Wpływ zdeklastrowanego medium hodowlanego

Wpływ zdeklastrowanego medium hodowlanego RPMI na
żywotność i zdolność proliferacji komórek nowotworowych układu
hematopoetycznego człowieka.
Anna Och1,2, Marek Och1,2, Igor Elkin3 , Zdzisław Oszczęda3, Janusz Kocki2,
Anna Bogucka-Kocka1
1. Katedra i Zakład Botaniki Farmaceutycznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, ul.
Chodźki 1 20-093 Lublin
2. Zakład Genetyki Klinicznej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie, ul. Radziwiłłowska 11,
20-080 Lublin
3. Nantes- Systemy Nanotechnologii Sp. z o.o., ul. Dolne Młyny 21, 59-700 Bolesławiec
Streszczenie
Celem pracy była ocena wpływu zdeklastrowanego medium hodowlanego RPMI, na
żywotność i potencjał proliferacyjny komórek nowotworowych ludzkiej ostrej białaczki T
limfocytowej oraz szpiczaka. Analizę procesu apoptozy przeprowadzono z użyciem
cytometru przepływowego Navios firmy Beckman Coulter. Dla siedmiu badanych
białaczkowych linii komórkowych: HL-60, HL-60/MX1, HL-60/MX2, CCRF/CEM,
CEM/C1, J45 oraz U266 zaobserwowano wzrost komórek w fazie apoptozy w wyniku
prowadzenia hodowli w RPMI poddanemu wpływowi niskotemperaturowej plazmy, tzw.
zdeklastrowane medium hodowlane RPMI.
Wstęp
Choroby nowotworowe stanowią obecnie jeden z największych problem współczesnej
medycyny. Terapia chorób nowotworowych opiera się głównie na radio- oraz chemioterapii.
Skuteczność takiego postępowania jest wciąż mocno ograniczona i uzależniona od stopnia
zaawansowania choroby. Bez względu na etap rozwoju nowotworu, chemioterapia jest
zawsze bardzo toksyczna i wywołuje wiele ciężkich skutków ubocznych. Wśród głównych
wymienić możemy - zmiany obrazu krwi, upośledzenie funkcji szpiku, wątroby czy całego
układu moczowo-płciowego i inne. Ograniczona skuteczność i wysoka toksyczność leczenia
chemicznego skłaniają do poszukiwania alternatywnego rozwiązania. Stąd nowym
kierunkiem jest poszukiwanie terapii wykorzystującej zjawiska fizyczne zachodzące w
organizmie.
Jednym z rozwiązań branych pod uwagę jest zastosowanie nanotechnologii.
Nanotechnologia
dotyczy
sposobów
otrzymywania
zróżnicowanych
struktur
charakteryzujących się rozmiarami od 0,1 do 100 nanometrów. Oznacza to, że wielkość tych
struktur jest na poziomie pojedynczych atomów i cząstek. Początek rozwoju nanotechnologii
sięga lat 50-tych dwudziestego wieku. W naturze natomiast organizmy żywe od zawsze
posiadały struktury kontrolowane na poziomie pojedynczych cząstek. Do takich struktur
zaliczyć można przede wszystkim błony biologiczne, jak również strukturę kości, skóry oraz
drewna. Światowy rozwój nanotechnologii doprowadził do łączenia tej technologii z
medycyną.
Jedną z możliwości wprowadzenia nanotechnologii do leczenia jest wykorzystanie
biologicznego wpływu wody na komórki żywego organizmu. Woda jest substancją
wyjątkową pod względem fizyko-chemicznym – posiada właściwości odbiegające od
przewidywanych dla związków o zbliżonej budowie. Jest jedyną substancją naturalnie
występującą w trzech stanach skupienia na Ziemi. Przechodząc w stan stały rozszerza się przeciwnie do innych cieczy. Jako jedyna znana substancja wykazuje maksimum gęstości w
stanie ciekłym, a jej ciepło właściwe ma wartość minimalną w temperaturze ok. 37 °C. Co
jednak najistotniejsze, ciekła woda absorbuje promieniowanie elektromagnetyczne, poza
wąskim zakresem w obszarze światła widzialnego. Właściwości te są o tyle ważne, że woda
stanowi ok 70% masy ludzkiego organizmu. Zatem jej „jakość” decyduje o funkcjonowaniu
całego ustroju na wszystkich poziomach jego działania.
