DRUK 19 - ANTOSZ str. 283-291

Acta Haematologica Polonica 2010, 41, Nr 2, str. 283–291
PRACA ORYGINALNA – Original Article
HALINA ANTOSZ1*, JOANNA SAJEWICZ1, BARBARA MARZEC-KOTARSKA1,
ANNA DMOSZYŃSKA2
Ekspresja IL-6 i IL-6Rα na poziomie mRNA w limfocytach PBL-B oraz
w prawidłowej subpopulacji B (CD19+)
IL-6 and IL-6Rα mRNA expression in B-cell chronic leukemia lymphocytes and
normal B lymphocytes subpopulation (CD19+)
1
Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Kierownik: Dr hab. Janusz Kocki
2
Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Kierownik: Prof. dr hab. Anna Dmoszyńska
STRESZCZENIE
Komórki białaczkowe w PBL-B mogą produkować i wydzielać interleukinę 6 (IL-6), która funkcjonuje jako czynnik
stymulujący i regulujący róŜnicowanie limfocytów B w nowotworowych komórkach limfoidalnych. IL-6 uznaje się
za kluczową cytokinę zaangaŜowaną w mechanizmy obronne organizmu, w procesach krwiotworzenia i reakcjach
zapalnych, o wielokierunkowym działaniu auto- i parakrynnym. Jej produkcja jest zazwyczaj przemijająca i ściśle regulowana. Na komórki docelowe działa za pośrednictwem receptora klasy I.
Stosując metodę RT-PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR), zbadano ekspresję IL-6 i IL-6Rα na poziomie
mRNA, w limfocytach PBL-B w porównaniu z prawidłową subpopulacją limfocytów B (CD19+). Poziom ekspresji
IL-6 wyraŜony wartością RQ w puli limfocytów B wszystkich badanych chorych z PBL-B, w porównaniu z subpopulacją B zdrowych dawców, okazał się być ponad 52 razy mniejszy, natomiast ekspresja mRNA IL-6Rα w B-PBL, była dwukrotnie większa. Porównanie ekspresji mRNA IL-6 i IL-6Rα, w róŜnych stadiach choroby wg Rai’a (0,1,2,4)
wykazało w obu przypadkach największy poziom RQ mRNA w stadium 4 najmniejszy w stadium 1.
SŁOWA KLUCZOWE: PBL-B – IL-6 – IL-6Rα
SUMMARY
B-CLL lymphocytes may produce and secret interleukin 6 (IL-6) that functions as stimulation and differentiation factor of B lymphocytes in neoplastic lymphoid cells. IL-6 is suggested to be a key cytokine engaged in immune response of organisms, hematopoietic processes and inflammatory reactions, based on multidirectioral auto and
paracrine auction. IL-6 production is mainly transitory and strictly regulated. Its action on target cells is mediated by
receptor I.
By the means of Real – Time PCR we studied IL-6 and IL-6Rα expression on mRNA level (RQ) in B-CLL lymphocytes and in CD19+ subpopulation of normal B lymphocytes.
The IL-6 expression level in B-CLL cells was significantly lower (52 times) comparing to CD19+ normal cells while
IL-6Rα mRNA expression in B-CLL was twice as high. Comparison of mRNA expression level of IL-6 and IL-6Rα,
in different disease stages according to Rai (0,1,2,4), showed the highest mRNA expression level for both studied
genes in 4th Rai stage and the lowest in 1st stage of disease.
KEY WORDS: B-CLL – IL-6 – IL-6Rα
WSTĘP
Przewlekła białaczka limfocytowa B-komórkowa (PBL-B) jest nowotworem charakteryzującym się
klonalną proliferacją i akumulacją limfocytów B [1].
284
H. ANTOSZ i wsp.
Analiza Northern blot wykazała, Ŝe komórki białaczkowe w PBL-B mogą produkować i wydzielać
interleukinę 6 (IL-6), która funkcjonuje jako czynnik stymulujący i regulujący róŜnicowanie limfocytów B w nowotworowych komórkach limfoidalnych. Wykazano ponadto, Ŝe IL-6 hamuje proliferację
limfocytów PBL-B indukowaną przez TNF-α [2]. Ze względu na fakt, Ŝe poziom IL-6 w surowicy krwi
chorych korelował ze stadium Rai’a i leukocytozą, Lai i wsp. [3] zasugerowali, aby IL-6 traktować jako
prognostyczny marker B-CLL.
