Biologia molekularna roślin
advertisement
Wielkoskalowa charakterystyka genomów Chromatyna Chromatyna wypełnia jądro komórkowe 23 ludzkie chromosomy w jądrach fibroblastów we wczesnej profazie Maksymalny stopień kondensacji DNA osiąga w chromosomach Białka histonowe Chromatyna trawiona nukleaza, oryginał z pracy Hewish and Burgoyne 1973 Dean Hewish, 1973 Leigh Burgoyne, 1973 Trawienie chromatyny MNazą - drabinka nukleosomowa „Sznur korali” (‘beads on the string’) Olins & Olins, 1973 http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/N/Nucleus.html Roger Kornberg w 1974 r. zaproponował model, w którym DNA owinięty jest wokół rdzenia histonowego tworząc nukleosom NUKLEOSOM JEST PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ STRUKTURALNĄ CHROMATYNY Fałd histonowy Złożenie fałdów (hand shake) Konserwowane elementy na obrzeżu oktameru Oktamer – oddziaływanie z DNA Mutacje SIN znoszą oddziaływania oktameru z DNA Składanie nukleosomu Zaginanie i zwijanie DNA na oktamerze • Ściśle zwinięta lewoskrętna superhelisa ma ok. 80 pz na zwój i skok superhelikalny ok. 27,5 A. Ekspozycja miejsc w helisie DNA na oktamerze Struktura krystalogtaficzna cząstki rdzeniowej nukleosomu Karolin Luger Timothy Richmond Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60 Schemat nukleosomu Nukleosomy - terminologia 8 histonów: Po dwa każdego z: H2A H2B H3 H4 Gräff and Mansuy (2008). Behav Brain Res. Organizacja chromatyny Podwójna helisa DNA 2 nm Histony + DNA. “Koraliki na sznurku” f Komórka roślinna 11 nm Włókna nukleosomowe 30-nm (solenoid) 30 nm Włókna połączone z macierzą jądrową 300 nm Nuclear Matrix Umiejscowienie H1 w nukleosomie Regulacyjna rola chromatyny Struktura a funkcja chromatyny Zmiany struktury chromatyny • modyfikacje DNA • modyfikacje potranslacyjne histonów • wyspecjalizowane warianty histonów • ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny Metylacja DNA, Metylomy Metylacja DNA zamienia cytozynę w 5-metylo cytozynę Metylacja DNA ma znaczenie biologiczne Arabidopsis 46-dni od wysiania NH2 N O NH2 CH3 N N O N ~ ~ cytosine 5-methylcytosine WT met1/cmt3 Xiao, et al.(2006). The Plant Cell. 18: 805-814 Metylacja DNA u eukariontów • Nie jest uniwersalna, występuje u ssaków i roślin kwiatowych • Jest zmienna gatunkowo, tkankowo i chromosomowo • Rozpoznawana przez rodzinę białek zawierających domenę (MBD) wiążącą metylowany DNA • Ściąga kompleksy białkowe indukujące zmiany w lokalnej strukturze chromosomów • Wyłącza ekspresję genów • Zakłócenia w normalnym wzorze metylacji DNA są niemal powszechnie wykrywane w nowotworach U bliźniąt monozygotycfznych różnice epigenetyczne (metylacja DNA) nagromadzają się w życiu osobniczym • Significant DNA methylation changes are indicated as thick red and green blocks in the ideograms. The 50-year-old twin pair shows abundant changes in the pattern of DNA methylation (green=hypermethylation and red=hypomethylation), 3-year-old twins have a very similar DNA methylation (yellow). • "...We found that, although twins are epigenetically indistinguishable during the early years of life, older monozygous twins exhibited remarkable differences in their overall content and genomic distribution of 5-methylcytosine DNA and histone acetylation, affecting their gene-expression portrait. These findings indicate how an appreciation of epigenetics is missing from our understanding of how different phenotypes can be originated