druk 08 KORYCKA str. 669-680

Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str. 669–680
PRACA ORYGINALNA – Original Article
ANNA KORYCKA-WOŁOWIEC1,2, ALEKSANDRA KOTKOWSKA1, EWA WAWRZYNIAK1,2,
JERZY Z. BŁOŃSKI1,2, TADEUSZ ROBAK1,2
Czy aberracje chromosomowe wykryte metodą cytogenetyki klasycznej
z uŜyciem DSP30 u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową mają
znaczenie kliniczne? – wyniki wstępne
Do chromosomal aberrations detected in chronic lymphocytic leukemia patients
by conventional cytogenetics with DSP30 have the clinical significance? – preliminary results
1
Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. M. Kopernika w Łodzi
Klinika Hematologii UM w Łodzi
Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Tadeusz Robak
2
STRESZCZENIE
Do aberracji cytogenetycznych wykrywanych rutynowo metodą FISH i uznanych za korzystny czynnik rokowniczy
w PBL naleŜy del(13)(q14), podczas gdy del(11)(q22) i del(17)(p13) uznane są za czynniki złego rokowania co do
szybkiej progresji choroby i oporności na leczenie cytostatyczne. Celem badań była ocena parametrów klinicznych
i laboratoryjnych w grupach chorych wyodrębnionych na podstawie obecności korzystnych lub niekorzystnych czynników rokowniczych, stwierdzonych metodą FISH, z uwzględnieniem obecności dodatkowych aberracji ujawnionych
metodą cytogenetyki klasycznej z uŜyciem oligonukleotydu DSP30 jako pojedynczego stymulatora (CC-DSP30).
Analizę statystyczną wykonano u 49 chorych, podzielonych na 9 grup, u których uzyskano wynik zarówno metodą
FISH, jak i CC-DSP30. Nie wykazano istotnych róŜnic pomiędzy płcią i wiekiem chorych, liczbą leukocytów, stęŜeniem hemoglobiny oraz liczbą płytek krwi, a ujawnionymi zmianami cytogenetycznymi. Pomiędzy poszczególnymi
grupami chorych nie stwierdzono równieŜ statystycznie istotnych róŜnic odnośnie stadium zaawansowania klinicznego wg Rai. ZauwaŜono jednak tendencję do częstszego występowania niŜszego stadium zaawansowania choroby (Rai
0–2) w grupie chorych z prawidłowym wynikiem lub del(13)(q14) w badaniu FISH, w porównaniu z pacjentami wykazującymi del(11)(q22) i/lub del(17)(p13) w FISH i dodatkowe aberracje w badaniu CC-DSP30 (p=0,07). Wykazano istotny statystycznie związek pomiędzy podwojeniem się limfocytozy w ciągu sześciu miesięcy, podwyŜszonym
surowiczym stęŜeniem β2-mikroglobuliny oraz ekspresją antygenu CD38, a aberracjami cytogenetycznymi o niekorzystnym znaczeniu rokowniczym, stwierdzonymi w badaniu FISH i z dodatkowymi zaburzeniami wykrytymi metodą CC-DSP30. Krótki czas obserwacji chorych, mała liczebność grup cytogenetycznych oraz brak danych co do ekspresji ZAP-70 i stanu mutacyjnego genu IgVH uniemoŜliwiły szczegółową analizę ujawnionych zmian cytogenetycznych. Określenie, które z ujawnionych anomalii mają znaczenie prognostyczne i czy są ono niezaleŜne od dotychczas
poznanych czynników rokowniczych, wymaga więc badań przeprowadzonych na większej populacji chorych i
z dłuŜszym okresem obserwacji.
SŁOWA KLUCZOWE: Przewlekła białaczka limfocytowa – FISH – Cytogenetyka klasyczna z uŜyciem DSP30 – Aberracje cytogenetyczne
SUMMARY
Chromosomal aberrations routinely searched in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients with the FISH method
include del(13)(q14) connected with a good prognosis, as well as del(11)(q22) and del(17)(p13) which carry a poor
prognosis for rapid progression, short overall survival and resistance to treatment. The aim of the study was to analyze a relationship between clinical and laboratory parameters of the disease and cytogenetic aberration both detected
by FISH with routinely used probes and revealed by CC with oligonucleotide DSP30 (CC-DSP30) as a single mitogen. The statistical analysis was performed on a group of 49 patients divided into 9 cytogenetic groups, in whom
both FISH and CC-DSP30 analysis were successful. We did not show a correlation between age, sex, leukocyte
count, hemoglobin level or platelets count, and cytogenetic aberrations. Earlier clinical stages (Rai 0-2) were more
frequently (at the limit of statistical significance, p=0.07) observed in patients with FISH normal or showing
670
A. KORYCKA-WOŁOWIEC i wsp.
del(13)(q14), as compared to those with del(11)(q22) and/or del(17)(p13) in FISH and other aberrations in CC-DSP30. We also showed a correlation between CD38 expression, short lymphocyte doubling time or higher serum levels
of β2-microglobulin, and cytogenetic aberrations with unfavorable prognostic value detected by FISH with additional
aberrations detected by CC-DSP30. Longer follow-up period, a larger patients’ cohort and inclusion into the analysis
of other relevant prognostic factors (ZAP-70 expression and IgVH mutational status) are necessary to more accurately
assess the clinical value of additional aberrations undetectable by FISH performed with standard panel of probes but
visualized by CC-DSP30 method.