IL-6 uznaje się za jeden z kluczowych czynników zaangaŜowanych w mechanizmy obronne organizmu, w procesach krwiotworzenia i reakcjach zapalnych [4, 5]. Jest silnie działającą drobnocząsteczkową cytokiną o wielokierunkowym działaniu auto- i parakrynnym. Jej produkcja jest zazwyczaj przemijająca i ściśle regulowana. Na komórki docelowe działa za pośrednictwem receptora klasy I, będącego typem receptorów zawierających komponenty wiąŜące ligandy, oraz komponenty przekazujące sygnał transdukcji. Receptor IL-6 składa się z dwóch składników: IL-6Rα (CD126) i glikoproteidu 130
(gp130) czasami zwanego IL-6Rβ. IL-6Rα wiąŜe się precyzyjnie z IL-6 natomiast gp130 odpowiada za
transdukcję sygnału [6].
IL-6R występuje w dwóch formach; w formie związanej z błoną (mIL-6Rα) i w formie rozpuszczalnej (sIL-6Rα) powstającej przez enzymatyczne „odcinanie” błonowego IL-6R przez metaloproteazy
ADAM10 i ADAM17, albo przez translację alternatywnego mRNA [7, 8].
Rozpuszczalny receptor tworzy kompleks z IL-6, który aktywuje komórki w taki sam sposób, jak
sama IL-6. Obecne na powierzchni komórek cząsteczki gp130 wiąŜą kompleksy IL-6/sIL-6R i przekazują sygnał aktywacyjny, pomimo braku mIL-6R. Cząsteczka gp130 nie wykazuje Ŝadnej aktywności
katalitycznej, ale aktywuje szlak przekazywania sygnału za pomocą kinaz tyrozynowych JAK (Janus
kinases) oraz białek STAT (signal transducers and activators of transcription) [9]. Stymulacja gp130
jest istotna dla hematopoezy in vivo.
Potencjalne znaczenie IL-6 wykazano w patogenezie nowotworów wywodzących się z układu
krwiotwórczego i chłonnego, zwłaszcza w białaczkach limfocytowych i chłoniakach. Są doniesienia, Ŝe
IL-6 jest zdolna do stymulacji wzrostu chłoniaków zarówno B- jak i T- komórkowych. Wykazano, wyraźne zwiększenie poziomu IL-6 w surowicy krwi chorych na róŜne typy chłoniaków nieziarniczych, co
jednocześnie okazało się być niekorzystnym czynnikiem rokowniczym [10]. Jeśli zaś chodzi o PBL-B
pojawiły się sprzeczne doniesienia na temat koncentracji IL-6 w surowicy krwi nieleczonych chorych.
Hulkkonen i wsp. [11] wykazali obniŜony poziom IL-6 w surowicy krwi tych chorych. Natomiast Robak i wsp. [12] stwierdzili, Ŝe stęŜenie IL-6 w surowicy nieleczonych chorych z PBL-B nie róŜniło się
znacząco w porównaniu ze zdrową kontrolą. Z kolei Trikha i wsp. [13] wykazali, Ŝe średni poziom IL-6
w surowicy wzrasta wraz ze stadium choroby wg Rai’a, i u chorych w 3/4 stadium, jest znacznie wyŜszy w porównaniu ze zdrową kontrolą.
W świetle w/w danych, stosując między innymi metodę RT-PCR w czasie rzeczywistym (real time
PCR), postanowiliśmy sprawdzić jaka jest ekspresja IL-6 i IL-6Rα na poziomie mRNA, w limfocytach
B białaczki limfocytowej przewlekłej w porównaniu z prawidłową subpopulacją limfocytów B
(CD19+).
MATERIAŁ I METODY
Materiał do badań stanowiły limfocyty krwi obwodowej 32 chorych na przewlekłą białaczkę B limfocytową (PBL-B). Rozpoznanie ustalono w Klinice Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Kostnego Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. W okresie poprzedzającym badanie Ŝaden z chorych nie był
leczony. Grupa badawcza obejmowała 12 kobiet i 20 męŜczyzn w wieku od 39-83 lat (mediana: 68).
