na użyciu mieszaniny heksanukleotydów (6-nt) o losowej sekwencji, które po niezbyt specyficznej hybrydyzacji do matrycy pozwalają polimerazie Klenowa na produkcję nici komplementarnej, wbudowując w sondę nukleotydy znakowane wady: ❖ metoda pozwala na syntezę jedynie dwuniciowych sond ❖ sonda może być niespecyficzna, jeżeli matryca (z wektorem) zastosowana do produkcji będzie niespecyficzna do poszukiwanego genu 4. ❖ ❖ ❖ transkrypcja in vitro Tworzenie sond cRNA przy pomocy polimerazy RNA T7m T3 lub SP6 Pozwala na tworzenie jednoniciowych sond (sense+ antysense) Przepisanie DNA (cDNA lub eksonowe gDNA na znakowane cRNA 5. Przemieszczanie pęknięć (ang. Nick translation) Wady: ❖ Polega na losowym nacinaniu nici matrycy DNA przez DNazę I i dalszej syntezie znakowanej nici komplementarnej począwszy od miejsca nacięcia ❖ Pozwala na syntezę jedynie dwuniciowych sond ❖ Ilość powstałego, znakowanego produktu (sondy) nigdy nie przekracza ilości matrycy użytej do znakowania ODCZYNNIKI WYMAGANE DO PRODUKCJI SOND MOLEKULARNYCH: 1. Matryca – tzn. gDNA lub mRNA przepisane na cDNA 2. Polimeraza do syntezy DNA lub cRNA - Klenow fragment polimerazy DNA E.coli - polinukleotydowa kinaza faga T4 (PNK) - końcowa deoksynukleotydylo-transferaza (TdT) - odwrotna transkryptaza - Taq polimeraza 3. Startery: - syntetyczne specyficzne dla danego genu (produkacja w automatycznych syntezatorach oligo-nt) - syntetyczne niespecyficzne (heterogeniczne: wszystkie cztery zasady w każdej pozycji) - naturalne niespecyficzne (heterogeniczne w sekwencji, tzn. pozyskane przez trawienie DN-azą i uzyskanego DNA z cielęcej tarczycy lub spermy łososia), to fragmenty jedno-niciowe o długości ok. 6-12 nt. 4. Znakowane nukleotydy [α32P]-dNTP lub [γ 32P]NTP (N=A,T,C,G) 5. Nieznakowane wszystkie 3 lub 4 typy wolnych dNTP (3x oraz 1/10 czwartego/tego samego co znakowany) – jako prekursory do syntezy DNA, lub UTP do syntezy cRNA 29.METODY PRODUKCJI SOND MOLEKULARNYCH JEDNO- I DWUNICIOWYCH. Sonda molekularna – Fragment DNA lub RNA, wykorzystywany do lokalizowania sekwencji komplementarnych w DNA/RNA lub służący do oceny poziomu ekspresji RNA za pomocą hybrydyzacji kwasów nukleinowych, cząstki takie są najczęściej znakowane radioaktywnymi izotopami, fluorochromami lub związkami barwnymi. Hybrydyzacja – spontaniczny, w pełni odwracalny proces łączenia jednoniciowych komplementarnych nici kwasów nukleinowych w strukturę dwuniciową. Polega na powstawaniu wiązań wodorowych między hybrydami (DNA:DNA, RNA:RNA, DNA:RNA; gdzie DNA – gDNA lub cDNA, RNA – mRNA lub cRNA). Typy hybrydyzacji: membranowe/po elektroforezie (Southern/Northern); membranowe/bez elektroforezy (odciski łysinek; slot-blot, dot-blot); na skrawkach tkanek lub komórkach; na chromosomach metafazowych Dobór warunków hybrydyzacji jest bardzo ważny, najważniejszą rolę pełnią jednak dobór typu i produkcja specyficznej sondy (znakowanej terminalnie lub przez równomierną inkorporację wybranego znacznika). Sondy dzielimy na (ze względu na pochodzenie matrycy): ⮚ sekwencje cDNA wklonowane do