KEY WORDS: Chronic lymphocytic leukemia – FISH – Conventional cytogenetics with oligonucleotide DSP30 –
Chromosomal aberrations
WSTĘP
Podstawą rozpoznania przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL) i podziału chorych na grupy róŜniące się stopniem zawansowania klinicznego są nadal zaproponowane przed ponad 30 laty klasyfikacje
wg Rai [1] i Bineta [2], jak równieŜ schemat postępowania diagnostycznego i leczniczego zaproponowany przez National Cancer Institute-Sponsored Working Group (NCI-SWG) w 1996 r. [3] i uaktualniony w roku 2008 [4]. Wieloletnie obserwacje pozwoliły na zdefiniowanie niektórych parametrów
hematologicznych i biochemicznych jako czynników prognostycznych lub predykcyjnych w PBL. Do
grupy wysokiego ryzyka zalicza się m.in. chorych, których cechuje wysoka bezwzględna limfocytoza
w chwili rozpoznania i krótki okres jej podwojenia (poniŜej 12 miesięcy), wysoki odsetek prolimfocytów oraz rozlany typ nacieczenia szpiku [5–8]. Podkreśla się obecnie takŜe wartość prognostyczną markerów surowiczych takich jak aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH), stęŜenie β2-mikroglobuliny, aktywność kinazy tymidynowej (thymidine kinase; TK) oraz surowicze stęŜenie rozpuszczalnego antygenu CD23 (sCD23) [6, 7].
Rozwój biologii molekularnej w ostatnich latach przyczynił się istotnie do poznania roli, jaką
w biologii PBL odgrywa stan zmutowania genów łańcucha cięŜkiego immunoglobulin (IgVH), a rozwój
cytogenetyki spowodował, Ŝe znaczenie rokownicze przypisuje się obecnie takŜe niektórym aberracjom
chromosomowym [4, 6, 9, 10]. Delecja długiego ramienia chromosomu 13 [del(13)(q14)], wykrywana
u ponad połowy chorych na PBL jest związana z najkorzystniejszym rokowaniem co do czasu całkowitego przeŜycia, podczas gdy delecja krótkiego ramienia chromosomu 17 [del(17)(p13)] jest wykrywana
rzadko, ale z powodu utraty genu supresorowego TP53 obarczona jest najgorszym rokowaniem, co
pozwala na zakwalifikowanie chorych z tą aberracją do grupy wysokiego ryzyka [9, 11–13]. Podobnie,
do grupy wysokiego ryzyka zaliczani są chorzy z delecją długiego ramienia chromosomu 11
[del(11)(q22)], których cechuje szybka progresja choroby, krótki czas od rozpoznania do rozpoczęcia
leczenia oraz krótki całkowity czas przeŜycia [9, 11]. Rola trisomii 12 [+12], będącej najczęstszą anomalią liczbową chromosomów w PBL, w patogenezie choroby pozostaje nadal niejasna. JednakŜe,
zdaniem niektórych autorów aberracja ta wiąŜe się z bardziej zaawansowanym stanem klinicznym,
tendencją do bardziej agresywnego i szybszego przebiegu choroby, krótszego całkowitego czasu przeŜycia oraz koniecznością wcześniejszego wdroŜenia leczenia [11, 14, 15].
Obecnie, u chorych na PBL podstawowym badaniem cytogenetycznym jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (fluorescence in situ hybridization; FISH). Jest to metoda bardzo czuła, ale pozwala na
wykrycie jedynie aberracji w zakresie obszarów chromosomów odpowiadających specyficzności zastosowanych sond. Wynik badania wykonanego metodą klasycznej prąŜkowej analizy chromosomów jest
z kolei zaleŜny od jakości rozproszenia chromosomów w płytkach metafazalnych oraz liczby rozproszonych metafaz, a tylko niewielka liczba limfocytów białaczkowych ulega spontanicznym podziałom
[4, 16]. Dla uzyskania odpowiedniej liczby metafaz przydatnych do analizy konieczna jest więc ich
stymulacja do wejścia do cyklu mitotycznego, a limfocyty białaczkowe są w warunkach hodowli in
vitro oporne na stymulację większością znanych mitogenów. Zbyt mała czułość klasycznych metod
cytogenetycznych nie pozwala więc prawdopodobnie na ujawnienie wszystkich istniejących aberracji,
które mogą okazać się waŜne z punktu widzenia zarówno poznawczego, jak i klinicznego. Wynika stąd
konieczność poszukiwania nowych mitogenów specyficznych dla komórek białaczkowych, pozwalają-
Aberracje chromosomowe wykryte w PBL metodą FISH lub CC-DSP30
671
cych na uzyskanie uŜytecznej liczby metafaz u jak największej liczby chorych na PBL. Doświadczenia
ostatnich lat wskazują, Ŝe szansę taką stwarza wykorzystanie w cytogenetyce klasycznej oligonukleotydu CpG nazwanego DSP30 (CC-DSP30). W badaniach przeprowadzonych przez Mayr i wsp. [12]
i Dicker i wsp. [17] hodowle limfocytów PBL stymulowano za pomocą DSP30 i IL-2. Metafazy zdatne
do analizy uzyskano w 95% przypadków, wśród których aberracje wykryto u ponad 80% badanych
chorych, a więc w liczbie porównywalnej z wynikami uzyskiwanymi metodą FISH. W opublikowanych
przez nas wcześniej badaniach wykazaliśmy, Ŝe zastosowanie DSP30 jako pojedynczego stymulatora
pozwala na uzyskanie metafaz nadających się do analizy u 90% badanych chorych na PBL, spośród
których u 74% pacjentów wykryto aberracje chromosomowe. Metoda CC-DSP30 pozwoliła ponadto na
ujawnienie u części chorych aberracji nie wykrytych za pomocą standardowego panelu sond uŜywanych do analizy zaburzeń chromosomowych techniką FISH [18].
Celem przedstawionej pracy była ocena parametrów klinicznych i laboratoryjnych u chorych na
PBL i ustalenie ich ewentualnego związku z aberracjami chromosomowymi zarówno tymi, które są
wykrywane metodą FISH z uŜyciem standardowego panelu sond, jak i dodatkowymi zaburzeniami
ujawnionymi metodą CC-DSP30. W szczególności podjęliśmy próbę ustalenia, czy dodatkowe aberracje ujawnione metodą CC-DSP30 wpływają na zmianę korzystnego rokowania związanego z izolowaną del(13)(q14) wykrytą techniką FISH.