Stopień zaawansowania choroby był róŜny u poszczególnych chorych i obejmował stadia 0,1,2,4
wg charakterystyki Rai’a. W stadium 0 było 7 chorych, w stadium pierwszym – 8, w drugim – 10
i w czwartym – 7 chorych. Grupę kontrolną stanowiło 10 zdrowych dorosłych dawców w wieku od 35
do 72 lat (mediana: 64).
Ekspresja IL-6 i IL-6Rα na poziomie mRNA
285
Izolacja limfocytów krwi obwodowej
Krew pobierano na 3,8% cytrynian sodu a następnie izolowano limfocyty przez wirowanie w gradiencie gęstości limphoprepu, zmodyfikowaną metodą Böyuma [15].
Manualna technika selekcji pozytywnej
Do zawiesiny komórek (107) w roztworze soli fizjologicznej z EDTA (PBE) dodano przeciwciało
CD19 MultiSort MicroBeads sprzęŜone z cząstkami paramagnetycznymi MACS w ilości 20 µl na 107
badanych komórek. Zawiesinę komórek i przeciwciał inkubowano w temperaturze 4–8°C przez 15 min.
Następnie komórki przepłukiwano PBS (roztwór soli fizjologicznej) i odwirowywano (300×g; 10 min.,
18°C). Po usunięciu supernatantu osad zawieszano ponownie w roztworze PBE do końcowej objętości
500 µl. Mieszaninę wyznakowanych przeciwciałami komórek sprzęŜonych z koloidowymi cząstkami
paramagnetycznymi MACS przenoszono do kolumn izolacyjnych MS o pojemności 1,5 ml, które
umieszczano w separatorze magnetycznym (MiniMACS Separator). Komórki nie opłaszczone przeciwciałem komórki wymywano z kolumny 1,5 ml roztworu PBE. Po usunięciu kolumny MS z pola magnetycznego opłaszczone cząsteczkami koloidowymi MACS komórki wypłukiwano 1 ml PBS. Pomiaru
liczby komórek oraz czystości preparatu (odsetek komórek dodatnich w znakowanej frakcji) dokonywano przy pomocy cytometrii przepływowej (FACS Calibur, Becton Dickinson).
Oznaczanie immunofenotypu wyizolowanych limfocytów
Ekspresja antygenów powierzchniowych limfocytów B została oznaczona przy uŜyciu mysich antyludzkich przeciwciał monoklonalnych specyficznie wiąŜących następujący panel antygenów: CD5 PE
/CD19 FITC (Becton Dickinson/ Becton Dickinson). Do kaŜdej badanej próby wykonywano kontrolę
negatywną stosując ten sam izotyp sprzęŜony z tym samym fluorochromem. Próby wykonano ściśle
z zaleceniem producenta.
Izolacja RNA
Izolacji RNA dokonywano zmodyfikowaną metodą Chomczyńskiego [16].
Synteza cDNA
Syntezę cDNA przeprowadzano przy uŜyciu zestawu odczynników High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit (AppliedBiosystems), zgodnie z procedurą zalecaną przez producenta. W skrócie: do
syntezy cDNA uŜyto 1µg RNA, którego ilość oceniano metodą spektrofotometryczną przy uŜyciu aparatu NanoDrop 2000 firmy Thermo SCIENTIFIC. Do reakcje syntezy cDNA uŜyto: buforu reakcyjnego
(10x RT buffer), wszystkich dNTP (100 mM), odwrotnej transkryptazy 50 U/µl (MultiScribe RT), sześcionukleotydowych starterów (10X RT Random Primers), inhibitora RN-az. Mieszaninę reakcyjną
uzupełnianio wodą wolną od RN-az do 20µl. Warunki reakcji zdefiniowano następująco: etap I: 25°C, 10
minut; etap II: 37°C, 120 minut; etap III: 85°C, 5 sekund.
Badanie ekspresji genów metodą PCR w czasie rzeczywistym
Uzyskane po odwrotnej transkrypcji próby cDNA amplifikowano w czasie rzeczywistym przy uŜyciu
techniki półilościowej analizy ekspresji w czasie rzeczywistym-Real Time PCR. Procedurę PCR wykonano
w aparacie 7300 Real-Time System firmy Applied Biosystems, z wykorzystaniem oprogramowania SDS.
