Ocena ekspresji markerów apoptozy w ziarninie w przewleklym

advertisement
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
147
Ocena ekspresji markerów apoptozy w ziarninie w przewlekłym
zapaleniu ucha środkowego
Evaluation of apoptosis expression in granulation tissue in chronic otitis media
Anna Pajor, Marian Danilewicz¹, Tomasz Durko, Andrzej Jankowski
SUMMARY
Introduction: There is a growing evidence that molecular and cellular mechanisms may play a role in pathogenesis in
chronic otitis media.
The aim of the study: was to determine the intensity of apoptosis in granulation tissue in chronic otitis media.
Material and method: Fifty four patients with chronic otitis media, who underwent surgical treatment, were enrolled
into the study. The apoptosis was measured in paraffi n-embedded granulation tissue specimens by an immunohistochemical methods, by staining with a monoclonal antibody against apo-1/Fas/CD95 and P53 protein. The bacteriological
evaluation of middle ear discharges were also done.
Results: It was found statistically significant difference in expression of apo-1/Fas antigen between the groups with
good clinical course (good healing and without recurrence) than those in the group with poor healing and recurrence
(mean percentage of immunopositive cells 1,52 vs 3,34 respectively, p<0,001). The activity of apo-1/Fas antigen was
more intense in tissue samples from the group with bacterial infection caused by Pseudomonas aeruginosa/Proteus
sp/Staphyloccocus MRSA than those in the group without this infection (mean percentage of immunopositive cells
3,78 vs 1,75 respectively, p<0,001). The differences were also observed for P53 protein expression between the same
groups, however they were not significant. There was no differences between the groups of patients with granulomatous and cholesteatomatous chronic otitis media. The signifi cant negative correlation was found between expression
of apo-1/Fas antigen and expression of P53 protein (r= - 0,64, p<0,001).
Conclusions: In granulation tissue in chronic otitis media different expression of apo-1/Fas antigen was found in relationship to clinical course of disease and bacterial infection caused by Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA. It may suggest that apoptosis mediated by apo-1/Fas mechanism may contribute to pathogenesis of
chronic otitis media.
Hasła indeksowe: przewlekłe zapalenie ucha środkowego, ziarnina, apoptoza
Key words: chronic otitis media, granulation tissue, apoptosis
Wstęp
Przebieg kliniczny i niepowodzenie w leczeniu chirurgicznym przewlekłego zapalenia ucha środkowego
(p.z.u.śr.) zależą od wielu czynników, wśród których
wymienia się postać zapalenia, czas trwania choroby,
rodzaj towarzyszącej infekcji bakteryjnej i sposób leczenia [1]. Istotnym problemem są nawracające zaostrzenia
procesu zapalnego, które prowadzą do stopniowego pogarszania się stanu słuchu. W wyniku stanu zapalnego
w jamach ucha środkowego powstaje ziarnina, która
złożona jest z naczyń i tkanki łącznej i wraz z naciekiem zapalnym stanowi najbardziej typowy wykładnik
p.z.u.śr. Da Costa i wsp. [2] stwierdzili jej występowanie
w ponad 95% kości skroniowych u chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego.
W rozwoju przewlekłego zapalenia ucha środkowego
podkreśla się ostatnio znaczenie molekularnych i komórkowych procesów patofizjologicznych, zwłaszcza
rolę procesów apoptozy i proliferacji. W coraz liczniejszych pracach oceniano ekspresję różnych substancji
bioaktywnych, zarówno w perlaku jak i w innych poOtolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
staciach przewlekłego zapalenia ucha środkowego, ale
wyniki tych badań są niejednoznaczne [3-13].
Apoptoza jest aktywnym procesem prowadzącym
do śmierci komórki, w którym usuwane są komórki uszkodzone, zużyte i niepotrzebne. Bierze udział
w wielu procesach fizjologicznych i patologicznych
w organizmie, w embriogenezie, onkogenezie, funkcjonowaniu komórek układu immunologicznego, zakażeniach wirusowych, w rozwoju chorób autoimmunologicznych i neurodegeneracyjnych [14]. Apoptoza może
być aktywowana przez dwa podstawowe mechanizmy:
zewnętrzny, receptorowy (szlak Fas/FasL) i wewnętrzny, mitochondrialny (szlak zależny od białka P53), ale
poznano również inne drogi indukcji – poprzez szlak
pseudoreceptorowy z udziałem perforyny i granzymu
B, szlak sfingomielinowo-ceramidowy i szlak indukowany stresem związany z siateczką cytoplazmatyczną
[15–17].