MATERIAŁ I METODY
Charakterystyka chorych
Badaniami objęto 61 chorych (17 kobiet i 44 męŜczyzn), w wieku 46-90 lat (średnia 66,8), którzy
w latach 2007–2009 znajdowali się pod opieką Kliniki Hematologii UM w Łodzi lub Poradni Hematologicznej Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. M. Kopernika w Łodzi. Rozpoznanie oparto
na aktualnie obowiązujących kryteriach klinicznych i hematologicznych [4]. Stopień zaawansowania
klinicznego choroby był ustalony wg klasyfikacji Rai. Ogólną charakterystykę chorych przedstawiono
w Tabeli 1.
Tabela 1. Ogólna charakterystyka chorych (dla cech ilościowych podano wartości średnie i zakres).
Table 1. Characteristics of patients (quantitative values are expressed as a mean, minimal and maximal value).
Liczba chorych (n)
Płeć
K (n)
M (n)
Wiek (lata)
0
I
Rai
II
III
IV
Liczba leukocytów (x109/l)
Liczba limfocytów (x109/l)
StęŜenie Hb (g/dl)
Liczba płytek krwi (x109/l)
61
17
44
66,8 (46,0-90,0)
8
18
12
6
17
115,2 (24,1-307,2)
101,1 (18,3-293,3)
12,0 (4,3-15,7)
155,9 (26,0-294,0)
Zarówno w przypadku badań wykonywanych metodą CC-DSP30, jak i techniką FISH materiał
uzyskiwany był podczas rutynowych badań diagnostycznych i stanowiła go krew Ŝylna pobierana na
heparynę litową (Sarstedt, Niemcy).
Badanie uzyskało zgodę Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym w Łodzi (nr
RNN/109/07/KE z dnia 29.05.2007 r.), a wszyscy chorzy wyrazili pisemną zgodę na udział w badaniu.
672
A. KORYCKA-WOŁOWIEC i wsp.
Cytogenetyka klasyczna z uŜyciem oligonukleotydu DSP 30 (CC-DSP30)
Badania cytogenetyczne metodą CC wykonywano u wszystkich chorych z pełnej krwi obwodowej.
Komórki w stęŜeniu 107/ml hodowli zawieszano w podłoŜu X-VIVO 15 (Lonza, Belgia ) i dodawano
20% płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen, Szkocja). Limfocyty stymulowano oligonukleotydem
DSP30 (TIBMolBiol, Berlin, Niemcy) w stęŜeniu końcowym 2 µM/ml. Hodowle inkubowano przez 72
godziny w cieplarce biologicznej, zapewniającej 5% CO2, temperaturę 37°C oraz warunki pełnej wilgotności, a na 24 godziny przed zakończeniem hodowli dodawano kolcemid (Invitrogen, Szkocja)
w stęŜeniu końcowym 0,15 µg/ml. Materiał komórkowy uzyskiwany z hodowli poddawano szokowi
hipotonicznemu 0,075 M roztworem KCl i trzykrotnie wirowano. Komórki zawieszano następnie
w roztworze Carnoya i nakrapiano na szkiełko podstawowe w celu wykonania preparatów cytogenetycznych. Pozostałą część zawiesiny zabezpieczano w temperaturze –20°C do dalszych badań metodami CC lub FISH metafazowego. Preparaty barwiono techniką prąŜków G (GTG). Uzyskane metafazy
oceniano pod mikroskopem firmy Olympus BX-40 z uŜyciem programu do analizy kariotypów Spectral Imaging (Izrael).
Kariotyp opracowywano zgodnie z zasadami International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 2009 [19]. W przypadku prawidłowego kariotypu kaŜdorazowo analizowano minimum 15 metafaz. Obecność aberracji klonalnych stwierdzano, gdy w 2 lub więcej metafazach występowały aberracje strukturalne lub dodatkowy chromosom (trisomia), lub jeśli w 3 lub więcej metafazach stwierdzono utratę chromosomu (monosomia). Kariotyp uwaŜano za złoŜony, gdy w metafazach
stwierdzano 3 lub więcej aberracji.
FISH interfazowy do wykrywania del(13)(q14.3), del(11)(q22.3), trisomii 12 i del(17)(p13.1)
Krew obwodową rozcieńczano płynem Hanksa w stosunku 1:1, nawarstwiano na Histopaque-1077
(Sigma Aldrich, Niemcy) i wirowano w gradiencie gęstości przez 20 minut przy prędkości 3600 rpm.
Uzyskany na granicy faz pierścień komórek jednojądrowych (mononuclear cells; MNCs) izolowano,
poddawano szokowi hipotonicznemu z uŜyciem roztworu KCl, trzykrotnie utrwalano z uŜyciem roztworu Carnoya, a następnie wykonywano preparaty cytogenetyczne.
W celu wykrycia aberracji chromosomowych najczęściej występujących u chorych na PBL, u
wszystkich pacjentów wykonano badanie metodą FISH w jądrach interfazowych przy uŜyciu następujących sond molekularnych:
• LSI D13S319 (13q14.3)/LSI 13q34/CEP 12 Probe (Abbot Molecular, USA),
• LSI p53 (17p13.1)/LSI ATM (11q22.3) Probe (Abbot Molecular, USA).
Preparaty z izolowanych MNCs poddawano procedurze, zgodnie z protokołem zalecanym przez
producenta sond. Ilość sygnałów hybrydyzacyjnych oceniano przy uŜyciu mikroskopu świetlnego
Olympus BX-40 z przystawką fluorescencyjną.
W celu wyznaczenia zakresu wartości prawidłowych dla sygnałów hybrydyzacyjnych przy uŜyciu
poszczególnych sond badaniami objęto grupę 10 zdrowych osób stanowiących grupę kontrolną. Za
punkt odcięcia przyjęto taki odsetek jąder z nieprawidłowym wzorem hybrydyzacyjnym, który odpowiadał
X + 3SD. Wynosił on odpowiednio 8,4% dla del(13)(q14.3), 8,8% dla del(11)(q22.3), 9,6% dla
del(17)(p13.1) i 5% dla trisomii 12.
