Ćwiczenie laboratoryjne 7 Charakterystyka kwaśnej fosfatazy z homogenatu ziemniaka Celem ćwiczenia jest: • wyznaczenie optimum pH dla reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę • wyznaczenie szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez kwaśną fosfatazę Wprowadzenie Enzymy są biokatalizatorami umożliwiającymi przebieg reakcji enzymatycznej w komórce poprzez obniżenie energii aktywacji katalizowanej reakcji. Do cech charakteryzujących enzymy jako katalizatory należą: • wydajność katalityczna - zdolność przyśpieszania reakcji 106-1012 razy, • swoistość pod względem substratu, reakcji lub substratu i reakcji, • działanie w łagodnych warunkach temperatury i pH, • zmiana aktywności enzymów pod wpływem czynników środowiskowych i dostosowanie jej do aktualnych potrzeb komórki czy organizmu. Podstawy kinetyki enzymatycznej Kinetyka enzymatyczna stanowi dział enzymologii zajmujący się zagadnieniami związanymi z szybkością reakcji katalizowanych enzymatycznie. Szybkość reakcji enzymatycznej (V) jest miarą katalitycznego działania enzymu i jest ona w pewnym zakresie proporcjonalna do stężenia substancji reagujących; wyznacza ją przyrost stężenia produktu reakcji w czasie. Miarą szybkości reakcji w danym momencie jest więc wzrost stężenia produktu, jaki następuje w jednostce czasu. Przy stałym stężeniu enzymu i substratu szybkość powstawania produktu reakcji powinna być wprost proporcjonalna do czasu reakcji. W rzeczywistości tylko w początkowej fazie reakcja ta jest reakcją pierwszego rzędu (Rys.1), co znaczy, że szybkość działania enzymu jest liniową funkcją czasu – jest to tzw. szybkość początkowa reakcji enzymatycznej (V 0). Rys.1. Wzrost ilości produktu reakcji enzymatycznej w czasie Wartość V0 uzyskuje się przez wykreślenie linii prostej stycznej do początkowego odcinka krzywej, poczynając od czasu zerowego. Nachylenie tej prostej ma wartość V0. Dla badań kinetyki enzymów in vitro niezwykle ważne jest więc określenie czasu reakcji, w którym przyrost produktu reakcji enzymatycznej jest wprost proporcjonalny do czasu. 1 Na szybkość reakcji enzymatycznej wpływają m.in.: • temperatura – każdy enzym ma optymalną temperaturę działania – dla większości mieści się ona w granicach 35-45°C. Wyższe temperatury powodują denaturację białek (wyjątek: archeony i niektóre bakterie: 80-90°C), • pH – większość enzymów działa optymalnie w pH bliskim obojętnego. Są enzymy, które działają najlepiej w środowisku kwaśnym (pepsyna pH 1,5-2,7) lub zasadowym (trypsyna, chymotrypsyna pH 8-9). Rys. 2. Zależność aktywności enzymu od pH (wg Koolman i Röhm 2005) Optymalną wartość pH (czyli taką wartość pH, przy której aktywność enzymu jest maksymalna) wyznacza się z wykresu zależności aktywności enzymatycznej od pH, który przyjmuje najczęściej postać krzywej w kształcie dzwonu. Środowisko silnie kwaśne i silnie zasadowe (skrajne wartości pH) działa denaturująco, niszcząc nieodwracalnie aktywność enzymów. Niewielkie zmiany pH nie dezaktywują enzymu, ale obniżają szybkość reakcji, ponieważ wpływając na stopień jonizacji enzymu i substratu, zmieniają warunki tworzenia się kompleksu enzym-substrat. • stężenie substratu – kiedy [S]< KM, to V0 = (Vmax/KM)/[S] i szybkość reakcji jest proporcjonalna do stężenia substratu. W przypadku gdy [S]> KM to V0=Vmax to szybkość reakcji osiąga wartość maksymalną, niezależną do stężenia substratu. CZĘŚĆ DOŚWIADCZALNA Fosfataza kwaśna (EC 3.1.3.2) należy do 3 klasy enzymów, czyli hydrolaz – enzymów, które katalizują hydrolityczny rozpad wiązań chemicznych, do podklasy enzymów hydrolizujących wiązania estrowe, czyli esteraz i do podpodklasy hydrolaz monoestrów fosforanowych, czyli enzymów katalizujących odszczepienie reszty fosforanowej od estrów kwasu fosforowego. Poza naturalnymi substratami, hydrolazy monoestrów fosforanowych rozszczepiają także estry fosforanowe fenoli, np. p-nitrofenylofosforan. 