W mechanizmie zewnątrzkomórkowym sygnał
apoptozy przekazywany jest przez receptory śmierci
Otolaryngol Pol 2009;
63 (2): 147-153
©by Towarzystwo
Otorynolaryngologów –
Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
31.11.2008
Zaakceptowano do
druku/Accepted:
29.12.2008
I Katedra Otolaryngologii
UM w Łodzi,
Uniwersytecki Szpital
Kliniczny nr 1
im. N. Barlickiego
Kierownik: prof. dr hab.
med. Tomasz Durko
Pracownia Morfometrii
Zakładu Nefropatologii
U.M. w Łodzi¹
Kierownik: prof. dr hab.
med. Marian Danilewicz
Praca finansowana
w ramach projektu
badawczego
Uniwersytetu
Medycznego w Łodzi,
nr tematu 502-11-454
Wkład pracy autorów/
Authors contribution:
według kolejności
Konflikt interesu/
Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają
konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for
correspondence:
imię i nazwisko:
Anna Pajor
adres pocztowy:
I Katedra Otolaryngologii
UM w Łodzi
Uniwersytecki Szpital
Kliniczny nr 1
im. N. Barlickiego
ul. Kopcińskiego 22
90-153 Łódź
tel. (42) 6785-785
fax 48426785785
e-mail [email protected]
lodz.pl
148
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
(apo-1/Fas/CD95, TNF-R1, TRAMP (TNF related apoptosis mediating protein /DR3, TRAIL-R1 (TNF related
apoptosis inducing ligand)/DR4, TRAIL-R2/DR5, DR6)
należące do rodziny receptorów czynnika martwicy
guza TNFR (tumor necrosis factor receptor) [14, 18-20].
W części cytoplazmatycznej receptora mają one domenę
śmierci (DD – death domain), dzięki której rekrutują
cząsteczki adaptorowe. Najlepiej poznanym z receptorów śmierci jest receptor Fas (CD95, apo-1), będący
proteiną błonową typu I o ciężarze cząsteczkowym
47-kDa. Przekazuje on sygnał apoptozy do komórki
poprzez swój ligand – FasL, który jest proteiną błonową
typu II o ciężarze cząsteczkowym 37-kDa należącą do
rodziny czynnika martwicy guza TNF (tumor necrosis
factor) [20]. Po połączeniu receptora Fas z FasL, do
Fas przyłącza się białko adaptorowe FADD – domena
śmierci związana z Fas (Fas-associated death domain),
a do niego przez jego domenę efektorową śmierci (DED
– death effector domain) – prokaspaza 8 lub 10, nieaktywna forma kaspazy 8 lub 10. Receptor Fas, FADD
oraz prokaspaza 8 lub 10 tworzą kompleks inicjujący
apoptozę (DISC – death-inducing signaling complex).
Zaktywowana kaspaza 8 albo 10 uruchamia kaskadę
kaspaz i prowadzi do śmierci komórki [21].
W mechanizmie wewnątrzkomórkowym mitochondrialnym indukcji apoptozy dochodzi do uwolnienia
z mitochondrium do cytoplazmy cytochromu c. Łączy się on tam z białkiem Apaf-1 (apoptotic protease
activating factor-1) i razem z prokaspazą -9 tworzą
apoptosom, a następnie aktywując kaspazę -9 inicjują
kaskadę kaspaz.
W mechanizmie tym dużą rolę odgrywa białko
P53. Jest ono produktem genu p53 i reguluje wiele
szlaków molekularnych jak cykl komórkowy, syntezę
DNA, apoptozę. Uważane jest też za jeden z najbardziej
istotnych elementów kancerogenezy. Białko P53 wpływa na zwiększenie uwalniania cytochromu c, poprzez
indukcję ekspresji genów proapoptotycznych białek zależnych od p53, takich jak Puma, Bax, Apaf-1 czy Noxa
lub hamowanie ekspresji białek antyapoptotycznych,
do których należą m.in. Bcl-2 i surwiwina [17, 22].
Oba szlaki apoptozy wewnątrz- i zewnątrzkomórkowy mogą łączyć się przez skrzyżowanie ścieżek (crosstalk) za pośrednictwem białka Bid (BH3 interacting
domain death agonist), białka proapoptotycznego z rodziny Bcl-2 i mającego tylko domenę BH3. Może ono
ulec proteolizie dzięki działaniu kaspazy 8, której
aktywacja przez kompleks inicjujący apoptozę (DISC)
jest elementem szlaku zewnątrzkomórkowego. Białko
to w postaci skróconej tBid (truncated Bid) łączy się
z białkiem Bax i może wpływać na uwalnianie cytochromu c z mitochondrium, co stanowi składową
szlaku wewnątrzkomórkowego [17, 23].