W stworzeniu produktu o nazwie NANO-woda, firma NANTES wykorzystała zdolność wody
do
absorpcji
promieniowania
elektromagnetycznego,
emitowanego
strumieniem
niskotemperaturowej plazmy. Woda poddana działaniu niskotemperaturowej plazmy posiada
szereg właściwości odbiegających od właściwości standardowo występujących dla wody.
Przyczyną tego zjawiska jest wielkość klastrów wody powstających w procesie wytwarzania
NANO-wody, które są energetycznie stabilne i tracą zdolność tworzenia gigaklastrów. Pod
wpływem niskiej energii oddziaływania jonów, atomy z nieliniowych oscylacji formują się w
łańcuchy i wskutek tego cząsteczki stabilizują się w nowych miejscach. Prowadzi to do
powstawania i rozwoju nowych metastabilnych grup molekularnych (nanoklastrów). W
jednorodnych łańcuchach utworzone nanoklastry odpowiadają elementom "pamięci
molekularnej". Krytyczna energia potrzebna do rozwoju samoorganizacji procesów jest
mniejsza niż w przypadku nieliniowych łańcuchów molekularnych z już nabudowanymi
klastrami. W przypadku nanoklastrów aktywna staje się strefa która określa dalsze procesy
samoorganizacji. Powstają skupiska, które zapewniają nowe właściwości fizyczne i
chemiczne kompleksów. Zmianie prawdopodobnie ulegają też wiązania wodorowe. W
przypadku, gdy woda o zmienionych wiązaniach wodorowych wchodzi w struktury oparte na
tych wiązaniach, jak np. DNA i inne kwasy nukleinowe czy białka, może ona wpływać na ich
funkcje. Autorzy podjęli się próby oceny wpływu zdeklastrowanego medium hodowlanego
RPMI na komórki nowotworowe wywodzące się z układu hematopoetycznego człowieka.
Cel pracy
Celem pracy była ocena wpływu zdeklastrowanego medium hodowlanego RPMI na
żywotność i potencjał proliferacyjny komórek nowotworowych ludzkiej ostrej białaczki T
limfocytowej oraz szpiczaka.
Materiały i metody
Eksperyment przeprowadzono dla siedmiu różnych białaczkowych linii komórkowych
wywodzących się z ludzkiego układu krwiotwórczego - HL-60, HL-60/MX1, HL-60/MX2,
CCRF/CEM, CEM/C1, J45 oraz U266. Linie komórkowe zakupiono w firmie American Type
Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 USA.
Hodowle utrzymywano w medium hodowlanym RPMI 1640 z L-Glutaminą i NaHCO3
(Biomed Lublin) oraz w tym samym medium poddanym działaniu niskotemperaturowej
plazmy. Medium hodowlane uzupełniano surowicą bydlęcą Fetal Bovine Serum (ATCC 302020) do stężenia 10%, dla linii: HL-60/MX1, HL-60/MX2, CCRF/CEM, CEM/C1, J45,
U266 oraz do stężenia 20% w przypadku linii HL-60. Stosowano dodatek amfoterycyny B,
penicyliny i streptomycyny (ATCC) w ilości 500 mikrolitrów na każde 50 mililitrów pełnej
pożywki. Linie zawieszone w medium hodowlanym inkubowano w atmosferze powietrza o
stężeniu dwutlenku węgla 5% oraz temperaturze 37st.C.
Żywotność hodowli oraz występowanie apoptozy oceniano metodą cytometrii
przepływowej z użyciem cytometru przepływowego Navios firmy Beckman Coulter.
Zastosowano test z aneksyną V znakowaną FITC oraz jodkiem propidyny (Roche,
Switzerland). Liczebność hodowli oceniano za pomocą automatycznego licznika komórek
Automatic Cell Counter T10 (Bio-Rad) metodą barwienia błękitem trypanem.
Część eksperymentalna
Linie hodowano równolegle w pożywce standardowej i w pożywce poddanej działaniu
niskotemperaturowej plazmy. Gęstość hodowli utrzymywano pomiędzy 105 a 106 żywych
komórek na mililitr.