W celu potwierdzenia dodatkowych aberracji chromosomowych ujawnionych metodą CC-DSP30
wykonywano badania techniką FISH na płytkach metafazowych, z zastosowaniem sond molekularnych:
specyficznych, centromerowych i malujących (Abbot Molecular, USA; Cytocell, Wielka Brytania; Kreatech, Holandia; Metasystem, Niemcy).
Aberracje chromosomowe wykryte w PBL metodą FISH lub CC-DSP30
673
Ocena parametrów klinicznych i laboratoryjnych w wyodrębnionych grupach chorych
Wśród chorych, u których na podstawie badania metodą FISH stwierdzono występowanie korzystnych cytogenetycznych czynników rokowniczych [prawidłowy FISH lub del(13)(q14.3)] (grupa 1)
wyodrębniono pacjentów, u których metodą CC-DSP30 nie stwierdzono obecności dodatkowych aberracji (grupa 1A) oraz grupę, u której metodą CC-DSP30 ujawniono obecność dodatkowych aberracji
o charakterze klonalnym (grupa 1B).
Spośród chorych, u których metodą FISH ujawniono izolowaną del(13)(q14.3) (grupa 2) wyodrębniono pacjentów, u których metoda CC-DSP30 nie ujawniła dodatkowych aberracji (grupa 2A) oraz
grupę pacjentów, u których CC-DSP30 wykazała obecność dodatkowych anomalii (grupa 2B).
Ponadto, spośród chorych, u których metodą FISH stwierdzono obecność czynników cytogenetycznych o niekorzystnym rokowaniu [(del(11)(q22.3) lub del(17)(p13.1)] (grupa 3) wyodrębniono pacjentów, u których metodą CC-DSP30 nie stwierdzono obecności dodatkowych aberracji (grupa 3A) oraz
grupę, u której metodą CC-DSP30 ujawniono obecność dodatkowych aberracji (grupa 3B).
We wszystkich analizowanych grupach oceniano średni wiek chorych, płeć, stadium zaawansowania klinicznego wg Rai, liczbę leukocytów, stęŜenie hemoglobiny, liczbę płytek krwi, wystąpienie podwojenia limfocytozy w czasie nie dłuŜszym niŜ 6 miesięcy, aktywność LDH, stęŜenie β2mikroglobuliny oraz ekspresję antygenu CD38, uznając obecność tego antygenu na co najmniej 30%
komórek badanej populacji limfocytów jako ekspresję dodatnią.
Analiza statystyczna
Analizę statystyczną parametrów laboratoryjnych wykonano z uŜyciem nieparametrycznego testu
Manna-Whitneya, a w celu analizy parametrów jakościowych zastosowano jednostronny dokładny test
Fishera, przyjmując za statystycznie istotne p<0,05.
WYNIKI
Metoda CC-DSP30 pozwoliła na uzyskanie metafaz nadających się do analizy u 55 spośród 61 chorych (90%) i ujawniła anomalie cytogenetyczne, nie wykrywane techniką FISH z uŜyciem sond standardowych dla PBL u 41 spośród 55 chorych (74,5%). Aberracje strukturalne (addycje i translokacje)
najczęściej dotyczyły złamań w regionie: 8q24, 18p11, 17q21 i 14q32. U 16 spośród 41 chorych (39%)
wykryto złoŜony kariotyp. W 22 spośród 55 przypadków (40%) zaobserwowano translokacje zrównowaŜone i/lub niezrównowaŜone. U 5 spośród 55 chorych (9%), jako wynik translokacji niezrównowaŜonych, obserwowano częściową trisomię chromosomu 2p. Przykładowy wynik analizy cytogenetycznej przedstawiono na Rycinie 1.
Badania kliniczne i laboratoryjne wykonano w grupie 55 chorych, u których uzyskano wynik zarówno metodą FISH, jak i CC-DSP30. Ze względu na brak jednoznacznych doniesień dotyczących
znaczenia rokowniczego trisomii 12, badania kliniczne i laboratoryjne uzyskane u 6 chorych z tą aberracją nie zostały uwzględnione w dalszej analizie, którą przeprowadzono w grupie 49 chorych.
Do grupy z korzystnymi cytogenetycznymi czynnikami rokowniczymi (grupa 1) zaliczono 32 pacjentów, wśród których metodą CC-DSP30 stwierdzono nieobecność lub obecność dodatkowych aberracji u odpowiednio 17 i 15 chorych (grupa 1A i grupa 1B). Dodatkowo, z grupy 1 wydzielono 24 chorych (grupa 2), u których metodą FISH wykryto izolowaną del(13)(q14.3). Spośród tych chorych wyodrębniono grupy liczące 11 i 13 pacjentów (grupa 2A i grupa 2B), u których metoda CC-DSP30 odpowiednio nie ujawniła lub ujawniła obecności dodatkowych aberracji (Tabela 2–5).
Do grupy o niekorzystnym rokowaniu (grupa 3) zaliczono 17 chorych, wśród których metodą CCDSP30 stwierdzono nieobecność lub obecność dodatkowych aberracji u odpowiednio u 4 i 13 chorych
(grupa 3A i grupa 3B) (Tabela 2–5).
674
A. KORYCKA-WOŁOWIEC i wsp.
Nie stwierdzono związku pomiędzy wynikiem badań cytogenetycznych, a płcią, wiekiem, liczbą
leukocytów, stęŜeniem hemoglobiny ani liczbą płytek krwi.
Ryc. 1. Wynik analizy cytogenetycznej chorego z del(13(q14) ujawnioną tylko w metodzie FISH z dodatkową translokacją
wykrytą metodą CC-DSP30
Analiza metodą GTG (A), FISH metafazowy (B), FISH interfazowy (C).
Fig. 1. Result of the cytogenetic analysis of one patient, who had a deletion 13q14 detected only by FISH and an additional
translocation detected by CC-DSP30.