Celem pracy jest ocena ekspresji markerów apoptozy
(receptora apo-1Fas/CD95 i białka P53) w ziarninie
w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego w zależności od przebiegu klinicznego choroby, zakażenia
bakteryjnego i postaci p.z.u.śr.
Materiał i metoda
Badania przeprowadzono u 54 chorych w wieku od 19
do 77 lat (średnia 46,4±15,6 lat), 33 mężczyzn i 21 kobiet, z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego poddanych leczeniu chirurgicznemu (operacja radykalna
i radykalna zmodyfikowana). Badania przeprowadzono
w porównawczych grupach chorych zróżnicowanych
ze względu na:
– przebieg kliniczny choroby (grupa N – przebieg
kliniczny choroby był pomyślny, tj. proces gojenia pooperacyjnego przebiegał prawidłowo i nie stwierdzono
nawrotu choroby i grupa R – przebieg kliniczny choroby
był niekorzystny, tj. proces gojenia był przedłużony
i powikłany nawrotem procesu zapalnego);
Tabela I. Charakterystyka badanych grup chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego:
grupa N – przebieg kliniczny choroby pomyślny, grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny;
grupa B1 – ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA, grupa NB1
– bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1;
grupa Z - zapalenie ziarninowe bez perlaka, grupa P - zapalenie z perlakiem.
Cecha
Grupa N
Grupa R
Grupa B1
Grupa NB1
Grupa Z
Grupa P
Liczba osób
25
29
20
34
38
16
Wiek: zakres
średnia(SD)
20-77
50,8±17,8
19-75
42,7±12,6
19-71
45,8±13,8
20-77
46,8±16,8
19-77
46,8±15,6
28-74
45,6±16,0
Płeć: K/M
0,44
0,34
0,4
0,38
0,42
0,31
Zakażenie
bakteryjne(+),
68%
79,3%
100%*
58,8%*
65,8%*
93,8%*
w tym P.aerug./ Prot./
Staph. MRSA (+)
16%*
55,2%*
100%*
0%*
31,6%
50,0%
Istotność statystyczna między grupami: * – p< 0,05
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Przyjęto, że przebieg kliniczny był pomyślny, jeżeli
do 3 miesięcy po zabiegu operacyjnym ucho uległo
wygojeniu, a w okresie 3-letniej obserwacji nie było
wycieków z ucha i nawrotów stanu zapalnego.
– współistnienie i rodzaj zakażenia bakteryjnego
(grupa B - ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym i grupa NB – bez współistniejącego zakażenia
bakteryjnego; dodatkowo ze względu na patogenność
bakterii i trudności w ich eradykacji wyróżniono grupę
B1 – ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas
aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA i grupę
NB1 – bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego lub
z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1);
W grupie chorych B u 20 osób wyhodowano bakterie
Pseudomonas aeruginosa, Proteus sp. i/lub Staphylococcus aureus MRSA, u pozostałych 20 osób stwierdzono
zakażenie następującymi drobnoustrojami: Dyphteroides spp. – u 5 osób (współistniejące z Escherichia coli
ESBL (-) – u 2 osób), Staphylococcus epidermidis – u 4
osób, Staphylococcus aureus – u 10 osób (współistniejące z Streptococcus pneumoniae – u 1 osoby) i Escherichia
coli ESBL (-) – u 1 osoby. Zakażenie grzybicze Candida
parapsilosis występowało u dwóch chorych jako współistniejące z zakażeniem bakteryjnym, u jednego chorego
– ze Staphylococcus aureus, u drugiego – z Pseudomonas
aeruginosa i Stahylococcus aureus.
– postać przewlekłego zapalenia ucha środkowego
(grupa Z - zapalenie ziarninowe bez perlaka i grupa P
– zapalenie z perlakiem).
W grupie chorych o niekorzystnym przebiegu klinicznym p.z.u.śr. średnia wieku była niższa niż w grupie
chorych o pomyślnym przebiegu choroby (42,7 vs 50,8
lat, p=0,057) i częściej występowało u nich zakażenie
Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus
MRSA (55,2% vs 16%, p=0,002). Ponadto, współistniejące zakażenie bakteryjne częściej stwierdzono w grupie
chorych z perlakiem w porównaniu z grupą chorych bez
perlaka (93,8% vs 65,8%, p=0,003). Charakterystykę
grup badanych przedstawiono w tabeli I.