from the same genotype." • Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jul Przykład ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metylacji DNA) Lcyc kontroluje symetrię grzbietowobrzuszną kwiatu; u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji From Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161 Epigenetyczna kontrola czasu kwitnienia Przedłuzony okrers chłodu Rozwój generatywny Rozwój wegetatywny Jesień Zima Wiosna Niektóre rośliny wymagają przedłużonego okresu chłodu (wernalizacji) – w trakcie zimy, zanim będą mogły zakwitnąć. Transpozony • Fragments of DNA that can insert into new chromosomal locations • Some copy themselves and increase in number within the genome • Responsible for large scale chromosomal rearrangements as well as single-gene mutagenic events U roślin program epigenetyczny wycisza transpozony i chroni integralość centromerów Transpozony mogą powodować wyłączenie lub niestabilność alleli Gen biosyntezy barwnika Allel dziki Ziarniak barwny Gen rozbity przez transpozon Allel zmutowany Ziarniak bezbarwny Wycięcie transpozonu powoduje niestabilność allelu Allel niestabilny Ziarniak częściowo zabarwiony Metylacja DNA jest niezbędna do wyciszania transpozonów BLUE = Gene density RED = Repetitive element density Utrata funkcji met1 lub ddm1 (decrease in DNA methylation1) mutanty maja niedometylowany DNA GREEN = Methylated DNA BROWN = Methylated DNA in a met1 mutant Zhang, et al. (2006). Cell 126: 1189-1201 Aktywacja transpozonów w mutancie ddm1 indukuje mutacje Dziki Po 1 pokoleniu Po 3 pokoleniach Po 5 pokoleniach Po wyłączeniu DDM1, fenotyp rośliny staje się coraz bardziej nienormalny, w miarę akumulowania indukowanych przez transpozony. Kakutani, et al. (1996). PNAS. 93: 12406-12411 Lokalizacja ogonów histonowych w nukleosomie H4 H4 H3 H3 H2A H2A H2B H2B Enzymy modyfikujące histony i DNA • HAT – acetylotransferazy histonów (bromodomena) • HDAC – deacteylazy histonów • HMT – metylotransferazy histonów (chromodomena). CMT3 – DNA metylotransferaza (chromodomena) Przykład kowalencyjnej modyfikacji aminokwasów acetylacja lizyny Modyfikacje potranslacyjne białek histonowych Kozaurides 2007 Elektroforetyczny dowód acetylacji histonów Efekt acetylacji ogonów histonowych Mechanizm działania modyfikacji potranslacyjnych białek histonowych Działanie bezpośrednie: zmiany w oddziaływaniach histon-DNA i histon-histon Działanie pośrednie: rekrutacja białek rozpoznających określone modyfikacje Kozaurides 2007 Fenotyp mutantów w metylotransferazie histonów Mutanty są pozbawione metylacji w H3K36. Dong, et al. (2008). Biochemical and Biophysical Research Communications. 373: 659-664 Modyfikacje a struktura chromatyny H3 K9 diME H3 K9 diME euchromatyna heterochromatyna Warianty histonów – H2A Warianty histonów - rozmieszczenie w chromosomach ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny Główne typy kompleksów remodelujących chromatynę SWI/SNF Snf2 Swp 73 Snf5 Swi3Swi3 ISWI ISWI ISWI Mi2 Mi2 Działanie kompleksów remodelujących chromatynę ATP DDM1 Kingston & Narlikar, 1999 Brzeski & Jerzmanowski, 2003 ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny Jeden z mechanizmów remodelingu: przesunięcie oktameru histonów wzdłuż nici DNA Przykład „przebudowy” (remodelingu) chromatyny Pozycja skrajna Pozycja centralna Pozycjonowanie nukleosomów Nukleosomy zajmują określone miejsca w chromatynie • • • A. Schemat ułożenia