efektywnych wektorów (np. plazmidowych) ⮚ sondy gDNA bezpośrednio pochodzące z genomu (fragment wycięty restryktazą, najlepiej amplikony gDNA) ⮚ syntetyczne „oligo” (oligomery/oligonukleotydy do PCR) Matryce wymienione wyżej są konieczne do produkcji sond jedno- lub dwuniciowych. Typy sond: ⮚ Długie (>100 pz dwu-/jednoniciowe) o wymagają jednorodnej matrycy cDNA lub gDNA (inserty lub amplikony) o matryce mogą zawierać sekwencje eksonów kodujących podobne domeny różnych białek (mniejsza specyficzność) o ZALETA: hybrydyzacja z sondami długimi jest mniej zmienna (łatwiejsza) niż z sondami oligomerycznymi ⮚ Krótkie (oligo-nt, najlepiej >30nt) o sondy jednoniciowe (jest zaletą ale tylko gdy nie występuje zjawisko samo-annealingu) o automatyczna synteza oligo-nt (wymaga jednorodnych matryc) pozwala na produkcję dowolnej ilości specyficznych sond (np. sekwencji alleli zmutowanych i normalnych) o sonda może mieć bardzo dużą specyficzność (bliską do Tm [T topnienia] co umożliwia detekcję mutacji punktowych) o oligosondy mają duży współczynnik dyfuzji, dlatego szybciej hybrydyzują, ale łatwiej dysocjują (można je usunąć) Typy produkcji sond (możliwe znakowanie): ⮚ terminalne na końcach sondy ⮚ równomierne rozmieszczenie znacznika w całej sekwencji sondy przez wielokrotną inkorporację znakowanych nukleotydów (np. α32P-dATP) Metody: 1.) Znakowanie (3’ lub 5’) terminalne Polega na wprowadzeniu znakowanego nukleotydy na koniec 3’ lub 5’ sondy (najczęściej pochodzą one z syntetycznego oligonukleotydy). Znakowanie radioaktywne Znakowanie końca 3’ prowadzi deoksynukleotydylo-transferazy (TdT) deoksynukleotydów do końca 3’. się z zastosowaniem końcowej poprzez dodanie serii znakowanych Znakowanie końca 5’ z zastosowaniem [γ32P] ATP przy pomocy polinukleotydowej kinazy faga T4 (PNK). Zamiana γ-fosforanu w pozycji 5’-hydroksylowej oligonukleotydu. Wymagania do produkcji sond oligo-nt: ⮚ musi być znana sekwencja nukleotydowa genu badanego – pozwala to na syntezę oligonukleotydu komplementarnego (20-30 nt) ⮚ można zastosować kilka oligonukleotydów, których sekwencje można przewidywać na podstawie znanej sekwencji AA 2.) Znakowanie PCR o Można produkować sondy dwuniciowe (inkorporacja wybranego znakowanego dNTP), przy czym możliwe jest stosowane tylko jednego lub więcej znakowanych dNTP. o Możliwa jest produkcja różnych sond +/- („SE i AS” (sense i antisense; 1x/3x). o Radioaktywność sond warunkuje bardzo dużą czułość detekcji o WADA: musimy posiadać jednorodne matryce (cDNA) o WADA: musimy znać sekwencje nukleotydowe badanego genu o WADA: musimy posiadać syntetyczne startery (16-20 oligo-nt) 3.) Wydłużanie startera (ang. Random priming) Polega na użyciu mieszaniny heksanukleotydów (6-nt) o losowej sekwencji, które po niezbyt specyficznej hybrydyzacji do matrycy pozwalają polimerazie Klenowa na produkcję nici komplementarnej, wbudowując w sondę nukleotydy znakowane. Wadami tej metody są kwiestie takie jak: możliwość syntezy jedynie sond dwuniciowych oraz to, że sonda może być niespecyficzna, jeżeli matryca z