TDP-43, wielofunkcyjne białko regulujące metabolizm RNA, jako patologiczny czynnik chorób neurozwyrodnieniowych FTLD i ALS STRESZCZENIE T DP-43 jest białkiem zlokalizowanym głównie w jądrze komórkowym, należącym do rodziny heterogennych rybonukleoprotein, zaangażowanym w szereg procesów związanych z regulacją transkrypcji i obróbką RNA. W 2006 roku zostało ono scharakteryzowane jako główna składowa toksycznych agregatów w przypadkach otępienia czołowo-skroniowego (FTLD) i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Od tamtego czasu potwierdzono jego centralną rolę w szeregu chorób neurozwyrodnieniowych i utworzono nowy termin służący ich klasyfikacji — proteinopatie związane z TDP-43. W stanach patologicznych zaburzeniu ulega dystrybucja komórkowa białka i akumuluje się ono w cytoplazmie w postaci ubikwitylowanych inkluzji. Do dnia dzisiejszego powstały liczne modele zwierzęce rekapitulujące objawy demencji oraz degeneracji neuronów ruchowych. Nadal jednak nie został wyjaśniony mechanizm prowadzący poprzez deregulację TDP-43 do śmierci komórek. Proponowane hipotezy, zakładające utratę jak i nabycie przez TDP-43 nowych funkcji, wymagają weryfikacji. WPROWADZENIE Choroby neurozwyrodnieniowe to grupa schorzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN), u podłoża których leży postępujący proces degeneracji komórek nerwowych. Spadek liczby oraz nieprawidłowości w funkcjonowaniu neuronów skutkują m.in. wystąpieniem objawów zaburzeń: pamięci, poznawczych czy ruchowych. Jednym z najpowszechniejszych i najlepiej poznanych schorzeń OUN jest otępienie. Termin określa szereg chorób charakteryzujących się nasilającym się pogarszaniem szeroko rozumianych zdolności intelektualnych, związanych z atrofią określonych rejonów mózgu. Zwyrodnienie komórek nerwowych najczęściej nie ogranicza się do jednego obszaru i bardzo powszechnym jest zjawisko współwystępowania objawów wskazujących na uszkodzenia różnych struktur OUN. Dlatego też często u pacjentów ze zdiagnozowaną demencją obserwuje się również zaburzenia funkcji motorycznych. Jako przyczyny występowania chorób neurozwyrodnieniowych wymienia się m.in. urazy, czynniki środowiskowe i uwarunkowania genetyczne. Wspólną cechą charakterystyczną wielu schorzeń OUN jest agregacja w komórkach nieprawidłowych form białek i właśnie ze względu na tę właściwość, są one powszechnie określane jako proteinopatie. Dalsze grupowanie terminologii zależne jest od nazwy głównego białka ulegającego w danym schorzeniu patologii. Zdefiniowanie rodzaju i lokalizacji mutacji w genomie pozwala na jej skorelowanie z objawami klinicznymi i ułatwia, a czasem umożliwia postawienie właściwej diagnozy. Częste są jednak przypadki, kiedy nieprawidłowości w budowie jednego białka prowadzą do różnych jednostek chorobowych oraz przeciwnie, gdy zbieżne bądź takie same objawy kliniczne są wynikiem różnych mutacji genetycznych. Paulina Koza* Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego Polskiej Akademii Nauk, Warszawa Pracownia Neurobiologii, Zakład Neurobiologii Molekularnej i Komórkowej, Instytut Biologii Doświadczalnej im. Marcelego Nenckiego, ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa; tel.: (22) 589 23 39, e-mail: [email protected]. pl * Artykuł otrzymano 23 lutego 2015 r. Artykuł zaakceptowano 7 maja 2015 r. Słowa kluczowe: agregaty białkowe, otępienie czołowo-skroniowe, proteinopatie, stwardnienie zanikowe boczne, TDP-43 Wykaz skrótów: ALS (ang. amyotrophic