Badaniom poddano ziarninę usuwaną z jamy bębenkowej. Przeprowadzono analizę wybranych markerów apoptozy za pomocą oceny ekspresji w skrawkach
parafinowych metodą immunohistochemiczną antygenu apo-1/Fas i białka P53.
Ryc. 1. Komórki apo-1/Fas – pozytywne w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego. Pow. 400x.
Ryc. 2. Komórki P53 – pozytywne w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego. Pow. 400x.
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
Badania immunohistochemiczne
Skrawki parafinowe o grubości 4 mikrometrów nałożone na szkiełka Superfrost odparafinowano w szeregu
ksylenów i odwodniono w szeregu alkoholi. Następnie
skrawki płukano w dwóch zmianach wody destylowanej. W celu odzyskania antygenowości tkanek skrawki
gotowano w 0,01 M buforze cytrynianowym o pH 6,0
(DAKO, Target Retrieval Solution) w kuchence mikrofalowej przy następujących poziomach mocy 360 W (2
x 3 minuty), 180 W (2 x 5 minut), 90 W (2 x 5 minut).
Po wystudzeniu, skrawki płukano dwukrotnie w 0,05
M buforze TRIS (TBS, DAKO) o pH 7,6, przez 5 minut
i inkubowano przez 10 minut w 3% roztworze nadtlenku wodoru (H2O2) w celu zablokowania aktywności
endogennej peroksydazy. Następnie poddano je całonocnej inkubacji z właściwymi pierwotnymi przeciwciałami rozcieńczonymi w rozcieńczalniku zawierającym
komponent blokujący tło (DAKO; Antibody Diluent with
Background Reducing Components). Zastosowano
następujące przeciwciała: mysie antyludzkie przeciwciało monoklonalne apo-1/Fas (Monoclonal Mouse
Anti-Human CD-95, APO-1/Fas, DX2 DAKO, Glostrup,
Denmark, rozcieńczenie 1:25) oraz mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko ludzkiemu białku P53
(Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein, DAKO,
Glostrup, Denmark, rozcieńczenie 1:50).
Inkubację przeprowadzono w komorze wilgotnej
w temperaturze 4°C. Po inkubacji, skrawki dwukrotnie
płukano w buforze TBS, a następnie, aby uwidocznić
reakcje antygen-przeciwciało, stosowano system wizualizacyjny EnVision/HRP/DAB+ firmy DAKO Cytomation. Po 30-minutowej inkubacji skrawków z użyciem wtórnych przeciwciał znakowanych peroksydazą
149
150
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
chrzanową przeprowadzano reakcję enzymatyczną,
stosując substrat dla peroksydazy – tetrachlorek 3,3
diaminobenzydyny (DAB). Po zakończeniu reakcji immunohistochemicznej jądra komórkowe podbarwiano
hematoksyliną wg Meyera (2 min), a następnie odwadniano w szeregu alkoholi o rosnących stężeniach,
przeprowadzano przez szereg ksylenów i zaklejano DPX.
Kontrolę negatywną stanowiły skrawki, w których pierwotne przeciwciało zastąpiono buforem TBS, stosując
powyżej opisaną procedurę immunohistochemiczną.
Morfometria
Badania morfometryczne wykonano używając komputerowego systemu do analizy obrazu. W skład systemu
wchodził komputer PC wyposażony w kartę digitalizacji
obrazu firmy Indeo (Taiwan), współpracujący z kolorową kamerą telewizyjną firmy Panasonic sprzężoną
z mikroskopem badawczym Jenaval (Carl Zeiss Jena).
Jako element wskaźnikowy systemu posłużyła mysz
optyczna wchodząca w skład tabletu graficznego (Pentagram). System pracował pod kontrolą programu
MultiScan wersja 8.08 wyprodukowanego przez firmę
Computer Scanning Systems (Warszawa). Wykorzystano funkcję systemu służącą do zliczania obiektów
metodą półautomatyczną. Odsetek komórek apo-1/Fas+
i P53+ oceniano przez zliczenie 100 komórek w pięciu
polach ekranu monitora (0.029 mm2 każde), znacząc
kursorem myszy komórki immunopozytywne tak, że
w każdym przypadku analizowano 500 komórek.