wektorem zastosowana do produkcji będzie niespecyficzna do poszukiwanego genu. 4.) Transkrypcja in vitro o tworzenie sond cRNA przy pomocy polimerazy RNA T7, T3 lub SP6 o pozwala na tworzenie jednoniciowych sond (sense+antisense) o przepisanie DNA (cDNA lub eksonowe gDNA na znakowanie cRNA) ⮚ 2 sposoby: o Linearyzowana matryca do produkcji jednoniciowej sondy „AS” z udziałem T3 o Linearyzowana matryca do produkcji jednoniciowej sondy „SE” z udziałem T7 Enzym – restryktaza polilinkera 5.) Przemieszczanie pęknięć (ang. Nick translation) o Polega na losowym nacinaniu matrycy DNA przez DNazę I i dalszej syntezie znakowanej nici komplementarnej, począwszy od miejsca nacięcia o Pozwala na syntezę jedynie sond dwuniciowych o Ilość powstałej, znakowanej sondy nigdy nie przekracza ilości matrycy użytej do znakowania Czynniki potrzebne do produkcji sond molekularnych: 1.) Matryca – tzn. gDNA lub mRNA przepisane na cDNA 2.) Polimeraza – do syntezy DNA lub cRNA: a. Klenow fragment polimerazy DNA E.coli b. polinukleotydowa kinaza faga T4 (PNK) c. końcowa deoksynukleotydo-transferaza (TdT) d. odwrotna transkryptaza e. polimeraza Taq 3.) Startery a. syntetyczne specyficzne dla danego genu (synteza w automatycznych syntezatorach oligo-nt) b. syntetyczne niespecyficzne (heterogeniczne: wszystkie 4 zasady azotowe w każdej pozycji) c. naturalne niespecyficzne (heterogeniczne w sekwencji, tzn. pozyskane przez trawienie DNazą I uzyskanego DNA z cielęcej tarczycy lub spermy łososia), fragmenty jednoniciowe o długości ok. 6-12 nt. 4.) Znakowane nukleotydy – nukleotydy [α32P]dNTP lub [γ 32P]dNTP (N=A/T/G/C) 5.) Nieznakowane nukleotydy – wszystkie 3 lub 4 typy wolnych dNTP (3x oraz 1/10 czwartego/ tego samego co znakowany) – prekursory do syntezy DNA, lub UTP do syntezy cRNA 30.SONDY ZNAKOWANE IZOTOPOWO I NIEIZOTOPOWO (WADY I ZALETY). 1.) Nieizotopowe znakowanie sond – polegające na terminalnym (końcowym) dołączeniu lub równomiernym wbudowaniu w sondę znacznika (np. biotyny lub digoksygeniny), co wymaga dodatkowego systemu immunodetekcji (zazwyczaj immunochemiczna), której czułość zależy od stosowanego markera enzymatycznego (+mE, każdy enzym wymaga innych substratów). Wady immunodetekcji: ⮚ zapewnia dobrą rozdzielczość kosztem dużo gorszej czułości ⮚ wystarczająco dobra do hybrydyzacji, jedynie gdy posiadamy specyficzne przeciwciała ⮚ w metodzie bezpośredniej – przeciwciała I-rzędowe np. anty-biotynowe/digoksygeninowe, które muszą być z jakimś wybranym +mE ⮚ w metodzie pośredniej – wymaga dodatkowego zastosowania przeciwciał II-rzędowych (+mE), które będą rozpoznawać Ig gatunku zwierząt, u których wyprodukowano przeciwciała I-rzędowe ⮚ rozpad przeciwciał I i II rzędowych oraz koniugowanych +mE, następując podczas dłuższego przechowywania sondy uniemożliwia detekcję ⮚ koniecznie wymagany wybór metody detekcji o zadowalającej czułości (najlepszy jest system z fosfatazą alkaliczną – AP [chociaż w kontakcie było mówione, że niby lepsze HRP]) 2.) Znakowanie izotopowe sond – wprowadzenie terminalne lub równomierne do sondy