Celem przeprowadzenia pomiaru żywotności i oceny apoptozy pobierano jeden mililitr
zawiesiny hodowli z każdej butelki do polietylenowych, jednorazowych ependorfów i
wirowano 10 minut przy prędkości 800 obrotów na minutę. Następnie odciągano supernatant
znad osadu komórek. Komórki uzupełniano 1 ml PBS otrzymując zawiesinę komórek w PBS.
Z tak przemytej zawiesiny komórek, pobierano 100
l roztworu i przenoszono do
jednorazowych falkonów. Następnie dodawano uprzednio przygotowane r-ry aneksyny V (1
l) i jodku propidiowego (5 l). Mieszaninę reakcyjną inkubowano 15 minut w temperaturze
4°C, w ciemnym miejscu. Po upływie tego czasu dodawano 400 l buforu dostarczonego z
odczynnikiem i dokonywano pomiaru. Pomiary wykonano po 0, 3, 6, 24 i 48 godzinach.
W celu przeprowadzenia oceny proliferacji mierzono liczebność komórek w teście z
błękitem trypanu. Zawiesinę komórek (1ml) pobierano z falkonów hodowlanych do
polietylenowych, jednorazowych ependorfów i wirowywano przez 10 minut przy prędkości
800 obrotów na minutę. Następnie odciągano supernatant znad osadu komórek. Do
pozostałych komórek dodawano 1 ml PBS i przemywano zawiesinę. Po odwirowaniu
pobierano 10 l zawiesiny i dodawano 10 l roztworu błękitu trypanu. Całość inkubowano 2
minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dokonywano pomiaru przy użyciu licznika
Automated Cell Counter TC10 firmy Bio-Rad. Pomiary wykonywano po 0, 3, 6, 24 i 48
godzinach. Materiał pobierano równolegle.
Wyniki
Komórki wszystkich linii hodowane na podłożu standardowym nie wykazywały
spadku żywotności ani spadku potencjału proliferacji. Przez cały czas trwania eksperymentu
zachowały żywotność na poziomie 80-90%. Liczebność komórek na poziomie 105-106
żywych komórek na mililitr hodowli wskazuje na niezakłócony przebieg procesów życiowych
badanych komórek (Rys.1-11).
Komórki
wszystkich
linii
hodowanych
na
podłożu
poddanym
działaniu
niskotemperaturowej plazmy weszły na szlak apoptoz. Efekt był porównywalny dla
wszystkich linii białaczki ostrej – HL60, HL-60/MX1, HL-60/MX2, CCRF/CEM, CEM/C1,
J45 oraz szpiczakowej – U266. Pomiary z zastosowaniem cytometrii przepływowej wykazały
przechodzenie komórek do śmierci na drodze apoptozy, poprzez fazę wczesnej apoptozy, po
której następował etap późnej apoptozy. Po upływie 48 godzin żywotność każdej z linii
zbliżała się do zera.
Pomiar liczebności komórek hodowanych na podłożu poddanym działaniu
niskotemperaturowej plazmy potwierdził spadek żywotności komórek. Stwierdzono obniżenie
gęstości komórek hodowanych na podłożu poddanym działaniu niskotemperaturowej plazmy.
Po 24 godzinach liczność komórek wynosiła około 104 komórek na ml. Po 48 godzinach
zakres liczby komórek wynosił poniżej 104 komórek na ml hodowli i był poza zasięgiem
pomiarowym aparatu. Hodowla komórek w podłożu standardowym charakteryzowała się
niezmienną gęstością, możliwą do pomiaru automatycznym licznikiem komórek w zakresie
105-106 żywych komórek na mililitr hodowli.
Wnioski:
Linie komórkowe hodowane na standardowym podłożu wykazywały prawidłową
gęstość hodowli, co wskazuje na niezakłóconą proliferację komórek. Żywotność linii
utrzymała się w trakcie trwania eksperymentu na poziomie 80-90%.
W hodowli komórek na podłożu poddanym działaniu niskotemperaturowej plazmy
obserwowano spadek gęstości hodowli w miarę upływu czasu. Po 24 godzinach gęstość
hodowli wynosiła ponad 104 komórek na ml. Po 48 godzinach zakres liczby komórek na ml
hodowli wynosił poniżej 104 komórek na ml i był poza zasięgiem pomiarowym licznika.
Wskazuje to na zahamowanie proliferacji komórek. Największy spadek żywotności
zaobserwowano dla linii U266 i CCRF/CEM. Najwyższy procent przeżycia wykazały linie HL60 i HL60/MX2.
