Konstrukcja wektora plazmidowego DNA do klonowania genów i/lub

Konstrukcja wektora plazmidowego
DNA do klonowania genów
i/lub wektora plazmidowego
do sekrecji w bakteriach
mlekowych
Łukasz Tranda
Promotor: doc. dr hab. Jacek Bardowski, IBB
Promotor: dr hab. Edward Darżynkiewicz, prof. nadzw. UW
Co to jest plazmid?
Charakteryzacja bakterii fermentacji mlekowej.
Dlaczego warto skonstruować własny wektor?
Jak wygląda wektror plazmidowy?
Co to jest plazmid?
Plazmidy są to autonomiczne, pozachromosalne elementy
genetyczne występujące u wielu organizmów prokariotycznych
i niektórych eukariotów. Charakterystyczną ich cechą jest:
fizyczna odrębność od chromosomu, zdolność do trwałego
utrzymywania i replikowania się w komórce.
Plazmid nie koduje funkcji, które byłyby konieczne do jej życia.
Zwiększa natomiast różnorodność zajmowanych środowisk.
Ilość genów zgromadzonych w plazmidach odgrywa znaczącą
rolę w ewolucji i zdolności adaptacyjnych komórek, w których
się znajdują.
Struktura przestrzenna plazmidu:
Cząsteczki są zazwyczaj kowalencyjnie zamknięte,
koliste i superzwinięte. U pewnych bakterii i drożdży
stwierdzono również plazmidy liniowe.
Wielkość:
plazmid
2-100 kb
i większe
chromosom
1,8 – 2,5 Mb
Replikacja plazmidów:
Replikacja plazmidu odbywa się niezależnie
od replikacji chromosomu komórki. Uznaje się je
za pasożyty wewnątrzkomórkowe, które nadają komórce
korzystny, w specyficznych warunkach, fenotyp.
Replikację możemy podzielić na:
Horyzontalną czyli poziomą;
Wertykalną czyli pionową;
Replikacja Pionowa:
dotyczy przekazania genów w obrębie tego samego gatunku:
Małe cząsteczki korzystają z systemu replikacyjnego gospodarza
i jedynie potrzebują fragmentu zawierającego geny replikacji (rep).
Jest to miejsce przyłączania się polimerazy DNA i wszystkich
elementów potrzebnych do replikacji. Podczas podziału komórki małe
fragmenty są rozdzielane losowo wraz z podziałem cytoplazmy.
Duże plazmidy, mogą nieść geny, kodujące potrzebne składniki
do replikacji. Podczas podziału komórki, po wcześniejszym powieleniu
się plazmidów, są one rozdzielane jak chromosom, dzięki powiązaniu s
z błoną poprzez mechanizm segregacji.
Istnieją również plazmidy mogące integrować do chromosomu
bakterii i ich replikacja zachodzi podczas powielania chromosomu.
Replikacja Pozioma:
dotyczy przekazania genów pomiędzy różnymi gatunkami:
Koniugacja to mechanizm przenoszenia marteriału
genetycznego z komórki do komórki, z udziłem plazmidu.
Komórka zwierająca plazmid koniugacyjny (F+, płodna)
tworzy pary koniugacyjne z komórkami nie zawierającymi
takiego plazmidu (F-, niepłodna). Wytwarzając pilus, mostek
łączący dwie komórki, który kurczy się powodując zbliżenie się
koniugujących komórek. Dzięki takiemu połączeniu
przenoszony jest DNA od dawcy F+ do biorcy F-. Geny
tra niesione przez plazmid F zawierają pełną informację
dotyczącą procesu koniugacji.
Transfer genów bakteryjnych z jednej komórki do drugiej przez
pakowanie ich w DNA faga. Tego typu przekaz genów nazywamy
transdukcją.
Komórki mogą pobierać nowe geny przez pobranie nagiego
DNA z otaczającego podłoża. Ten proces nazywamy transformacją.
Zdolność komórki do pobrania DNA zależy od jej szczególnego stanu
który nazywamy kompetencją.
Przykładem jest elektroporacja, która jest sztucznym procesem
wstrzelanie plazmidu do komórki. Swobodne plazmidy wraz
z komórkami mającymi przyjąć DNA umieszczamy w impulsie
pola elektrycznego. W wyniku przepływu prądu powstają dziury
w ścianie komórkowej i plazmid wnika do komórki.