Przykład ekspresji antygenu apo-1/Fas i białka P53
przedstawiono na ryc. 1 i 2.
Ponadto, u wszystkich chorych przed operacją pobrano wymaz z ucha na badania bakteriologiczne
w kierunku bakterii tlenowych i grzybów. Przeprowadzano także testy wykrywające fenotypy i mechanizmy oporności wyizolowanych drobnoustrojów (MRSA,
ESBL, HLAR, MLS B, MBL, VISA/VRSA).
Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą
testu t-Studenta i U Manna-Whitneya, korelacje wyników indywidualnych między ocenianymi markerami
określono współczynnikiem korelacji Pearsona. Za
wartość istotną statystycznie przyjęto p<0,05.
Wyniki
Stwierdzono istotne statystycznie różnice w średnich
wartościach antygenu apo-1/Fas między grupami chorych o dobrym i nawrotowym przebiegu klinicznym
przewlekłego zapalenia ucha środkowego (1,52 vs 3,34
odpowiednio, p<0,001) (tab. II).
Nie wykazano różnic w średnich wartościach antygenu apo-1/Fas między grupami chorych bez i z zakażeniem bakteryjnym (1,89 vs 2,72 odpowiednio,
p=0,19). Obserwowano istotnie wyższą średnią wartość
antygenu apo-1/Fas w grupie osób ze współistniejącym
zakażeniem bakteryjnym Pseudomonas aeruginosa/Pro-
teus sp./Staphyloccocus MRSA w porównaniu z grupą
chorych bez tego zakażenia (3,78 vs 1,75 odpowiednio,
p<0,001) (tab. II).
Różnice stwierdzono również dla białka P53 między
powyższymi grupami chorych, jednak były one nieistotne statystycznie (tab. III). Nie wykazano natomiast
istotnych różnic w ekspresji ocenianych markerów
apoptozy, zarówno antygenu apo-1/Fas, jak i białka
P53 między grupami chorych z ziarniną i z perlakiem
(tab. II i III).
Stwierdzono istotną ujemną korelację między nasileniem ekspresji antygenu apo-1/Fas a białka P53
w całej badanej grupie chorych (r= - 0,64, p<0,001).
Korelacje te są znamienne statystycznie we wszystkich analizowanych grupach, ale najwyższe wartości współczynnika korelacji obserwowano w grupie
R – o niekorzystnym przebiegu klinicznym choroby
(r= - 0,68, p<0,001), w grupie B z zakażeniem bakteryjnym (r= - 0,68, p<0,001), w grupie B1 – ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/Proteus
sp./Staphyloccocus MRSA (r= - 0,67, p<0,002) i w grupie
P – z perlakiem (r= - 0,65, p<0,001) (tab. IV).
Omówienie
W badaniach własnych oceniano nasilenie procesu
apoptozy w ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha
środkowego w zależności od przebiegu klinicznego
choroby, rodzaju współistniejącego zakażenia bakteryjnego i postaci p.z.u.śr. Do oceny wybrano markery
dwóch głównych szlaków apoptozy: antygen apo-1/Fas
i białko P53. Stwierdzono znamiennie wyższą ekspresję antygenu apo-1/Fas w grupie chorych o nawrotowym przebiegu klinicznym p.z.u.śr. oraz u chorych
z zakażeniem bakteryjnym trudnym do eradykacji
(Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp./Staphyloccocus
MRSA), natomiast nie wykazano różnic w zależności
od postaci choroby. Nie obserwowano również różnic istotnych statystycznie dla drugiego z ocenianych
markerów apoptozy, białka P53, w żadnej z badanych
grup. Stwierdzono wysoką ujemną korelację między
nasileniem antygenu apo-1/Fas i białka P53.
Rola apoptozy w patomechanizmie przewlekłego
zapalenia ucha środkowego nie została wyjaśniona.
Dotychczas znaczenie jej badano przede wszystkim
w perlaku, stosując różne metody oceny, co może
wpływać na rozbieżność wyników. Motamed i wsp.
[9] obserwowali małą ekspresję P53 w perlaku i nie
wykazali różnic między nim a skórą przewodu słuchowego zewnętrznego. Podobnie Bayazit i wsp. [4]
zanotowali niską aktywność P53 i nie obserwowali
różnic ze względu na lokalizację perlaka.
Odmiennie, Albino i wsp. [3] wykazali 9- do 20krotne zwiększenie aktywności białka P53 w perlaku,
ale nie zauważyli różnic w zależności od jego typu.