GTG analysis (A), metaphase FISH (B) and interphase FISH (C)
Stwierdzono tendencję na granicy istotności statystycznej (p=0,07) do częstszego występowania
niŜszego stadium zaawansowania choroby (Rai 0–2) w grupie chorych z prawidłowym wynikiem FISH
lub del(13)(q14) w badaniu FISH, w porównaniu z grupą chorych z delecją (11)(q22) i/lub (17)(p13)
w FISH i dodatkowymi aberracjami w badaniu CC-DSP30 (Tabela 2). Biorąc pod uwagę grupę chorych
z wynikiem FISH prawidłowym lub wykazującym del(13)(q14) zaawansowane stadia wg Rai stwierdzano częściej u pacjentów z dodatkowymi aberracjami wykrytymi metoda CC-DSP30, w porównaniu
z podgrupą bez tych aberracji. Związek ten nie był jednak równieŜ statystycznie istotny (Tabela 2).
Analizując wystąpienie podwojenia limfocytozy w czasie nie dłuŜszym niŜ 6 miesięcy, stwierdzono
istotnie większą częstość tego zjawiska w grupie chorych z wynikiem FISH prawidłowym lub
del(13)(q14) i z dodatkowymi aberracjami ujawnionymi w badaniu CC-DSP30, w porównaniu z pacjentami z takim samym wynikiem FISH i nieobecnością dodatkowych aberracji w badaniu CC-DSP30;
Aberracje chromosomowe wykryte w PBL metodą FISH lub CC-DSP30
675
odpowiednio 10/15 (67%) i 4/16 (25%) chorych (p=0,02) (Tabela 3). Podobne róŜnice zaobserwowano
w grupie chorych z izolowaną del(13)(q14) w badaniu FISH, nie osiągnęły one jednak progu istotności
statystycznej.
676
A. KORYCKA-WOŁOWIEC i wsp.
Nie stwierdzono istotnych statystycznie róŜnic w surowiczej aktywności LDH pomiędzy poszczególnymi grupami cytogenetycznymi. Wykazano natomiast znamienną statystycznie zaleŜność pomiędzy
surowiczym stęŜeniem β2-mikroglobuliny, a zaburzeniami cytogenetycznymi. Stwierdzono wyŜszą
wartość tego wskaźnika w grupie chorych, u których w badaniu FISH wykryto del(11)(q22) i/lub
del(17)(p13), a badanie CC-DSP30 ujawniło obecność dodatkowych aberracji (grupa 3B), w porówna-
Aberracje chromosomowe wykryte w PBL metodą FISH lub CC-DSP30
677
niu z pacjentami z prawidłowym wynikiem FISH lub z del(13)(q14) wykrytą w tym badaniu (grupa 1)
(p=0,04) (Tabela 4). Stwierdzono równieŜ, Ŝe stęŜenia β2-mikroglobuliny w grupie chorych z prawidłowym wynikiem lub del(13)(q14) w badaniu FISH i bez dodatkowych aberracji w badaniu CCDSP30 (grupa 1A) były statystycznie znamiennie niŜsze niŜ u chorych z del(11)(q22) i/lub del(17)(p13)
w badaniu FISH i z dodatkowymi aberracjami w badaniu CC-DSP30 (grupa 3B) (p=0,04) (Tabela 4).
Zaobserwowano takŜe występowanie niŜszych stęŜeń β2-mikroglobuliny w grupie chorych z prawidłowym wynikiem FISH lub del(13)(q14) w tym badaniu i bez dodatkowych aberracji w badaniu CCDSP30 (grupa 1A), w porównaniu z pacjentami z del(11)(q22) i/lub del(17)(p13) w badaniu FISH (grupa 3), chociaŜ róŜnice te nie osiągnęły progu statystycznej istotności (Tabela 4).
Ponadto pomiędzy badanymi grupami cytogenetycznymi wykazano znamienne statystycznie róŜnice w ekspresji CD38 ocenianej zarówno jako odsetek komórek wykazujących obecność tego antygenu,
jak i stosunek pomiędzy liczbą pacjentów uznanych za dodatnich lub ujemnych pod względem tej ekspresji. Zarówno odsetek komórek CD38+, jak i odsetek pacjentów uznanych za dodatnich pod względem jego ekspresji były istotnie niŜsze w grupie chorych z prawidłowym wynikiem FISH lub
del(13)(q14) w tym badaniu (grupa 1), jak i w grupie chorych z izolowaną del(13)(q14) w badaniu
FISH (grupa 2), niŜ u pacjentów z ujawnioną tą techniką del(11)(q22) i/lub del(17)(p13) (grupa 3) (p=
0,00006 i p=0,0002, odpowiednio dla odsetka komórek CD38+ oraz p= 0,0005 i p= 0,001, odpowiednio dla odsetka chorych uznanych za CD38+) (Tabela 5). NiŜszy odsetek komórek CD38+ , jak równieŜ
niŜszy odsetek chorych wykazujących dodatnią ekspresję tego antygenu obserwowano równieŜ w grupie pacjentów z prawidłowym wynikiem FISH lub del(13)(q14) w tym badaniu i bez dodatkowych
aberracji w badaniu CC-DSP30 (grupa 1A), w porównaniu zarówno ze wszystkimi chorymi z ujawnionymi badaniem FISH del(11)(q22) i/lub del(17)(p13) (grupa 3), jak i z pacjentami wykazującymi
współistnienie tych aberracji z dodatkowymi zaburzeniami w badaniu CC-DSP30 (grupa 3B) (Tabela
5).