lateral sclerosis) — stwardnienie zanikowe boczne; CTFs (ang. C-terminal fragments) — C-końcowe fragmenty; fALS (ang. familial ALS) — rodzinny wariant ALS; FTLD (ang. frontotemporal lobar degeneration) — otępienie czołowo-skroniowe; FUS (ang. fused-in-sarcoma) — jądrowe białko wiążące RNA/DNA; GRR (ang. glycine rich region) — region bogaty w reszty glicynowe; hnRNPs (ang. heterogeneous ribonucleoproteins) — heterogenne rybonukleoproteiny; MND (ang. motor neuron disease) — choroba neuronu ruchowego; NES (ang. nuclear export signal) — sygnał eksportu z jądra; NLS (ang. nuclear localization signal) — sygnał lokalizacji jądrowej; OUN — ośrodkowy układ nerwowy; RRM (ang. RNA recognition motifs) — motywy rozpoznające RNA; sALS (ang. sporadic ALS) — sporadyczny wariant ALS; TDP-43 (ang. TAR DNA binding protein 43 kDa) — rybonukleoproteina; UTR (ang. untranslated region) — region nie ulegający translacji Do 2006 roku większość przypadków otępienia czołowo-skroniowego (FTLD, ang. frontotemporal lobar degeneration) i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS, ang. amyotrophic lateral sclerosis) nie mogło być zakwalifikowanych do żadnego z istniejących wówczas typów proteinopatii. I chociaż FTLD, jedno z najczęstszych form demencji, i ALS, traktowane jako schorzenie wyłącznie motoneuronów, rozpoznawane były jako odrębne jednostki chorobowe. U licznej grupy pacjentów obserwowano zazębianie się objawów. Od dawna podejrzewano więc, że u podłoża obu chorób może leżeć wspólny patologiczny mechanizm. Potwierdziło to dopiero odkrycie przez Neumann i wsp. [1] białka TDP-43 (ang. TAR DNA binding protein), jako głównej składowej wewnątrzkomórkowych wtrętów obserwowanych zarówno w przypadkach FTLD, jak i ALS. Kolejne lata przyniosły dowody na zaangażowanie TDP-43 w szereg innych procesów neurozwyrodnieniowych, co doprowadziło do utworzenia nowego terminu — proteinopatie związane z TDP-43. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 159 FTLD I ALS JAKO GŁÓWNE PROTEINOPATIE ZWIĄZANE Z BIAŁKIEM TDP-43 Otępienie czołowo-skroniowe to termin określający heterogenną, pod względem klinicznym i genetycznym, grupę chorób neurozwyrodnieniowych, którego nazwa odnosi się do postępującej atrofii płata czołowego i skroniowego. Jest jedną z najczęstszych postaci demencji, ujawniającą się przed 65 rokiem życia. Pod względem częstości występowania umiejscawiane jest na drugim miejscu, tuż po chorobie Alzheimera [2]. Aktualne kryteria dzielą FTLD na dwa zespoły kliniczne: 1. demencję czołowo-skroniową, określaną jako wariant behawioralny, postać najczęstszą, szacowaną na ponad 50% przypadków, charakteryzującą się zmianami osobowości i zachowania; 2. afazję pierwotną postępującą, która wyróżnia dwa podtypy wpisujące się w spektrum FTLD: postępującą afazję bez płynności mowy, objawiającą się popełnianiem błędów językowych oraz demencję semantyczną, polegającą na zaburzeniach pamięci semantycznej, odpowiedzialnej za nadawanie słowom funkcji znaczeniowych [3,4]. Statystyki szacują zachorowalność na 3,6–15,0 przypadków na 100 000 osób na rok [5]. Rodzinny wariant FTLD opisuje się u 10-23% pacjentów. Charakteryzuje się on dominującym autosomalnym wzorem dziedziczenia [2,4]. Pozostałe przypadki traktowane są jako sporadyczne. Zidentyfikowano do tej pory pięć genów, których mutacje prowadzą do rozwoju patologii FTLD. Są to: C9orf72 (ang. chromosome 9 open reading frame 72), GRN (ang. progranulin), MAPT (ang. microtubule