Faza wczesnej apoptozy pojawiła się w większości przypadków pomiędzy 6 a 24
godziną eksperymentu. Po upływie 24 godzin procent komórek znajdujących się we wczesnej
fazie apoptozy obniżył się, przy czym proporcjonalnie wzrastał procent komórek
znajdujących się w fazie późnej apoptozy. Istotnym jest fakt, że nie zaobserwowano masowej
nekrozy, a procent komórek martwych kształtował się na poziomie 20% dla linii: HL60, HL60/MX1, HL-60/MX2, , CEM/C1 oraz J45. Dla linii U266 i CCRF/CEM na poziomie 60%.
Poznanie i wyjaśnienie przyczyn oraz mechanizmów działania wody zdeklastrowanej na
komórki nowotworowe wymaga wiele czasu i pracy. Fakt wpływu proapoptotycznego
pożywki poddanej wpływowi plazmy stanowi przesłankę do dalszych badań. Wyniki
eksperymentu pozwalają przypuszczać, że produkt firmy NATES mógłby znaleźć potencjalne
zastosowanie w leczeniu białaczek oraz innych nowotworów.
Linia CCRF hodowla w pożywce standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
1,34%
1,14%
1,32%
2,07%
2,53%
Późno-apoptotyczne
1,42%
2,32%
2,35%
1,69%
3,24%
Żywe
95,90%
93,15%
93,71%
92,88%
91,23%
Wczesno-apoptotyczne
0,85%
3,93%
2,62%
1,91%
1,72%
Linia CCRF hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Tytuł osi
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
2,99%
2,03%
5,38%
44,09%
56,58%
Późno-apoptotyczne
2,67%
6,19%
17,39%
31,36%
38,16%
Żywe
90,19%
64,31%
56,60%
19,87%
3,82%
Wczesno-apoptotyczne
3,14%
27,36%
20,49%
3,75%
0,86%
Rysunek 1. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii CCRF poddanej wpływowi NANO-medium.
Linia U266 hodowana w pożywce standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
1,25%
0,94%
0,94%
1,65%
1,44%
Późno-apoptotyczne
1,07%
1,06%
1,28%
1,71%
1,40%
Żywe
97,46%
97,54%
97,19%
96,22%
96,96%
Wczesno-apoptotyczne
0,22%
0,46%
0,59%
0,42%
0,20%
Linia U266 hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
1,15%
1,89%
8,07%
47,26%
75,08%
Późno-apoptotyczne
0,95%
3,68%
13,77%
37,57%
17,01%
Żywe
97,69%
93,07%
70,31%
13,29%
7,46%
Wczesno-apoptotyczne
0,21%
1,36%
7,84%
1,88%
0,46%
Rysunek 2. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii U266 poddanej wpływowi NANO-medium.
Linia HL60/MX1 hodowana w pożywce
standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
Żywotność
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
18,26%
3,32%
1,37%
2,08%
7,16%
Późno-apoptotyczne
1,80%
2,22%
2,35%
7,35%
4,88%
Żywe
79,21%
89,94%
81,83%
82,51%
86,30%
Wczesno-apoptotyczne
0,73%
4,52%
14,45%
8,06%
1,66%
Linia HL60/MX1 hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
18,47%
4,16%
0,74%
6,33%
20,99%
Późno-apoptotyczne
3,19%
4,00%
3,26%
9,33%
29,28%
Żywe
77,87%
78,78%
76,70%
70,48%
43,46%
Wczesno-apoptotyczne
0,47%
13,05%
19,31%
13,86%
6,27%
Rysunek 3. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii HL60/MX1 poddanej wpływowi NANO-medium.
Linia HL60/MX2 hodowana w pożywce
standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
Żywotność
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
2,75%
1,97%
1,78%
3,41%
5,80%
Późno-apoptotyczne
5,40%
4,54%
4,02%
3,23%
3,93%
Żywe
91,27%
91,82%
87,35%
89,90%
89,32%
Wczesno-apoptotyczne
0,59%
1,67%
6,86%
3,46%
0,95%
Linia HL60/MX2 hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
2,19%
1,51%
1,65%
4,31%
15,72%
Późno-apoptotyczne
5,43%
5,60%
4,56%
5,87%
14,22%
Żywe
91,43%
89,41%
81,68%
82,03%
66,66%
Wczesno-apoptotyczne
0,95%
3,48%
12,11%
7,79%
3,40%
Rysunek 4. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii HL60/MX2 poddanej wpływowi NANO-medium.