nukleosomów w chromatynie, pojęcie długości powtórzeń nuklesomowych. B. Silnie zlokalizowane i rozmyte nukleosomy. • C. Nukleosomy a miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych. • G. Arya et al. jbsd 2010 • Nukleosomy a transkrypcja • Schemat otwartych (A) i zamkniętych (B) promotorów. • Typowa mapa pozycyjna nukleosomów na otwartym promotorze pokazuje wyraźne wyróżnienie locus genowego przez obecność rejonów 5’ i 3’ wolnych od nukleosomów (NDR). • (TSS) - miejsce startu transkrypcji. • 5’ NDR sąsiaduje z silnie związanymi nukleosomami. • G. Arya et al. jbsd 2010 Dziedziczenie epigenetyczne • Dziedziczne modyfikacje funkcji genów nie związane ze zmianami w sekwencji DNA • Mechanizmy epigenetyczne są związane z modulacją chromatyny i obejmują: modyfikacje histonów, metylację DNA, przebudowę nukleosomów (remodeling), system RNAi. Epigenetyka Dziedziczenie właściwości (np. wzoru ekspresji genów) poprzez mitozę, nie wymagające zmian w sekwencji DNA. Genetyka Epigenetyka Allis, et al.(2007).Epigenetics, overview and concepts. CSHL. Dlaczego sklonowany kopt nie jest dokładnie taki, jak oryginał? Rainbow Klon Rainbow Modyfikacje histonów Biotinylation ADP-ribosylation k6 k11 * * * Gräff and Mansuy (2008). Behav Brain Res. Po-translacyjne modyfikacje histonów w nukleosomie wg. B.Turner, Cell 2002 Przykład przeciwstawnych funkcji modyfikacji histonów • H3/H4 AcLys/H3metLys4(H3K4) związane z rejonami aktywnej transkrypcji H3/H4 Lys+/H3metLys9 (H3K9) związane z rejonami wygaszonej transkrypcji. Euchromatyna i heterochromatyna Euchromatyna Heterochromatyna • Mniej skondensowana • Silnie skondensowana • Głównie w ramionach chromosomów • Głównie w centromerach i telomerach • Zawiera unikatowe sekwencje • Zawiera powtórzone sekwencje • Bogata w geny • Uboga w geny http://www.nyas.org/ Determinanty aktywnej i wyciszonej chromatyny Znaczniki epigenetyczne związane ze stanami chromatyny ATP-zależna przebudowa chromatyny ATP-zależna przebudowa chromatyny ATP-dependent chromatin remodeling X chromosome inactivation involves epigenetic silencing In female mammals, one copy of the X chromosome in each cell is epigenetically inactivated. Fur color in cats is determined in part by orange, an X-linked gene. A female cat that is heterozygous for the orange gene shows black and orange patches, corresponding to which X chromosome is active. Program epigenetyczny wspomaga przejścia rozwojowe u roślin Przejście z fazy embrionalnej do wegetatywnej Rozwój embrionalny Przejście z fazy wegetatywnej w generatywną Rozwój wegetatywny Rozwój generatywny Mutanty w genie FLOWERING LOCUS C (FLC) kwitna wcześnie Jesień Zima Wiosna FLC jest inhibitorem kwitnienia; brak FLC znosi konieczność wernalizacji. FLC hamuje FT, aktywator kwitnienia Roślina dzika FL C Gen FT Związanie FLC hamuje transkrypcję FT Roślina z mutacją flc Gen FT F T FLC jest wyciszany w trakcie wernalizacji Po 40 dniach w 4°C , FLC nie jest wyrażany. 10 dni po powrocie do 22°C ekspresja FLC jest wciąż wyłączona. Jesień FLC transkrybowany Zima Wiosna FLC wyciszony Sung, et al. (2004). Nature. 427: 159-164. FLC jest regulowany przez modyfikacje epigenegtyczne H3k4me H3K36me H3K9ac H314ac H3k9me2 H3k27me2 Zimno Jesień FLC transkrybowany Zima Wiosna FLC wyciszony Kompleksy VIN3 i PRC2 epigenetycznie wyłączają FLC PRC2= Polycomb Represive Complex 2) VIN3 PRC2 (łącznie z VIN3) Jesień FLC transkrybowany Zima Wiosna FLC wyciszony