Mieszanina reakcyjna zawierała: 1,25 µl mieszaniny sondy i starterów specyficznych dla badanych
genów (Applied Biosystems), 12,5 µl buforu TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems),
10,25 µl H2O oraz 1 µl cDNA. Reakcję prowadzono na płytce optycznej w objętości 25 µl. Zastosowano
następujące zestawy sond typu TaqMan znakowanych FAM-NFQ i starterów dla genów: IL-6 i IL-6Rα oraz
GAPDH jako genu referencyjnego kontroli (Applied Biosystems). Warunki reakcji: denaturacja wstępna
95°C 10 minut, 40 cykli: 95°C 15s, 60°C 60s. Ilość kopii cząsteczek badanych genów kwasu nukleinowego
była monitorowana w kaŜdym cyklu reakcji amplifikacji. Ilość cykli reakcji PCR, po których poziom flu-
286
H. ANTOSZ i wsp.
orescencji przekroczył zdefiniowany próg (tCT), była stosowana do obliczenia ilości badanych cząsteczek
obecnych w mieszaninie na początku reakcji (analiza przy uŜyciu oprogramowania RQ Study – ang. relative
quantification; AppliedBiosystems). Dla kaŜdej próby wartość CT dla genu referencyjnego GAPDH była
uŜyta do poziomu normalizacji ekspresji badanych genów. Poziomy ekspresji badanych genów (∆CT) wyznaczono według wzoru: ∆CT genu= CT genu- CT GAPDH
Ekspresję względną (RQ) badanych genów oznaczono wg wzoru:
RQ= 2-(∆CT genu - ∆CT kalibratora) gdzie: ∆CT kalibratora = CT genu kalibratora - CT GAPDH kalibratora.
WYNIKI
Ocena immunofenotypu limfocytów badanych chorych
U 32 chorych z rozpoznaniem przewlekłej białaczki limfocytowej wykonano badanie immunofenotypowe antygenów powierzchni komórki, charakterystycznych dla limfocytów PBL-B, metodą cytometrii przepływowej. Odsetek komórek CD5+/CD19+ wynosił 80,67±12,04%. Subpopulację tę przyjęto
traktować jako białaczkową (Rycina 1).
R2
Ryc. 1. Immunofenotyp powierzchni limfocytów PBL-B
Fig. 1. Immunophenotype of B-CLL lymphocytes surface
Grupę porównawczą stanowiła czysta subpopulacja limfocytów B zdrowych dawców. Za kryterium
czystości przyjęto ekspresję antygenu CD19 na powierzchni limfocytów B. Kontrolę czystości przeprowadzono w cytometrze przepływowym. Odsetek subpopulacji B w kaŜdej z badanych, kontrolnych
prób przekraczał 94% (Rycina 2).
Ryc. 2. Ocena czystości prawidłowej subpopulacji limfocytów B (CD19+)
Fig. 2. Purity evaluation of normal B lymphocytes subpopulation (CD19+)
Ekspresja IL-6 i IL-6Rα na poziomie mRNA
287
Ekspresja mRNA IL-6 w limfocytach PBL-B
Średni poziom ekspresji względnej RQ mRNA IL-6, wszystkich badanych chorych w porównaniu
ze zdrową grupą kontrolną był 52,32 razy niŜszy (0,000553 vs 0,028935) (Rycina 3).
IL-6
0,03
0,02
0,01
0
PBL-B
CD19+ Norma
Ryc. 3. Porównanie średniej ekspresji względnej mRNA IL-6 wszystkich badanych chorych z grupą zdrowych dawców
(CD19+)
Fig. 3. Comparison of relative average IL-6 mRNA expression in all studied cases of B-CLL with healthy donors (CD19+)
Przeprowadzona analiza ekspresji względnej (RQ) mRNA IL-6 pomiędzy chorymi znajdującymi się
w róŜnych stadiach chorobowych wykazała, największy poziom ekspresji w stadium 4 choroby, natomiast najmniejszy w stadium 1. W porównaniu z grupą referencyjną poziom ekspresji mRNA IL-6
w przypadku stadium Rai’a 0 i 2 był 47 razy mniejszy, w stadium 1 – 447 razy, natomiast w stadium 4
– 37,5 razy mniejszy (Rycina 4, Tabela 1).