Linia J45 hodowana w pożywce standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
4,13%
0,66%
0,96%
4,39%
11,28%
Późno-apoptotyczne
2,55%
2,22%
2,47%
6,77%
8,09%
Żywe
92,72%
83,22%
75,25%
80,59%
78,22%
Wczesno-apoptotyczne
0,61%
13,91%
21,32%
8,24%
2,41%
Linia J45 hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
4,67%
1,38%
0,82%
5,88%
20,80%
Późno-apoptotyczne
3,50%
5,80%
5,17%
18,19%
49,61%
Żywe
91,67%
88,27%
74,20%
63,71%
23,08%
Wczesno-apoptotyczne
0,16%
4,55%
19,81%
12,22%
6,50%
Rysunek 5. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii J45 poddanej wpływowi NANO-medium.
Linia HL60 hodowana w pożywce standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
14,74%
9,96%
5,54%
11,63%
11,16%
Późno-apoptotyczne
4,74%
8,13%
7,90%
9,19%
8,63%
Żywe
79,80%
79,78%
81,53%
73,54%
77,08%
Wczesno-apoptotyczne
0,73%
2,13%
5,03%
5,64%
3,13%
Linia HL60 hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
12,75%
9,60%
5,62%
9,71%
16,05%
Późno-apoptotyczne
9,17%
14,22%
12,31%
14,35%
18,28%
Żywe
77,91%
74,55%
75,04%
67,41%
63,23%
Wczesno-apoptotyczne
0,17%
1,63%
7,04%
8,52%
2,43%
Rysunek 6. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii HL60 poddanej wpływowi NANO-medium.
Linia CEM/C1 hodowana w pożywce
standardowej
100,00%
90,00%
80,00%
Żywotność
70,00%
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
8,59%
1,38%
1,27%
2,79%
11,59%
Późno-apoptotyczne
1,64%
2,20%
1,61%
4,92%
5,79%
Żywe
89,18%
87,78%
80,40%
84,94%
81,26%
Wczesno-apoptotyczne
0,58%
8,64%
16,72%
7,35%
1,36%
LiniaCEM/C1 hodowana w NANO-medium
100,00%
90,00%
80,00%
70,00%
Żywotność
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
0h
3h
6h
24h
48h
Martwe
7,83%
1,51%
1,12%
5,07%
15,65%
Późno-apoptotyczne
2,94%
3,90%
3,68%
11,98%
36,60%
Żywe
88,32%
82,94%
76,51%
60,88%
40,45%
Wczesno-apoptotyczne
0,91%
11,65%
18,69%
22,07%
7,30%
Rysunek 7. Porównanie przebiegu procesu apoptozy dla linii CEM/C1 poddanej wpływowi NANO-medium.
Rysunek 8. Zmiany żywotności linii CCRF hodowanej w kontrolnym medium hodowlanym RPMI, w odstępach czasowych:
0h, 24h oraz 48h.
Rysunek 9. Zmiany żywotności linii CCRF hodowanej w zdeklastrowanym medium hodowlanym RPMI, w odstępach
czasowych: 0h, 3h, 6h, 24h oraz 48h.
Rysunek 10. Sygnał od jodku propidiowego dla komórek martwych i późno apoptotycznych. Linia CCRF, zdeklastrowane
medium hodowlane RPMI, czas: 6h.
Rysunek 11. Sygnał od aneksyny V dla komórek wczesno i późno apoptotycznych. Linia CCRF, zdeklastrowane medium
hodowlane RPMI, czas: 3h.
Dokument ten został opracowany przy użyciu sprzętu zakupionego w ramach projektu "Wyposażenie innowacyjnych laboratoriów
prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych" w ramach Programu
Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej 2007-2013, Oś Priorytetowa i Nowoczesna Gospodarka, Działania I.3 Promocja innowacji.
Badania prowadzono w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki-8.2.2. Regionalne Strategie Innowacji, stypendia naukowe dla
doktorantów II Urzędu Marszałkowskiego w Lublinie.