NTP znakowanego izotopem promieniotwórczym (β-emitery: 35S, 32P lub 33P). Detekcję sygnału prowadzi się poprzez autoradiografię, tzn. ekspozycję kliszy albo emulsji fotograficznej na działanie promieniowania hybryd: a. sonda/badany ssDNA na mNY+ (Southern/klisza) b. sonda/badany mRNA na mNY+ (Northern/klisza) c. sonda/badany mRNA w komórkach (aISH/emulsja) Zaletą tej metody jest bardzo duża czułość detekcji. Wadą jest natomiast samo stosowanie izotopów promieniotwórczych: stosowanie ich wymaga specjalnych uprawnień, wymaga specjalnej utylizacji, rozpad samego izotopu może prowadzić do zaburzenia struktury sondy oraz one same są problematyczne w użytkowaniu (okres połowicznego rozpadu) 31.JAK OCENIĆ LICZEBNOŚĆ TRANSKRYPTÓW? Efektywne metody określania liczby genów: gDNA po działaniu wybranych restryktaz, z wybranymi sondami fragmentów genów, w których brak miejsc działania tych restryktaz. (przepisane żywcem, nie wiem ocb) 1.) Analiza różnorodności mRNA (tj. liczebności transkryptów) metodą RPA – protekcji dwuniciowych hybryd (mRNA/sonda cRNA): a. całkowite („total”) wyizolowane RNA b. sonda „antisense” specyficzna do najbardziej zmiennych (nie-konserwatywnych fragmentów poznanych sekwencji cDNA badanych genów) 2.) Mapowanie RNA z nukleazą S1 o stosujemy w celu określenia lokalizacji zakończeń 5’ oraz 3’ mRNA na matrycy DNA o w celu określenia połączeń 5’ i 3’ w odniesieniu do miejsc działania restryktaz w klonowanych genach lub dwuniciowych cDNA o w celu określenia ilości i różnorodności typów mRNA w całkowitym RNA (wyizolowanym z tkanek lub komórek) ⮚ Metoda obejmuje o hybrydyzację denaturowanego DNA z RNA (sonda antysense DNA dla badanego fragmentu) lub analiza Southern produktów po elektroforezie o trawienie z nukleazą S1 (wyłącznie fragmenty jednoniciowe) o elektroforeza fragmentów trawienia o identyfikacja fragmentów z odpowiednimi sondami (Southern) 32.JAK OCENIĆ LICZEBNOŚĆ RODZINY GENÓW W DOWOLNIE WYBRANYM GENOMIE? 33.SEKWENCJONOWANIE DNA METODĄ SANGERA SKŁADNIKI NIEZBĘDNE DO SEKWENCJONOWANIA METODĄ SANGERA; ENZYMY STOSOWANE W METODZIE SEKWENCJONOWANIA DNA (WYDAJNOŚĆ, WADY I ZALETY); STRATEGIE SEKWENCJONOWANIA. Metoda Sangera (1977 rok) – enzymatyczna metoda z wykorzystaniem autoradiografii lub fluorescencji. W metodzie tej wykorzystuje się dideoksynukleotydy (ddNTP), które nie posiadają tlenu ani przy 2’ C ani przy 3’ C (w deoksyrybozie), co uniemożliwia przyłączenia się kolejnego nukleotydu wiązaniem fosfodiestrowym = zatrzymanie wydłużania łańcucha DNA. Do probówek z deoksynukleotydami, tylko 1 z nich to dideoksynukleotyd. Probówek jest 4, w każdej z nich jest inny ddNTP. Wyróżniamy 5 etapów: 1.) preparatywny PCR – otrzymanie homogennego DNA 2.) denaturacja – otrzymanie matrycy jednoniciowej 3.) synteza nowych nici z użyciem startera dNTP i ddNTP 4.) elektroforeza na żelu poliakryloamidowym (PAGE) ze stałym stężeniem środka denaturującego 5.) analiza prążków Dideoksynukleotydy: ⮚ w miejscach 2’ i 3’ mają atomy wodoru zamiast OH – uniemożliwia to dalszą polimeryzację łańcucha, ze