Huisman i wsp. [6] stwierdzili zwiększony odsetek Ki67,
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela II. Wartości nasilenia apoptozy oceniane na podstawie ekspresji antygenu apo-1/Fas (% komórek immunopozytywnych) w ziarninie w różnych grupach chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego
Apo-1/Fas (%)
Zakres (min-max)
Średnia ± SD
Cała grupa badana (n=54)
0,2–6,8
2,50 ± 2,05
Grupa N (n=25)
0,2–5,0
1,52 ± 1,46
Grupa R (n=29)
0,2–6,8
3,34 ± 2,12
Grupa B (n=40)
0,2–6,8
2,72±2,2
Grupa NB (n=14)
0,2–5,0
1,89±1,39
Grupa B1 (n=20)
0,2–6,8
3,78 ± 2,37
Grupa NB1 (n=34)
0,2–5,0
1,75± 1,39
Grupa Z (n=38)
0,2–6,8
2,43 ± 2,01
Grupa P (n=16)
0,2–6,6
2,68± 2,19
p
<0,001
0,19
<0,0002
0,69
Grupa N – przebieg kliniczny choroby pomyślny; grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny;
grupa B – ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym; grupa NB – bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego;
grupa B1 – ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA, grupa NB1 – bez współistniejącego
zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1;
grupa Z – zapalenie ziarninowe bez perlaka; grupa P - zapalenie z perlakiem.
Tabela III. Wartości nasilenia apoptozy oceniane na podstawie ekspresji białka P53 (% komórek immunopozytywnych) w ziarninie w różnych grupach chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego
Białko P53 (%)
Zakres (min-max)
Średnia ± SD
0,0 – 19,0
9,99 ± 4,89
Grupa N (n=25)
4,4–18,6
11,1 ± 3,91
Grupa R (n=29)
0,0–19,0
9,03 ± 5,49
Grupa B (n=40)
0,0–19,0
9,66 ± 5,02
Grupa NB (n=14)
4,4–17,4
10,94 ± 4,53
Grupa B1 (n=20)
0,0–19,0
8,34 ± 5,37
Grupa NB1 (n=34)
4,4–18,6
10,96 ± 4,38
Grupa Z (n=38)
2,0–17,4
9,75± 4,25
Grupa P (n=16)
0,0–19,0
10,55 ± 6,29
Cała grupa badana (n=54)
P
0,12
0,40
0,057
0,59
Grupa N – przebieg kliniczny choroby pomyślny; grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny;
grupa B – ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym; grupa NB – bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego;
grupa B1 – ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA, grupa NB1 – bez współistniejącego
zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1;
grupa Z – zapalenie ziarninowe bez perlaka; grupa P - zapalenie z perlakiem.
P21 i P53 pozytywnych komórek w nabłonku perlaka,
natomiast ekspresja innych markerów apoptozy (oceniana na podstawie aktywności kaspazy-3 i fragmentacji DNA metodą TUNEL) była minimalna. Inni autorzy
obserwowali nasilenie apoptozy w perlaku sugerując,
że proces ten miałby doprowadzić do nagromadzenia
debris keratyny i wzrostu perlaka [7, 10–12].
Miyao i wsp. [24] stwierdzili w warstwach perlaka rozmieszczenie kaspaz 8 i 3, które biorą udział
w mechanizmie apoptozy indukowanej przez receptory
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
śmierci, natomiast nie obserwowali aktywności transkrypcyjnego czynnika jądrowego NF-κB, będącego
inhibitorem apoptozy. Z kolei Sheikoleshlam i wsp.
[25] wykazali dodatnią korelację między apoptozą
a poziomem galektyny-3, mającej działanie antyapoptotyczne, co autorzy interpretują jako mechanizm
obronny przeciwko nadmiernej apoptozie. Zwiększoną
apoptozę obserwowano w perlaku w porównaniu z rakiem płaskonabłonkowym ucha sugerując, że ma ona
równoważyć nadmierną proliferację [13, 26]. Choufani
151
152
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela IV. Wartości współczynnika korelacji Pearsona r między ekspresją antygenu apo-1/Fas i białka P53 w ziarninie
w różnych grupach chorych z przewlekłym zapaleniem ucha środkowego
Apo-1/Fas a P53
Wartość współczynnika korelacji r
p
Cała grupa badana
- 0,64
< 0,001
Grupa N
- 0,50
< 0,05
Grupa R
- 0,68
< 0,001
Grupa B
- 0,68
< 0,001
Grupa NB
- 0,44
0,113
Grupa B1
- 0,67
< 0,002
Grupa NB1
- 0,56
< 0,001
Grupa Z
- 0,65
< 0,001
Grupa P
- 0,67
< 0,005
Grupa N – przebieg kliniczny choroby pomyślny; grupa R - przebieg kliniczny niekorzystny;
grupa B – ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym; grupa NB – bez współistniejącego zakażenia bakteryjnego;
grupa B1 – ze współistniejącym zakażeniem Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA, grupa NB1 – bez współistniejącego
zakażenia bakteryjnego lub z zakażeniem bakteryjnym innym niż w grupie B1;
grupa Z – zapalenie ziarninowe bez perlaka; grupa P - zapalenie z perlakiem.