Krótka charakterystyka bakterii fermentacji mlekowej:
gram dodatnie;
fermentacja cukrów do kwasu mlekowego;
obniżaanie pH środowiska do wartości 4,5-3,5;
optymalna temperatura wynosi 30st C lub 37-45st C;
Posiadanie statusu GRAS;
czas generacji wynosi od 30 do 60 minut;
Fakultatywne życie beztlenowe;
wykorzystywanie w parafarmacji;
ważne w biotechnologii, stosowane w przemyśle rolno-spożywczym;
komórki mogą być pałeczkowate lub ziarniaki;
zapobiegają niektórym schorzenią (np. alergia);
Lactobacillus delbrueckii
Streptococcus thermophilus
Lactococcus lactis
Lactobacillus casei
Bifidobacterium longum
Leuconostoc mesenteroides
Wykorzystanie bakterii mlekowych
jako model badawczy i aplikacyjny:
Konstrukcja wektorów szczepionkowych w bakteriach
jako adiowanty.
Odgrywają one rolę w immunostymulacji układu
odpornościowego;
Jako GMO (genetycznie modyfikowane) produkują antygen
i stymulują odporność;
Jako probiotyki w hodowli zwierząt, którym
nie będzie można aplikować antybiotyków;
Zastosowanie probiotyków jest obecnie bardzo ograniczone ;
Biotechnologia w produkcji rolno-spożywczej;
Dlaczego warto się zająć konstrukcją
własnych wektorów plazmidowych?
Dokonywanie zmian w bakteriach to pewne narzędzie do celów
badawczych, ale również aplikacyjnych. W późniejszym okresie
korzystanie z tych plazmidów jest bezproblemowe.
Posiadając własny obiekt badawczy znika kwestia patentu.
Plazmidy bakteryjne na bazie, których będziemy
konstruować wektory będą pochodzić z własnej kolekcji
IBB lub zostaną wizolowane ze szczepów naturlnych, na które
nikt nie posiada patentu.
Typy genów obecnych w plazmidach:
Pierwsze są niezbędne do funkcjonowania jako niezależny
replikon, występujący na wszystkich plazmidach. Są to geny
niezbędne do replikacji i utrzymania plazmidu w komórce
nazywane genami rep.
Plazmidy zawierające tylko pierwszy typ genów nie będą
wyróżniały komórek bakteryjnych, które nazwano kryptycznymi.
Ta sama nazwa odnosi się do plazmidów, których funkcji
jeszcze nie znamy.
Drugim typem są geny, stanowiące dodatkowe wyposażenie w
plazmidzie. Odpowiadają one za różnorodność fenotypów
kodowanych przez plazmidy:
Przetwarzanie substancji organicznych
Odporność na wysoką temperaturę;
Oporność na antybiotyki;
Oporność na jony metali ciężkich;
Produkcja bakteriocyn;
Pozwalające żyć w nietypowym pH środowiska;
Biodegradacja toksycznych związków organicznych;
Cechy związane z patogennością bakterii wobec człowieka i zwierząt;
Interakcje bakterii z komórkami roślinnymi;
Efekt ochrony przed UV; itp.
Podstawowe geny, jakie powinien posiadać
plazmid do klonowania:
MCS
Geny rep, który powinien
posiadać każdy plazmid
Gen oporności na antybiotyk,
aby można było identyfikować
bakterie zawierające ten plazmid,
np. tet.
Miejsce, gdzie będzie wstawiany gen,
który ma zostać sklonowany.
Geny tra odpowiedzialne za proces koniugacji.
tra
rep
Geny, jakie powinien posiadać
wektor plazmidowy do sekrecji:
Geny rep, który powinien
posiadać każdy plazmid
Gen oporności na antybiotyk, np. tet.
aby można było
identyfikować bakterie
zawierające ten plazmid
Miejsce, gdzie będzie wstawiany gen,
który koduje białko przeznaczone
do sekrecji
Gen kodujący białko odpowiedzialne
za sekrecję
Geny tra odpowiedzialne za proces koniugacji
MCS
Sekrecja
tra
rep
Wektor do klonowania DNA w bakteriach mlekowych
Dziękuje za uwagę