Tabela 1. Poziom ekspresji względnej mRNA IL-6 w róŜnych stadiach choroby wg Rai’a w porównaniu z ekspresją względną
mRNA IL-6 grupy referencyjnej
Table 1. Relative IL-6 mRNA expression level in different stages of disease according to Rai in comparison with reference group
RQ
RQ IL-6
norma/PBLB
0
0,000612
Stadium B-PBL wg Rai’a
1
2
6,47E-05
0,000625
47
447
Norma
4
0,000798
47
0,028935
37,5
Stadium wg Rai'a
IL-6
0,0008
0,0006
0,0004
0,0002
0
0
1
2
4
Ryc. 4. Porównanie średniej ekspresji względnej mRNA IL-6 chorych na PBL-B, znajdujących się w róŜnych stadiach choroby
Fig. 4. Comparison of average relative IL-6 mRNA expression in B-CLL patients in different stages of disease according to Rai
H. ANTOSZ i wsp.
288
Średni poziom ekspresji względnej RQ mRNA IL-6Rα, wszystkich badanych chorych w porównaniu ze zdrową grupą kontrolną był ponad dwa razy większy (0,307489 vs 0,136794) (Rycina 5).
IL-6R
0,4
0,3
0,2
0,1
0
PBL-B
CD19+ Norma
Ryc. 5. Porównanie średniej ekspresji względnej mRNA IL-6Rα wszystkich badanych chorych z grupą zdrowych dawców
Fig. 5. Comparison of relative average IL-6 Rα mRNA expression in all studied cases of B-CLL with healthy donors (CD19+)
Przeprowadzona analiza ekspresji względnej mRNA IL-6Rα pomiędzy chorymi znajdującymi się w
róŜnych stadiach chorobowych wykazała, podobnie jak w przypadku mRNA IL-6, największy poziom
ekspresji w stadium 4 choroby, natomiast najmniejszy w stadium 1. W porównaniu z grupą referencyjną poziom ekspresji mRNA IL-6Rα w stadium Rai’a 0, 2 i 4 był większy i odpowiednio wynosił 1,74
razy, 1,97 oraz 2,31 razy. Jedynie w stadium 1 poziom ekspresji względnej był większy w grupie referencyjnej (norma/PBL-B= 1,38) (Rycina 6, Tabela 2).
Tabela 2. Poziom ekspresji względnej mRNA IL-6Rα w róŜnych stadiach choroby wg Rai’a w porównaniu z ekspresją
względną mRNA IL-6Rα w grupie referencyjnej
Table 2. Relative IL-6Rα mRNA expression level in different stages of disease according to Rai in comparison with reference
group
RQ IL-6Rα
RQ IL-6Rα
PBLB/norma
Stadium B-PBL wg Rai’a
1
2
0,098474
0,27068
0
0, 23883
1,74
0,72
1,97
IL-6R
Norma
4
0,316962
0,136794
2,31
Stadium wg Rai'a
0,4
0,2
0
0
1
2
4
Ryc. 6. Porównanie średniej ekspresji względnej mRNA IL-6Rα chorych na PBL-B, znajdujących się w róŜnych stadiach
choroby
Fig. 6. Comparison of average relative IL-6Rα mRNA expression in B-CLL patients in different stages of disease according to Rai
Ekspresja IL-6 i IL-6Rα na poziomie mRNA
289
DYSKUSJA
Na skutek bogactwa nowych informacji o komórkach białaczkowych poglądy na temat PBL-B
w ostatniej dekadzie zostały zweryfikowane. PBL-B jest obecnie postrzegana jako choroba akumulacyjna, w której komórki wywodzą się ze stymulowanych antygenowo dojrzałych limfocytów B, a ich
pula jest stale uzupełniana przez proliferację komórek prekursorowych [1]. Są nowe sugestie, Ŝe to
stymulacja antygenowa, łącznie z dodatkowymi komórkami i cytokinami jest odpowiedzialna za indukcję proliferacji komórek białaczkowych i unikanie apoptozy. Efekty tego działania mogą być róŜne
w odrębnych podgrupach PBL-B i mogą prowadzić do odmiennego przebiegu klinicznego indywidualnych przypadków. Mimo heterogenności PBL-B, receptory komórek B (BCR) róŜnych chorych są często strukturalnie bardzo podobne, co sugeruje, podobieństwo przyłączających się antygenów, mających
znaczenie w patogenezie PBL [17, 18].