2 Odczynniki i sprzęt: • 1 ziemniak • Próbówki szklane • Łaźnia wodna • Spektrofotometr UV-VIS • 0,9% NaCl • 8 mM p-nitrofenylofosforan w H2O • 0,1 M NaOH •0,5 M bufory Tris-octan o pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 Zasada metody W celu wyznaczenia optimum pH kwaśnej fosfatazy, podobnie jak w przypadku wyznaczania szybkości początkowej reakcji katalizowanej przez ten enzym, wykorzystuje się substrat - p- nitrofenylofosforan (pNPP). Enzym hydrolizując p-nitrofenylofosforan, uwalnia p-nitrofenol, który w środowisku zasadowym tworzy żółto zabarwiony anion p-nitrofenolanowy. Natężenie barwy mierzone przy λ=405 nm jest proporcjonalne do ilości zhydrolizowanego substratu. Wykonanie doświadczenia: A. Izolacja ekstraktu enzymatycznego Obrany i umyty ziemniak zetrzeć na tarce, przesączyć przez gazę. Wyciąg z ziemniaka zawierający kwaśną fosfatazę wstawić do lodu. B. Wyznaczanie optimum pH kwaśnej fosfatazy 1. Do sześciu ponumerowanych próbówek laboratoryjnych wprowadzić po 0,25 ml 8mM pnitrofenylofosforanu i 0,25 ml odpowiedniego buforu, kolejno od pH 4,0 do 6,5. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach dla każdego pH. 2. Zawartość probówek wymieszać i wstawić je do łaźni wodnej o temp. 300C na 5 minut. 3. Przygotować 25 mL 250x rozcieńczonego wyciągu z ziemniaka zawierającego kwaśną fosfatazę (wyciąg rozcieńczyć do 25 mL używając 0,9% roztworu NaCl). 4. Do preinkubowanych prób (zawierających substrat i bufor) ogrzanych w łaźni wodnej do temp. 300C dodać po 0,5 ml rozcieńczonego 250x roztworu enzymu. 5. Próby inkubować przez 15 minut w temperaturze 30 0C, po czym reakcję zakończyć dodając do każdej z nich po 5 ml 0,1M roztworu NaOH. 6. Próbę kontrolną (zerową) wykonać równolegle z próbami badanymi w następujący sposób: do probówki wprowadzić 0,25 ml buforu o pH 5,0 oraz 0,25 ml roztworu p nitrofenylofosforanu. Mieszaninę inkubować przez 15 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH, a dopiero na końcu dodać 0,5 ml enzymu. 7. Natężenie barwy zmierzyć wobec próby kontrolnej (zerowej) przy λ=405 nm. 8. Wykreślić krzywą zależności szybkości hydrolizy p-nitrofenylofosforanu (wyrażoną jako absorbancja przy 405nm) od pH. 3 C. Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji Wyznaczanie szybkości początkowej reakcji hydrolizy pNPP wykonujemy używając 10x, 50x, 100x i 250x rozcieńczeń wyciągu z ziemniaka (różne stężenie enzymu) - wyciąg należy rozcieńczyć 0,9% roztworem NaCl do 25 ml. 1. Do probówek wprowadzić po 0,25 ml buforu Tris-octan o pH optymalnym dla aktywności kwaśnej fosfatazy (wyznaczonym w punkcie B) i 0,25 ml roztworu substratu. Próby wykonać w dwóch powtórzeniach. 2. Próby wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 300C. Reakcję enzymatyczną rozpocząć dodając do każdej próby po 0,5 ml ekstraktu ziemniaczanego o odpowiednim rozcieńczeniu (10x, 50x, 100x lub 250x). Próby inkubować: 2, 4, 6, 8, 10 i 12 minut. 3. Reakcję zakończyć przez dodanie do każdej probówki po 5 ml 0,1M roztworu NaOH (w kolejności takiej jak dodawano enzym). 4. Próby kontrolne (zerowe) należy przygotować w następujący sposób: do probówki wprowadzić 0,25 ml buforu o pH optymalnym dla aktywności fosfatazy kwaśnej (wyznaczonym w punkcie B) oraz 0,25 ml pNPP. Mieszaninę inkubować 12 minut w łaźni wodnej razem z próbami badanymi, po czym dodać 5 ml 0,1M roztworu NaOH i na koniec 0,5 ml enzymu o danym rozcieńczeniu. 5. Dokonać pomiaru absorbancji przy λ=405 nm wobec próby kontrolnej (zerowej). Na podstawie otrzymanych wyników należy wykreślić zależność szybkości hydrolizy p- nitrofenylofosforanu (wyrażonej jako wartości absorbancji przy 405 nm) od czasu inkubacji, dla odpowiedniego rozcieńczenia enzymu. Piśmiennictwo: 1. Berg JM, Tymoczko, JL, Stryer L – Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005. 2. Koolman J, Röhm K-H – Biochemia. Ilustrowany przewodnik. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2005. 4