względu na to, że OH bierze udział w tworzeniu w. fosfodiestrowego ⮚ ddNTP mogą zostać wbudowane w łańcuch przez polimerazy DNA do łańcucha DNA (dzięki istnieniu w ddNTP grupy 5’ fosforanowej) ⮚ ddNTP w małej ilości współzawodniczą z czterema pozostałymi konwencjonalnymi dNTP w mieszaninie syntezy DNA, której stawką jest wydłużenie lub zakończenie syntezy łańcucha ⮚ Powstają 4 grupy łańcuchów oligonukleotydowych, których długość określa dystans pomiędzy zakończeniem primera (wykorzystywanego do zainicjowania syntezy DNA), a miejscem niedojrzałego zakończenia tej syntezy ⮚ Stosując 4 różne ddNTP w 4 oddzielnych reakcjach enzymatycznych powstają 4 różne grupy oligo-nt zakończone w pozycjach zajmowanych przez A, C, G lub T w nici matrycowego DNA Odczynniki niezbędne do wykonania metody Sangera: 1.) Matryca – mogą być wykorzystane jedynie superczyste ssDNA oraz dsDNA – denaturowane termiczne lub alkalicznie 2.) Primer – komplementarny do matrycy dla denaturowanych nici dsDNA lub uniwersalny – dla sekwencji wklonowanych w region MCS wektora 3.) Polimerazy – mogą być stosowane: 4.) Znakowane dNTP – można stosować nukleotydy znakowane fosforem 32P lub siarką 35 S. Lepsza jest siarka, przy fosforze występują 2 problemy: a. α32P to silne β-emitery, które powodują trudno czytelne fragmenty w górnej części autoradiogramu – ze względu na dyfuzję b. rozpad 32P (T1/2 = 14 dni) powoduje rozpad DNA i nieczytelne autoradiogramy, jeżeli mieszaniny nie są wykorzystane w ciągu 2-3 dni Siarka eliminuje te problemy (T1/2 = 87 dni; słabsza emisja) i dodatkowo mieszaniny reakcyjne można przechowywać przez 1 tydzień w -20°C i ponownie analizować. Analogi dNTP Są to regiony z dużą zawartością G+C, które powodują wewnętrzne struktury (ściśnięcia), trudne do zdenaturowania podczas elektroforezy PAGE, a sekwencjonowanie jest utrudnione. W tym przypadku wykorzystuje się analogi nukleotydowe: dITP, 7-deazę-dGTP oraz enzymy (Sequenaza lub Taq DNA, lepiej tolerujące analogi) Sekwencjonować zamiast z siarką można również ze srebrem. Wyniki są podobne, koszty utylizacji są mniejsze, metoda jest również bardzo szybka (wyniki ~10h). Wadą jest to, że filmy EDF (konieczne do uzyskania trwałych wyników, jak autoradiogramy) są bardzo drogie, konieczny jest też skaner dużych rozmiarów i rozdzielczości optyczniej minimum 600 dpi. Porównanie: 5.) ddNTP – ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP – potrzebne do zatrzymania wydłużania łańcucha 6.) Bufor – nadający odpowiednie pH i posiadający jony Mg2+ Obok metody Sangera istnieje również metoda Gilbert & Maxam (1980) polegająca na degradacji chemicznej DNA. ⮚ powstała podczas badań interakcji in vitro pomiędzy lac operatorem i lac opresorem ⮚ nie zmieniana dotychczas (czego nie można powiedzieć o Sangerze) ⮚ pozwala na badania interakcji białka-DNA Działanie: ⮚ Fragment znakowanego DNA na jednym końcu jest częściowo degradowany w 5 oddzielnych reakcjach chemicznych ⮚ Powstaje 5 populacji znakowanych cząsteczek, które ulegają wydłużeniu do tzw. znakowanego terminatora do