Mimo tego, Ŝe dotychczas nie zidentyfikowano antygenu/antygenów aktywacji białaczkowych limfocytów B nie moŜna wykluczyć, Ŝe są nimi jakieś latentne wirusy lub bakterie. W tym kontekście,
poza BCR, rozwaŜa się udział innych receptorów, w tym receptorów Toll-podobnych (TLR – ang. Toll
like receptors) [19]. Reakcją na taką antygenową indukcję byłaby synteza rozmaitych cytokin, w tym
interleukiny IL-6.
Głównym czynnikiem stymulującym wytwarzanie IL-6 jest interleukina 1 (IL-1), interferony (INF),
czynniki martwicy nowotworów (TNF), lipopolisacharydy (LPS), oraz wirusy DNA i RNA. IL-6, jako
cytokina o właściwościach autokrynnych, oddziałuje na własną komórkę za pośrednictwem swoistego,
złoŜonego receptora. Przekazanie sygnału jest moŜliwe dzięki oddziaływaniu kompleksu sygnalizacyjnego gp130 z cytoplazmatycznymi kinazami układu JAK, które fosforylują czynniki transkrypcyjne
STAT1 i STAT3 (signal transduction and activators of transctiption) [20, 21].
Funkcja czynników STAT pozostaje pod kontrolą białek regulatorowych – supresorów sygnalizacji
pochodzącej od cytokin –SOCS (suppressors of cytokine signaling) i białek CIS (cytokine- inducible
SH2 protein) [2, 3, 15].Cząsteczki SOCS1 i SOCS3 są inhibitorami mechanizmów immunologicznych
zachodzących w komórkach za pośrednictwem m.in. IL-6 i LPS [10, 14]. Białko SOCS3 ma zdolność
selektywnego hamowania sygnałów wewnętrznych, aktywowanych za pośrednictwem IL-6, na skutek
blokowania cząsteczki receptorowej gp130 [30]. Brak prawidłowej funkcji anty-onkogenów SOCS/CIS
(głównie SOCS1 i SOCS3) stwierdzono w komórkach guzów litych oraz w szpiczaku mnogim i AML
(ang. acute myeloid leukemia) [28, 29].
Wykazano równieŜ, Ŝe białka TOLLIP (Toll-interacting protein), uniemoŜliwiają wytwarzanie IL-6
poprzez blokowanie aktywności IL-1, głównego stymulatora IL-6 [30, 31].
Mimo ogromnego postępu w badaniach molekularnych dotyczących działania interleukin, mechanizm regulacji czynności genu IL-6 i jej receptora, nie został do końca wyjaśniony. Dlatego nasze badania koncentrowały się na ustaleniu poziomu ekspresji mRNA IL-6 i mRNA IL6-Rα w limfocytach białaczkowych CD5+/CD19+ oraz dla porównania w izolowanej, prawidłowej subpolulacji limfocytów B
CD19+, po wyeliminowaniu subpopulacji T (CD5+).
Obserwowany, przez Hulkkonen i wsp. (17), niski poziom IL-6 w surowicy krwi w PBL-B jak
równieŜ stwierdzona przez nas, ponad 52 razy mniejsza ekspresja mRNA IL-6, w porównaniu z prawidłową subpopulacją komórek B CD19+ i jednocześnie ponad dwukrotnie większa ekspresja mRNA IL6Rα, moŜe mieć róŜne podłoŜe. O przyczynach tego faktu moŜna obecnie jedynie spekulować. Wydaje
się, Ŝe obserwowane róŜnice ekspresji genu IL-6 na poziomie mRNA, w porównywanych białaczkowych i prawidłowych subpopulacjach B (a nie ogólnie w limfocytach krwi obwodowej), mogą wynikać
z defektywnej potranskrypcyjnej modyfikacji mRNA IL-6 w PBL-B, jak równieŜ nieprawidłowych
mechanizmów indukcji i transdukcji sygnałów pochodzących ze środowiska zewnętrznego, bądź sumujących się w/w przyczyn.
Jest bardzo niewiele danych na temat funkcji białek inhibitorowych SOCS i TOLLIP w PBL-B.
Nie moŜna wykluczyć, Ŝe obserwowana mała ekspresja mRNA IL-6 w limfocytach białaczkowych,
290
H. ANTOSZ i wsp.
moŜe być spowodowana inhibicją, któregoś z ogniw łańcucha tzw. wtórnych przekaźników informacji,
co skutkuje słabą aktywacją genu IL-6. Jest wielce prawdopodobne, Ŝe swój udział w obserwowanej
ekspresji, moŜe mieć któreś z tych inhibitorowych białek.