i wsp. [5] wykazali, że nawrotowe perlaki mają wysoki
indeks apoptozy, inny sposób rozmieszczenia komórek
apoptotycznych i niską ekspresję kalcykliny, natomiast
wartości markera proliferacyjnego – antygenu Ki-67
i białka P53 nie odgrywają istotnej roli w procesach
wznowy perlaka. Podobnie w badaniach własnych
stwierdzono w p.z.u.śr. o niekorzystnym przebiegu
klinicznym wyższą apoptozę indukowaną przez układ
Fas/FasL, natomiast różnic tych nie wykazano dla
białka P53.
Interesujące są doniesienia Rivkina i wsp. [27],
którzy przeprowadzali badania doświadczalne nad
przebiegiem zapalenia ucha środkowego indukowanego
podaniem endotoksyny bakteryjnej Salmonella typhi
u kilku szczepów myszy, w tym u szczepu z mutacją
genu dla Fas – MRL-lpr/lpr, u którego rozwijają się zaburzenia układu immunologicznego i jest podatny na
rozwój tocznia układowego [21]. Autorzy stwierdzili, że
reakcja zapalna błony śluzowej była bardziej nasilona
i trwała dłużej u szczepu myszy pozbawionego antygenu Fas niż u pozostałych szczepów [27]. Ponadto,
w innych badaniach doświadczalnych stwierdzili oni
zwiększoną ekspresję antygenu Fas i liganda FasL
w błonie śluzowej ucha u szczurów, u których rozwinęło się zapalenie ucha środkowego po wszczepieniu
Haemophilus influenzae [27]. W naszych badaniach
również obserwowano większą aktywność apo-1/Fas
u chorych z zakażeniem bakteryjnym wywołanym
przez Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp./Staphyloccocus MRSA.
Badania własne mogą wskazywać na rolę mechanizmu apoptozy indukowanego przede wszystkim szlakiem apo-1/Fas w p.z.u.śr. nawrotowym i bakteryjnym,
natomiast mniejsze znaczenie szlaku zależnego od
białka P53.
Wnioski
W ziarninie w przewlekłym zapaleniu ucha środkowego
stwierdzono różną ekspresję antygenu apo-1/Fas w zależności od przebiegu klinicznego choroby i obecności
zakażenia bakteryjnego spowodowanego przez Pseudomonas aeruginosa/Proteus sp/Staphyloccocus MRSA.
PIŚMIENNICTWO
1.
Panda NK, Sreedharan S, Mann SB, Sharma SC. Prognostic factors in complicated and uncomplicated chronic otitis media. Am J Otolaryngol. 1996; 17: 391-396.
2.
Da Costa SS, Paparella MM, Schachern PA, Yoon TH, Kimberley BP. Temporal bone histopathology in chronically
infected ears with intact and perforated tympanic membranes. Laryngoscope 1992;102: 1229-1236.
3.
Albino AP, Reed JA, Bogdany JK, Sassoon J, Desloge RB,
Parisier SC. Expression of p53 protein in human middle
ear cholesteatomas: pathogenetic implications. Am J Otol.
1998;19: 30-36.
4.
Bayazit YA, Bakir K, Kanlikama M, Ozer E, Mumbuc S,
Disikirik I, Ucak R. Expression of the p53 and nm23 genes
in cholesteatoma. Acta Otolaryngol.(Stockh.) 2002;122:
726-729.
5.
Choufani G, Mahillon V, Decaestecker C, Lequeux T, Danguy A, Salmon I, Gabius H-J, Hassid S, Kiss R. Determination of the levels of expression of sarcolectin and calcyclin
and of the percentages of apoptotic but not proliferating
cells to enable distinction between recurrent and nonrecurrent cholesteatomas. Laryngoscope 1999;109: 1825-1831.