miejsca degradacji ⮚ Rozdział prowadzi się na żelu PAGE Sukces tej metody zależy w dużej mierze od degradacji DNA prowadzonej w 2 etapach: 1.) Specyficzne zasady lub typy zasad ulegają modyfikacji chemicznej 2.) Zmodyfikowane zasady zostają oddzielone od cukru oraz ulegają modyfikacji ich wiązania fosfodiestrowe 5’ i 3’ Modyfikacje: Degradacja powoduje powstawanie fragmentów znakowanych o długości od kilku do kilkuset nt. Każda degradacja prowadzona jest w ściśle określonych warunkach. Po degradacji rozdział elektroforetyczny i autoradiogram pozwalają na porównanie linii: G, A+G, C+T, C oraz A>C. Zalety tej metody: nie wymagają żadnych polimeraz ani primerów Najlepsze wyniki uzyskuje się dla sekwencji leżących <250 nt od znakowanego końca. 34.PORÓWNANIE JAKOŚCI WYNIKÓW NUKLEINOWYCH ORAZ BIAŁEK. UZYSKIWANYCH PODCZAS SEKWENCJONOWANIA KWASÓW 35.WYMIENIĆ EMITERA). NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE IZOTOPY DO PRODUKCJI SOND (PODAĆ OKRES PÓŁTRWANIA, TYP Najczęściej stosowane – Fosfor 32 (32P) oraz siarka 35 (35S) 36.TYPY IZOTOPOWO ZNAKOWANYCH DNTP STOSOWANYCH DO EFEKTYWNEJ AUTORADIOGRAFII. 37.ZAKRES PENETRACJI KLISZ AUTORADIOGRAFICZNYCH NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE Β-EMITERY. Chyba to? 35 S – zaledwie 0,25 mm (wynika to z energii maksymalnej 0,167 MeV) 32 P – do 6 mm (energia maksymalna 1,71 MeV) PRZEZ 38.NA CZYM POLEGA AUTORADIOGRAFIA? Autoradiografia – proces trwałego utrwalania wyników hybrydyzacji: Zasada działania autoradiografii: Emitery promieniowania β tzn. 32P, 35S penetrują kliszę lub emulsję fotograficzną, działając na kryształy srebra emulsji fotograficznej (pokrywającej kliszę albo komórki). Wyrzut elektronów przyciąga dodatnio naładowane kationy srebra, które precypitują w miejscu działania promieniowania β. Od sposobu uwidaczniania zależy jaki izotop zastosujemy, dla przykładu: radioaktywna siarka emituje promieniowanie o niewielkiej energii, co pozwala na penetrację kliszy o głębokości zaledwie 0,25 mm (dlatego nie powinno się owijać blotów w folię żywnościową), a fosfor radioaktywny ma energię większą, co pozwala na penetrację wody/ plastiku do głębokości 6 mm i całkowicie przenika przez kliszę fotograficzną. W celu wzmocnienia sygnału można stosować ekrany intensyfikujące (pobudzone przez β emitują protony, które wzmacniają sygnał. Wzmocnienie 5x można uzyskać przez stosowanie ekranów w niskich temperaturach [-70°C]). Fluorografia – autoradiografia słabych β-emiterów takich jak 3H, 14C czy 35S, może zostać wzmocniona chemicznie. Wzmacniacze te są fluoroscencyjne i emitują protony, które wzmacniają promieniowanie. Pozwala ona na: 3 H – detekcję, niemożliwą konwencjonalną autoradiografią 14 C, 35S – wzmocnienie sygnału 10-krotnie Oryginalnie żel radioaktywny: ⮚ ⮚ ⮚ ⮚ ⮚ płukano w DMSO impregnowano w scyntylatorze PPO usuwano DMSO suszono eksponowano do kliszy fotograficznej w -70°C Obecnie: ⮚ stosuje się Salicylate (alergiczny związek, wchłania się pod skórę!) ⮚ stosuje się wzmacniacze fluorowe (płyn lub spray) np. En3Hance i inne