DYSKUSJA
Wykrywanie aberracji chromosomowych u chorych na PBL nabiera w ostatnich latach coraz większego znaczenia ze względu na ich wartość prognostyczną. Zaproponowany przez Monserrata [20] podział chorych na PBL uwzględniający ryzyko progresji i oczekiwany całkowity czas przeŜycia jest
oparty na wynikach analizy cytogenetycznej. Wyodrębnia on grupę niskiego ryzyka, do której naleŜy
zaliczyć chorych z prawidłowym kariotypem lub izolowaną del(13)(q14) oraz grupę wysokiego ryzyka,
do której naleŜą pacjenci z del(17)(p13) lub del(11)(q22). Chorzy z +12 pomimo, Ŝe istnieje u nich
wysokie ryzyko szybkiej progresji choroby, w przeciwieństwie do pacjentów z del(17)(p13) lub
del(11)(q22) zwykle reagują na leczenie fludarabiną i mają dłuŜszy czas przeŜycia, a rola tej aberracji
w patogenezie PBL pozostaje nadal niejasna.
U chorych na PBL, ze względu na ograniczenia wynikające zarówno z zastosowania metody CC
z uŜyciem klasycznych stymulatorów, jak i techniki FISH, uzasadnione wydaje się poszukiwanie nowych metod umoŜliwiających wykrywanie aberracji cytogenetycznych zarówno tych o uznanym znaczeniu prognostycznym, jak i dotychczas nie opisanych. Szansę taką stwarza oligonukleotyd CpG
(DSP30) zastosowany jako stymulator zarówno prawidłowych, jak i białaczkowych limfocytów B. Badania opublikowane dotychczas przez innych autorów, wykonywane ex vivo na komórkach PBL, miały
na celu ocenę skuteczności mitogennej oligonukleotydu CpG zastosowanego w skojarzeniu z IL-2 [12,
17]. Pozwoliły one na uzyskanie metafaz nadających się do analizy aŜ u 95% chorych, a więc w znacznie większym odsetku niŜ klasyczne mitogeny zastosowane pojedynczo, których uŜycie pozwala na
uzyskanie metafaz jedynie u ok. 50% chorych [17, 21].
W opublikowanych przez nas wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, Ŝe w odniesieniu do
del(11)(q22) oraz trisomii 12 czułość metod CC-DSP30 i FISH jest porównywalna. W wykrywaniu
del(13)(q14), które niemal w 100% przypadków mają charakter interstycjalny i dotyczą zaledwie niewielkiego regionu ramienia q, metoda FISH jest techniką czulszą. Metoda CC-DSP30 pozwoliła jednak
678
A. KORYCKA-WOŁOWIEC i wsp.
na ujawnienie u części chorych aberracji nie wykrytych za pomocą standardowego panelu sond uŜywanych do analizy zaburzeń chromosomowych techniką FISH [18, 22]. Dlatego teŜ, kontynuując powyŜsze badania, podjęto próbę oceny związku pomiędzy aberracjami cytogenetycznymi wykrytymi metodą
FISH oraz techniką CC-DSP30, a obrazem kliniczno-hematologicznym choroby. Wartość kliniczna
takich badań wiąŜe się z moŜliwością istnienia związku pomiędzy niektórymi z tak ujawnionych aberracji cytogenetycznych, a przebiegiem choroby, co stwarza szansę wykorzystania ich jako czynników
predykcyjnych lub rokowniczych.
Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, Ŝe chorzy z prawidłowym kariotypem lub
del(13)(q14) ujawnioną w badaniu FISH wykazywali tendencję do niŜszego stadium zaawansowania
klinicznego niŜ pacjenci z del(11)(q22) i/lub del(17)(p13) wykrytą w FISH i z dodatkowymi aberracjami w badaniu CC-DSP30. RóŜnica ta nie osiągnęła jednak progu istotności statystycznej, być moŜe
z powodu zbyt małej liczebności badanych grup. Wystąpienie dodatkowych aberracji ujawnionych
techniką CC-DSP30 u pacjentów z wynikiem FISH prawidłowym bądź wykazującym del(13)(q14)
zwiększało ryzyko podwojenia się limfocytozy w ciągu 6-ciu miesięcy. Surowicze stęŜenie β2mikroglobuliny było ponadto wyŜsze u chorych z del(11)(q22) i/lub del(17)(p13) oraz dodatkowymi
aberracjami wykazanymi metodą CC-DSP30, w porównaniu z pacjentami u których badanie FISH było
prawidłowe lub wykazywało del(13)(q14).
PowyŜsze obserwacje są zgodne z doniesieniami piśmiennictwa, iŜ del(11)(q22) i/lub del(17)(p13)
wiąŜą się z wyŜszym stadium zaawansowania choroby i jej szybką progresją [11, 23, 24]. Chorzy
z del(11)(q22) charakteryzują się krótkim czasem od rozpoznania do rozpoczęcia leczenia oraz krótkim
całkowitym czasem przeŜycia. Döhner i wsp. [11] w wielowariantowej analizie wykazali, Ŝe
del(11)(q22-q23) jest niezaleŜnym czynnikiem prognostycznym wpływającym na czas przeŜycia chorych. Postacie PBL z del(11)(q22) opisywane są częściej u młodych pacjentów w wieku poniŜej 55
roku Ŝycia, u których występowała znamiennie krótsza mediana przeŜycia, w porównaniu z chorymi
w tym samym wieku, ale bez tej aberracji (64 vs 209 miesięcy). Natomiast wśród pacjentów powyŜej
55 roku Ŝycia nie stwierdzono istotnych róŜnic w czasie przeŜycia pomiędzy chorymi z del(11)(q22)
i pacjentami bez tej anomalii (94 vs 111 miesięcy).
Döhner i wsp. [11] zaobserwowali ponadto, Ŝe wystąpienie del(11)(q22-q23) łączy się z bardziej
zaawansowanym stadium klinicznym choroby, częstszym wystąpieniem splenomegalii i limfadenopatii
brzusznej lub w śródpiersiu, objawów ogólnych, niedokrwistości i małopłytkowości. Cuneo i wsp. [25]
wykazali natomiast, Ŝe aberracja ta moŜe posiadać charakter wtórnej anomalii, która ujawnia się w czasie progresji choroby, w której pierwotnie wykryto del(13)(q14). NaleŜy jednak równieŜ zauwaŜyć, Ŝe
nie wszyscy autorzy wykazali związek pomiędzy stadium zaawansowania klinicznego choroby, a anomaliami wykrytymi metodą FISH. Takiej zaleŜności nie stwierdzili np. Dewald i wsp. [26].