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
6.
Huisman MA, De Heer E, Grote JJ. Cholesteatoma
gratory apoptozy. Post Biol Kom. 2006; 33: 525-541.
of Ki-67, p53 and p21, with minimal apoptosis. Acta
17. Stępień A, Izdebska M, Grzanka A. Rodzaje śmierci komór-
Otolaryngol.(Stockh.) 2003;123: 377-382.
7.
18. HehlgansT, Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour
Kamide Y, Moriyama H. Cell proliferation and apoptosis
necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfa-
in human middle ear cholesteatoma. Arch. Otolaryngol.
mily: players, rules and the games. Immunology. 2005;
Kuczkowski J, Pawelczyk T, Bąkowska A, Narożny W,
115: 1–20.
19. Ashkenazi A, Dixit VM. Apoptosis control by death and
Mikaszewski B. Expression patterns of Ki-67 and telome-
decoy receptors. Curr Opin Cell Biol. 1999;11: 255-60.
rase activity in middle ear cholesteatoma Otol Neurotol
20. Nagata S, Goldstein P. The Fas death factor. Science 1995;
2007;28: 204-207.
9.
ki. Post Hig Med Dośw. online, 2007; 61: 420-428.
Kojima H, Tanaka Y, Tanaka T, Miyazaki H, Shiwa M,
Head Neck Surg. 1998;124: 261-264.
8.
16. Czarnecka AM, Golik P, Bartnik E. Mitochondria jako inte-
epithelium is characterized by increased expression
Motamed M, Powe D, Kendall C, Birchall JP, Banerjee
267: 1449-1456.
21. Droździk M, Białecka M. Kliniczne znaczenie układu Fas/
AR. p53 Expression and keratinocyte hyperproliferation
ligand Fas. Pol Arch Med Wewn. 1999; 101: 337-343.
in middle ear cholesteatoma. Clin Otolaryngol Allied Sci.
22. Yu J, Zhang L. The transcriptional targets of p53 in apop-
2002;27: 505-508.
10. Olszewska E, Chodynicki S, Chyczewski L. Apoptosis in
the pathogenesis of cholesteatoma in adults. Eur Arch
Otorhinolaryngol. 2006;263: 409-413.
11. Park HJ, Park K. Expression of Fas/APO-1 and apoptosis
of keratinocytes in human cholesteatoma. Laryngoscope.
1999;109: 613-616.
12. Shinoda H, Huang CC. Expression of c-jun and p53 pro-
tosis control. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 331:
851-858.
23. Li H, Zhu H, Xu CJ, Yuan J. Cleavage of BID by caspase 8
mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of
apoptosis. Cell, 1998; 94: 491-501.
24. Miyao M, Shinoda H, Takahashi S. Caspase-3, caspase-8,
and nuclear factor-kappaB expression in human cholesteatoma. Otol Neurotol. 2006;27: 8-13.
teins in human middle ear cholesteatoma: relationship to
25. Sheikholeslam – Zadeh R, Decaestecker C, Delbrouck C,
keratinocyte proliferation, differentiation, and program-
Danguy A, Salmon I, Zick Y i wsp. The levels of expression
med cell death. Laryngoscope 1995;105: 1232-1237.
of galectin-3, but not of galectin-1 and galectin-8, correla-
13. Watabe-Rudolph M, Rudolph KL, Averbeck T, Buhr T, Le-
te with apoptosis in human cholesteatomas. Laryngoscope
narz T, Stöver T. Telomerase activity, telomere length, and
2001;111(6):1042-1047.
apoptosis: a comparison between acquired cholesteatoma
26. Ergün S, Carlsöö B, Zheng X. Apoptosis in meatal skin,
and squamous cell carcinoma. Otol Neurotol. 2002;23:
cholesteatoma and squamous cell carcinoma of the ear.
793-798.
Clin Otolaryngol Allied Sci. 1999;24: 280-285.
14. Drewa T, Olszewska O, Wożniak A. Znaczenie zaprogra-
27. Rivkin AZ, Palacios SD, Pak K, Bennett T, Ryan AF.
mowanej śmierci komórki w patogenezie chorób człowieka.
The role of Fas-mediated apoptosis in otitis media: ob-
Pol Merk Lek. 2002, 70: 336-341.
servations in the lpr/lpr mouse. Hear Res. 2005; 207:
15. Adams MJ. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. Genes Dev. 2003; 17: 2481-2495.
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
110-116.
153
Download