Nieprawidłowy poziom IL-6 moŜe powodować opóźnianie apoptozy i akumulację długo-Ŝyjących
komórek nowotworowych. Na tej podstawie Hulkkonen i wsp. [11] snują domysły, Ŝe stałe, niskie
uwalnianie IL-6, obserwowane w komórkach PBL-B, jest reakcją obronną na intensywną ekspansję
komórek B. Stąd niska produkcja IL-6 moŜe prowadzić do progresji choroby i akumulacji w krwi obwodowej komórek nowotworowych.
Wyjaśnienie moŜe być jednak inne, zwłaszcza w świetle odmiennych danych uzyskanych przez
grupę francuskich badaczy [13].
Trudno równieŜ wyjaśnić przyczynę, stwierdzonej przez nas, ponad dwukrotnie większej ekspresji
mRNA receptora IL6-Rα chorych z PBL-B, w porównaniu z grupą zdrowych dawców. MoŜna domniemywać, Ŝe na skutek niedostatecznego poziomu IL-6 i jej autokrynnego oddziaływania, komórki
rekompensują brak odpowiednich bodźców, nadmierną ekspresją mRNA IL-6Rα, a takŜe białka, co
wykazali Robak i wsp. [12]. Cytowani autorzy udowodnili, Ŝe w surowicy chorych na PBL-B występuje znamiennie większy poziom białka sIL-6Rα, co koreluje z progresją choroby.
Ze względu na fakt, Ŝe IL-6 i składowe receptora (IL-6Rα, sIL-6Rα oraz gp130) odgrywają istotną
rolę w patogenezie róŜnych chorób w tym PBL-B, inhibitory receptora IL-6 wykorzystuje się jako opcje
terapeutyczne w róŜnych schorzeniach. Konieczne jest zatem, kontynuowanie badań nad tym interesującym celem terapii nowej generacji.
PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M. Mechanisms of disease: Chronic lymphocytic leukemia. The New England Journal of
Medicine. 2005; 352: 804-815.
Hong DS, Angelo LS, Kurzrock R. Interleukin-6 and its receptor in cancer: implications for Translational Therapeutics.
Cancer 2007; 110: 1911-28.
Lai R, O’Brien S, Maushouri T, Rogers A, Kantarjian H, Keating M, Albitar M. Prognostic Value of plasma interleukin-6
levels In patients with chronic lymphocytic leukemia . Cancer 2002; 95: 1071-1075.
Culig Z, Steiner H, Bartsch G, Hobisch A. Interleukin-6 regulation of prostate cancer cell growth. J. Cell Biochem. 2005;
95: 497-505.
Salado R, Junius S, Benoy I, Van Marck E, Huget P, Dirix LY. Circulating interleukin-6 predictors survival in patients
with metastatic breast cancer. Int. J. Cancer 2003; 103: 642-646.
Kishimoto T, Akira S, Taga T. Interleukin-6 and its receptor: a paradigm for cytokines. Science 1992; 258: 593-597.
Rose-John S, Waetzig GH, Scheller J, Grötzinger J, Seegert D. The IL-6/sIL-6R complex as a novel target for therapeutic
approaches. Expert Opin. Ther. Targets 2007; 11: 613-624.
Grotzinger J. Molecular mechanisms of cytokine receptor activation. Biochim Biophys. Acta 2002; 1592: 215-223.
Murray PJ. The JAK-STAT signaling pathway: input and output integration. J. Immunol. 2007; 178: 2623-2629.
el-Far M, Funda M, Yahya R, el-Baz H. Serum IL-10 and IL-6 levels at diagnosis as independent predictors of outcome in
non-Hodgkin’s lymphoma. J. Physiol. Biochem. 2004; 60: 253-258.
Hulkkonen J, Zilpo J, Zilpo L, Hurme M. Diminished production of interleukin-6 in chronic lymphocytic leukemia (BCLL) cells from patients at advanced stages of disease. Br. J. Haemat. 1998; 100: 478-483.
Robak T, Wierzbowska M, Błasińska-Morawiec M, Korycka A, Błoński JZ. Serum levels of IL-6 type cytokinez and
soluble IL-6 receptors in active B-cell chronic lymphocytic leukemia and in cladribine induced remission. Mediators of
Inflamation 1999; 8: 277-286.