Jednym z najistotniejszych czynników niekorzystnego rokowania w PBL jest występowanie na powierzchni komórek białaczkowych antygenu powierzchniowego CD38. Ekspresja tego antygenu jest
związana z szybką progresją choroby i skróconym czasem całkowitego przeŜycia. Metoda oznaczania
ekspresji CD38 nie została jednak dotychczas wystarczająco wystandardyzowana. Istnieją rozbieŜności
co do wartości granicznej odsetka limfocytów z wykrywalnym CD38, powyŜej której naleŜy uznać
istnienie ekspresji tego antygenu w populacji limfocytów białaczkowych. Większość autorów przyjmuje 30%, ale niektórzy uznają ekspresję za dodatnią począwszy od 20% limfocytów CD38-pozytywnych,
a pojawiły się takŜe propozycje jej obniŜenia nawet do 7% [27-29]. NaleŜy równieŜ pamiętać, Ŝe ekspresja CD38 na limfocytach białaczkowych moŜe się zmieniać u pacjenta podczas trwania choroby.
W przedstawionych badaniach uwzględniono ekspresję CD38 zarówno w ujęciu ilościowym oznaczając odsetek limfocytów z wykrywalnym CD38 dla kaŜdego chorego, jak i jakościowym obliczając
odsetek pacjentów, u których antygen CD38 był wykrywalny na co najmniej 30% limfocytów białaczkowych. Stwierdzono, Ŝe zarówno średni odsetek limfocytów wykazujących obecność CD38, jak i odsetek pacjentów uznanych za dodatnich pod względem jego ekspresji, były istotnie niŜsze w grupie
chorych z prawidłowym wynikiem FISH lub del(13)(q14), w porównaniu z pacjentami z niekorzystnymi aberracjami cytogenetycznymi: del(11)(q22) i/lub del(17)(p13). Związek pomiędzy wykrywalnością
Aberracje chromosomowe wykryte w PBL metodą FISH lub CC-DSP30
679
na limfocytach białaczkowych antygenu CD38, a aberracjami cytogenetycznymi posiadającymi niekorzystne znaczenie rokownicze został juŜ wcześniej stwierdzony przez kilka zespołów badawczych, jednak opublikowane przez nich wyniki badań nie są w pełni ze sobą zgodne. Dewald i wsp. [26] opisali
współzaleŜność pomiędzy ekspresją CD38, a +12, del(11)(q22) oraz del(17)(p13), natomiast u 56%
chorych uznanych jako CD38-negatywni wykryto del(13)(q14). Związek pomiędzy ekspresją CD38,
a del(11)(q22), +12 i kariotypem złoŜonym, oraz nieobecnością omawianego antygenu, a del(13)(q14)
opisali teŜ Haferlach i wsp. [14]. Dicker i wsp. [17] zaobserwowali, Ŝe antygen CD38 wykrywany jest
częściej u nosicieli del(11)(q22) oraz izolowanej del(13)(q14). Jego ekspresja nie wykazywała natomiast związku z kariotypem prawidłowym, del(17)(p13) oraz +12 w badaniu FISH. Chevalier i wsp.
[23] ujawnili związek ekspresji CD38 jedynie z del(11)(q22), nie zaś z del(13)(q14), +12, del(17)(p13)
ani teŜ z kariotypem prawidłowym. Zagadnienie współzaleŜności pomiędzy aberracjami cytogenetycznymi, a obecnością antygenu CD38 wymaga więc dalszych badań zarówno w aspekcie ich związku
patogenetycznego, jak i w celu ustalenia ich niezaleŜności i siły jako czynników rokowniczych w omawianej chorobie.
Z uwagi na pojedyncze doniesienia, opisujące współistnienie del(13)(q14) i dodatkowych translokacji pogarszających korzystne rokowanie związane z izolowaną del(13)(q14) [17], podjęto próbę porównania podstawowych danych klinicznych i laboratoryjnych pomiędzy chorymi z izolowaną
del(13)(q14) w badaniu FISH oraz pacjentami z izolowaną del(13)(q14) i dodatkowymi aberracjami
wykrytymi metodą CC-DSP30. Nie stwierdzono jednak statystycznie istotnych róŜnic pomiędzy tymi
grupami chorych w zakresie ocenianych wskaźników (wiek, płeć, stadium zaawansowania klinicznego
wg Rai, stęŜenie hemoglobiny, liczba leukocytów i płytek krwi, aktywność LDH, stęŜenie β2mikroglobuliny, ekspresja CD38). Ocena, czy wykryte dodatkowe aberracje pogarszają rokowanie w
omawianej chorobie będzie przez nas kontynuowana na większej grupie chorych i z dłuŜszym okresem
ich obserwacji.
Krótki czas obserwacji badanych pacjentów, mała liczebność podgrup cytogenetycznych oraz brak
danych co do ekspresji ZAP-70 i stanu mutacyjnego genu IgVH uniemoŜliwiły szczegółową analizę
ujawnionych zmian cytogenetycznych jako moŜliwych niezaleŜnych czynników rokowniczych co do
dynamiki choroby. Opisane wyŜej obserwacje, zwłaszcza wykazanie związku pomiędzy niektórymi
anomaliami, a ekspresją CD38 i szybkim podwojeniem się limfocytozy, wskazują jednak, Ŝe wystąpienie dodatkowych aberracji chromosomowych moŜe istotnie zmodyfikować znaczenie prognostyczne
tych zmian, które są juŜ dobrze poznane pod tym względem. Nie moŜna teŜ wykluczyć moŜliwości, Ŝe
niektóre z powyŜszych aberracji posiadają niezaleŜną wartość rokowniczą.
Praca finansowana
2553/B/PO1/2008/34
z
Grantu
Ministerstwa
Nauki
i
Szkolnictwa
WyŜszego
Nr
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Rai K.R., Savitsky A, Cronkite E.P, Chanana A.D, Levy R.N, Pasternack B.S. Clinical staging of chronic lymphocytic
leukemia. Blood, 1975; 46: 219-234.