Trikha M, Corringham R, Klein B, Ross J-F. Targeted anti-interluekin-6 monoclonal antibody therapy for cancer: a review of the rationale and clinical evidence. Clin. Cancer Res. 2003; 9: 4653-4665.
Rai KR, Sawitsky A, CronkiteEP, Chanana AD, Levy RN, Pasternack BS. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 1975; 46: 219-234.
Böyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one
centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. Supplement, 1968; 97: 77-89.
Ekspresja IL-6 i IL-6Rα na poziomie mRNA
291
16. Chomczyński P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform
extraction. Anal. Biochem. 1987; 162: 156-159.
17. Chiorazzi N, Ferrarini M. B cell chronic lymphocytic leukemia: lessons learned from studies of the B cell antygen receptor. Annu. Rev. Immunol. 2003; 21: 841-894.
18. Stevenson FK, Caligaris-Cappio F. Chronic lymphocytic leukemia: revelation from the B-cell receptor. Blood 2004; 103:
4389-4395.
19. Caligaris-Cappio F. Chronic lymphocytic leukemia Hematology meeting reports 2008; 2: 46-49.
20. Naka T, Nishimoto N, Koshimoto T. The paradigm of IL-6: from basic science to medicine. Arthritis Res. 2002; 4: 233242.
21. Jones SA, Richards PJ, Scheller J, Rose-John S. IL-6 trans-signalling: the in vivo consequences. J. Interferon Cytokine
Res. 2005; 25: 241-253.
22. Baltayiannis G, Baltayiannis N, Tsianos EV. Suppressors of cytokine signaling as tumor repressors . Silencing of SOCS3
facilitates tumor formation and growth in lung and liver. J BUON 2008; 13: 263-265.
23. Borges S, Moudilou E, Vouyovitch C, Chiesa J, Lobie P, Mertani H, Raccurt M. Involvement of JAK/STAT pathway
inhibitor: cytokine inducible SH2 containing protein in breast cancer. Adv. Exp. Med. Biol. 2008; 617: 321-329.
24. Hennighausen L, Robinson GW. Interpretation of cytokine signaling through the transcription factrors STAT5A and
STAT5B. Genes Dev. 2008; 22: 711-721.
25. Hang S, Guo D, Jiang L, Hang Q, Qiu X, Wang E. SOCS3 inhibiting migration of A549 cells correlates with PYK2 signaling in vitro. BMC Cancer 2008; 8: 150.
26. Dickensheets H, Vazquez N, Sheikh F, Gingras S, Murray PJ, Ryan JJ, Donnelly RP. Suppressors of cytokine signaling-1
is an IL-4-inducible gene in macrophages and feedback inhibits IL-4 signaling. Genes Immun. 2007; 8: 21-27.
27. Yasukawa H, Ohishi M, Mori H, Murakami M, Chinen T, Aki D, Hanada T, Takeda K, Akira S, Hashijima M, Hirano T,
Chien KR, Yoshimura A. IL-6 induced an anti-inflamatory response in the absence of SOCS3 in macrophages. Nat. Immunol. 2003; 4: 551-556.
28. Haffner MC, Petridou B, Peyrat JP, Revillion F, Müller-Holzner E, Daxenbichler G, Marth C, Doppler W. Favorable
prognostic value of SOCS2 and IGF-I In breast cancer. BMC Cancer 2007; 7: 136.
29. Yoshimura A, Nishinakamura H, Matsumura Y, Hanada T. Negative regulation of cytokines signaling and immune responses by SOCS proteins. Artritis Res. Ther. 2005; 7: 100-110.
30. Arancibia SA, Beltrán CJ, Aguirre IM, Silva P, Peralta AL, Malinarich F, Hermowo MA. Toll-like receptors are key
participants in innate immune response. Biol. Res. 2007; 40: 97-112.
31. Shibolet O, Podolsky DK. TLR in the Gut.IV. Negative regulation of Toll-like receptors and intestinal homeostasis: addition by substraction. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2007; 292: G1469-G1473.
Praca wpłynęła do Redakcji 21.04.2010 r. i została zakwalifikowana do druku 21.04.2010 r.
Adres Autorów:
Dr hab. n. med. Halina Antosz
Samodzielna Pracownia Genetyki Klinicznej
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
Ul. Radziwiłłowska 11
20-950 Lublin
e-mail: [email protected]
tel. 81 526 84 37