Binet J.L, Auquier A, Dighiero G. i wsp. A New Prognostic Classification of Chronic Lymphocytic Leukemia Derived
from a Multivariate Survival Analysis. Cancer, 1981; 48: 198-206.
Cheson BD, Bennett JM, Grever M i wsp. National Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood 1996; 87: 4990-4997.
Hallek M, Cheson BD, Catovsky D i wsp. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a
report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer InstituteWorking Group 1996 guidelines. Blood 2008; 111: 5446-5456.
Dighiero G., Hamblin T.J. Chronic lymphocytic leukemia. Lancet, 2008; 371: 1017-1029.
Van Bockstaele F, Verhasselt B, Philippe J. Prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia: A comprehensive review. Blood Rev. 2009; 23: 25-47.
Zenz T, Fröhling S, Mertens D, Döhner H, Stilgenbauer S. Moving from prognostic to predictive factors in chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Best Pract Res Clin Haematol 2010; 23: 71-84.
680
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
A. KORYCKA-WOŁOWIEC i wsp.
Seiler T, Dohner H, Stilgenbauer S. Risk stratification in chronic lymphocytic leukaemia. Semin Oncol 2006; 33: 186194.
Butler T, Gribben JG. Biologic and clinical significance of molecular profiling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood
Rev 2010; 24: 135-141.
Moreno C, Montserrat E. New prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia. Blood Rev. 2008; 22: 211-219.
Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A i wsp. Genomic aberration and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J
Med. 2000; 26: 1910-1916.
Mayr Ch, Speicher MR, Kofler DM, Buhmann R, Strehl J, Busch R. Chromosomal translocations are associated with poor
prognosis in chronic lymphocytic leukaemia. Blood 2006; 107: 742-751.
Mehes G. Chromosome abnormalities with prognostic impact in B-cell chronic lymphocytic leuekamia. Pathol Oncol Res
2005; 11: 206-210.
Haferlach C, Dicker F, Schnittger S, Kern W, Haferlach T. Comprehensive genetic characterization of CLL: a study on
506 cases analysed with chromosome banding analysis, interphase FISH, IgVH, status and immunophenotyping. Leukemia
2007; 21: 2442-2451.
Athanasiadou A, Stamatopoulos K, Tsompanakou A i wsp. Clinical, immunophenotypic, and molecular profiling of trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia and comparison with other karyotypic subgroups defined by cytogenetic analysis. Cancer Genet Cytogenet 2006; 168: 109-119
Wang N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am J Med Genet 2002; 115: 118-124.
Dicker F, Schnittger S, Haferlach T, Kern W, Schoch C. Immunostimulatory oligonucleotide-induced metaphase cytogenetics detect chromosomal aberrations in 80% of CLL patients: a study of 132 CLL cases with correlation to FISH, IgVH
status, and CD38 expression. Blood 2006; 108: 3152-3160.
Kotkowska A, Wawrzyniak E, Błoński JZ, Robak T, Korycka-Wołowiec A. Chromosomal aberrations in chronic lymphocytic leukemia detected by conventional cytogenetics with DSP30 as a single agent: Comparison with FISH. Leuk Res.
2011; 35: 1032-38.
An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG, Slovak ML, Campbell LJ; S Karger, Basel
2009.
Montserrat E. New prognostic markers in CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2006: 279-284.
Carlsson M, Totterman TH, Matsson P&Nilsson K. Cell cycle progression of B-chronic lymphocytic leukemia cells induced to differentiate by TPA. Blood 1988; 71: 415-421.
Kotkowska A, Wawrzyniak E, Błoński JZ , Robak T, Korycka-Wołowiec A. Porównanie przydatności cytogenetyki klasycznej z uŜyciem oligonukleotydu CpG (DSP30) do wykrywania aberracji chromosomowych o znaczeniu prognostycznym u chorych na przewlekłą białaczkę limfocytową- wyniki wstępne. Acta haematol. Pol. 2010; 41: 45-55.
Chevellier P, Penther D, Avet-Loiseau H, Robillard N, Ifrah N, Mahe B. CD38 expression and secendary 17p deletion are
important prognostic factors in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 2002; 116: 142-150.
Byrd JC, Gribben JG, Peterson BL i wsp. Select high-risk genetic features predict earlier progression following chemoimmunotherapy with fludarabine and rituximab in chronic lymphocytic leukemia: justification for risk-adapted therapy.
J Clin Oncol 2006; 24: 437443.
Cuneo A, Bigoni NR, Rigolin GM i wsp. Late appearance of the 11q22.3-23.1 deletion involving the ATM locus in B-cell
chronic lymphocytic leukemia and related disorders. Clinico-biological significance. Haematologica 2002; 87: 44-51.
Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF, Bone ND, O`Fallon JR, Allmer C. Chromosome anomalies detected by interphase fluorescence in situ hybridization: correlation with significant biological features of B-cell chronic lymphocytic
leukaemia. Br J Haematol 2003; 121: 287-295.
Domingo-Domenech E, Domingo-Claros A, Gonzales-Barca E i wsp. CD38 expression in B-chronic lymphocytic leukemia: association with clinical presentation and outcome in 155 patients. Haematologica 2002; 87: 1021-1027.
Del Poeta G, Maurillo L, Venditti A i wsp. Clinical significance of CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia.
Blood 2001; 98: 2633-2639.
Hsi ED, Kopecky KJ, Appelbaum FR i wsp. Prognostic significance of CD38 and CD20 expression as assessed by quantitative flow cytometry in chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 2003; 120: 1017-1025.
Praca wpłynęła do Redakcji 29.08.2011r. i została zakwalifikowana do druku 09.11.2011 r.
Adres Autora:
Klinka Hematologii UM w Łodzi
Ul. Ciołkowskiego 2
93-510 Łódź
mail: [email protected]