associated protein tau), VCP (ang. valosin-containig protein) oraz CHMP2B (ang. charged multivesicular body protein 2B/chromatin-modifying protein 2B). Dane dotyczące częstości takich mutacji są rozbieżne. Za najpowszechniejsze uznaje się te w obrębie genów C9orf7, GRN oraz MAPT i sumaryczna częstotliwość ich występowania waha się w zależności od źródła i wynosi 17–40%. Mutacje VCP i CHMP2B są dość rzadkie i stanowią 1% przypadków [4]. Mutacja w obrębie konkretnego genu jest traktowana jako czynnik inicjujący wystąpienie określonej wady, zwykle skorelowanej z nieprawidłowo funkcjonującym białkiem, które zmutowany gen koduje. Nie jest to jednak regułą i nie ma zastosowania dla m.in. FTLD. Do dnia dzisiejszego zidentyfikowano bowiem trzy białka, które tworzą charakterystyczne patologiczne inkluzje w przypadkach FTLD i tylko jedno z nich jest produktem genu wymienionego wyżej. Są to: tau, FUS (ang. fused-in-sarcoma) oraz TDP-43. To ich obecność w obrazie histochemicznym warunkuje zakwalifikowanie do określonego typu proteinopatii. Proteinopatie FTLD-tau grupują około 40% wszystkich przypadków, w których w komórkach OUN odkładają się agregaty białka tau [2]. Znaczna większość, choć nie wszystkie, powstają jako efekt mutacji w genie MAPT. Do momentu scharakteryzowania białek FUS i TDP-43, pozostałe przypadki FTLD były zaliczane do jednej grupy — FTLD-U (otępienie czołowo-skroniowe z agregatami ubikwityny). Wariant ten ze względu na charakter zmian opisywany był jako: tau — ujemny, ubikwityna — dodatni [6]. 5–10% przypadków tej grupy stanowią wspólnie dwa podtypy: FTLD-FUS, z białkiem FUS jako główną komponentą patologicz- 160 ną i dalej nie scharakteryzowane FTLD-UPS (od ang. ubiquitin proteasome system) [2,4]. Najpowszechniejszą składową ubikwitylowanych wtrętów okazało się być białko TDP-43. Neuropatologia TDP-43 obecna jest w około połowie przypadków FTLD. Do tej pory scharakteryzowano kilkadziesiąt mutacji w obrębie genu TARDBP. Są one jednak wyjątkowo rzadkie w czystej postaci FTLD i opisano jedynie kilka, które wydają się nie angażować patologii motoneuronu [7,8]. Mutacje w genie kodującym TDP-43 są bowiem ściśle korelowane z drugim schorzeniem zaliczanym do proteinopatii TDP-43 — stwardnieniem zanikowym-bocznym. Choroba neuronu ruchowego (MND, ang. motor neuron disease) to termin określający grupę schorzeń neurozwyrodnieniowych atakujących górny i/lub dolny neuron ruchowy. Najczęstszym fenotypem klinicznym MND jest ALS, często określane również jako choroba Charcota (od nazwiska odkrywcy Jean-Martin’a Charcota) czy choroba Lou Gehriga (od nazwiska sławnego amerykańskiego sportowca, który zmarł w wyniku ALS w wieku zaledwie 36 lat). Obserwowany spadek liczby neuronów ruchowych rogów przednich rdzenia kręgowego, jąder motorycznych w pniu mózgu i kory motorycznej, przekłada się na kliniczny obraz postępującego osłabienia mięśni. ALS prowadzi zwykle do śmierci pacjenta w kilka lat od momentu wystąpienia pierwszych objawów [9]. Postawienie diagnozy jest skomplikowane i często polega na wykluczeniu innych możliwych przyczyn uszkodzenia komórek nerwowych i obserwacji postępującego charakteru choroby [10]. Średnia zachorowalność szacowana jest na 2,1 przypadki na 100 000 osób na rok. ALS dotyka ludzi w różnym wieku. Statystycznie około 13% pacjentów rozwija objawy przed 40 rokiem życia, 26% w wieku 50–59 lat, a 27% w wieku 60–69 lat [11]. Niektóre doniesienia traktują podział ALS na wariant rodzinny (fALS, ang. familial ALS) i sporadyczny (sALS, ang. sporadic ALS) jako sztuczny, służący jedynie klasyfikacji różnych postaci choroby. Często bowiem mutacje identyfikowane pierwotnie jako typowe dla fALS, są następnie opisywane u pacjentów sALS bez popartej rodzinnej postaci choroby (np. z powodu niskiej penetracji mutacji) [12]. Ogólnie przyjmuje się jednak, że fALS stanowi średnio 10% wszystkich przypadków. Najczęstszym jest dominujący autosomalny typ dziedziczenia [13]. Pozostałe 90% wydaje się mieć charakter sporadyczny. Mutacje w około 20 genach są korelowane z objawami ALS. Udział większości z nich w procesach patologicznych wymaga dalszych badań, gdyż zostały zidentyfikowane jedynie w nielicznych przypadkach. Ścisła korelacja mutacji z wystąpieniem objawów choroby neuronu ruchowego i obecnością nieprawidłowych form białek, została potwierdzona tylko dla kilku genów. Należą do nich m.in. SOD1 (ang. Cu2+/Zn2+ superoxide dismutase), TARDBP i FUS [12]. Podobnie do opisanego wyżej FTLD, w części przypadków ALS obserwuje się patologię związaną z białkiem o prawidłowej sekwencji aminokwasów, niezależnie od typu i lokalizacji, czy obecności mutacji w genomie. Pierwszym scharakteryzowanym genem, którego zmutowane warianty odpowiadają za 20% przypadków fALS www.postepybiochemii.pl był SOD1 [14]. Koduje on dysmutazę ponadtlenkową, enzym zwalczający wolne rodniki i chroniący neurony przed stresem oksydacyjnym. Opisano jak dotąd ponad sto mutacji, z których wszystkie oprócz jednej, wywołują dziedziczną postać choroby [15]. Ze względu na pełnioną przez SOD1 funkcję, postulowano ekscytotoksyczność, dysfunkcję mitochondriów czy nadmierny stres oksydacyjny, jako możliwe przyczyny procesu patologicznego. I mimo, że pierwsze mutacje genu SOD1 zidentyfikowano w 1993 roku, nadal nie jest znany mechanizm, według którego enzym z tak niebywałą precyzją selektywnie niszczy motoneurony [12]. Patologia związana z SOD1, chociaż dość powszechna, nie jest diagnozowana u większości chorych z ALS. U 4% pacjentów fALS, co stanowi 0,4% wszystkich zachorowań, schorzenie jest wynikiem mutacji genu FUS [16]. FUS, białko zaangażowane m.in. w regulację transkrypcji, wiąże elementy struktury i funkcji z TDP-43, które jest aktualnie uznawane za jedną z najpowszechniejszych komponent patologicznych, występujących w przypadkach ALS [17]. Odkrycie w 2006 roku korelacji białka TDP-43 z procesami neurozwyrodnieniowymi OUN [1] umożliwiło zidentyfikowanie składu agregatów białkowych występujących w neuronach ruchowych i gleju u licznej grupy pacjentów z niescharakteryzowanym uprzednio, SOD1 ujemnym, typem ALS. Szacuje się, że patologia związana z TDP-43 jest obecna w blisko 90% przypadków sALS [18]. Ich obraz immunohistochemiczny określany jest poprzez obecność cytoplazmatycznych i jądrowych depozytów, zawierających skrócone, nieprawidłowo pofałdowane, nadmiernie fosforylowane i ubikwitynylowane warianty białka. Do dnia dzisiejszego opisano ponad 40 różnych mutacji w genie TARDBP [12] i wszystkie przekładają się na tendencję TDP-43 do tworzenia patologicznych agregatów. Proces ten jest obserwowany jednak również jako efekt mutacji innych genów, spośród których coraz częściej wymieniany jest C9orf72 [18]. Neuropatologicznie, ALS-TDP-43 manifestowane jest spadkiem liczby neuronów, glejozą i obecnością ciałek Buniny (typowych dla ALS inkluzji, zawierających cystatynę C i transferynę) w rogach przednich rdzenia kręgowego i drodze korowo-rdzeniowej [12]. ALS traktowane jest jako schorzenie atakujące wybiórczo układ piramidalny. Jednak liczna grupa chorych, według niektórych statystyk aż 50%, oprócz postępującej degeneracji górnego i dolnego neuronu ruchowego, rozwija dodatkowo zaburzenia kognitywne i behawioralne, z czego 20% diagnozowane jest jako FTLD [19,20]. Wystąpienie objawów demencji u pacjentów ze zdiagnozowanym schorzeniem neuronu ruchowego, znacznie przyspiesza pogarszanie się stanu zdrowia i zaostrza obraz choroby [18]. Częsta jest również sytuacja odwrotna, kiedy zaburzenia typu otępiennego wyprzedzają rozwój patologii ALS [21]. Chociaż od dawna podejrzewano, że obie choroby mogą stanowić różne manifestacje tego samego patologicznego mechanizmu, dopiero scharakteryzowanie dystrybucji TDP-43 w OUN potwierdziło istnienie pomiędzy nimi związku molekularnego. Symptomy charakterystyczne dla FTLD przekładają się na obecność TDP-43 — immunopozytywnych agregatów w substancji czarnej, zakręcie zębatym formacji hipokampa, ciele migdałowatym, zakręcie obręczy oraz korze czołowej i skroniowej [20]. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 TDP-43 okazało się być dominującym białkiem patologicznym w znacznym odsetku przypadków FTLD i ALS. Z tego względu obie choroby są kwalifikowane jako główne proteinopatie związane z TDP-43. Do tej grupy, jako przykłady schorzeń, w których akumulacja nieprawidłowych form TDP-43 jest traktowana jako cecha drugorzędowa, zaliczane są również m.in. choroba Alzheimera, Parkinsona czy Huntingtona [22]. Mimo napływających kolejnych dowodów potwierdzających udział TDP-43 w degeneracji komórek nerwowych, nadal nie znany jest mechanizm kierujący tym procesem. Tym trudniejsze wydaje się badanie udziału białka w patologii, gdy nie jest jasna również jego funkcja fizjologiczna. Główna trudność w ustaleniu fizjologicznej roli TDP-43 w komórce oraz jego bezpośredniego związku z degeneracją neuronów, wynika z licznych i różnorodnych procesów, w które jest ono zaangażowane, i które tym samym mogą ulec zaburzeniu. TDP-43 zostało po raz pierwszy opisane jako czynnik transkrypcyjny. Późniejsze badania przyniosły dowody, że jest ono zaangażowane w szereg mechanizmów związanych z metabolizmem RNA, takich jak: regulacja transkrypcji, alternatywne składanie RNA, stabilizowanie i transport cząsteczek mRNA, obróbka miRNA czy translacja. TDP-43 jest w związku z tym traktowane jako białko wielofunkcyjne. Pozostaje jednak niewiadomą, zaburzenie której z licznych funkcji prowadzi do jego modyfikacji i agregacji w degenerujących komórkach. Wydaje się, że wyjaśnienie roli TDP-43 w patologii będzie następstwem dokładnego poznania jego fizjologii. CHARAKTERYSTYKA BUDOWY I FUNKCJI BIAŁKA TDP-43 TDP-43 jest lokalizującym się głównie w jądrze komórkowym białkiem o masie 43 kDa, zbudowanym z 414 aminokwasów (Ryc. 1). Kodujący je gen TARDBP, zlokalizowany na pierwszym chromosomie, ulega ekspresji w niemalże wszystkich typach tkanek [18]. Ze względu na charakterystyczne elementy strukturalne, TDP-43 jest zaliczane do rodziny heterogennych rybonukleoprotein (hnRNPs, ang. heterogeneous ribonucleoproteins), do której należą dobrze scharakteryzowane czynniki regulujące składanie RNA: hnRNP I, hnRNP A/B czy hnRNP H [23]. Najbardziej wyróżniającą cechą białek hnRNPs jest zdolność wiązania DNA, dwu-, jak i jednoniciowego, oraz RNA. W przypadku TDP-43 funkcja ta jest egzekwowana poprzez silnie ewolucyjnie konserwowane motywy RRM1 i RRM2 (ang. RNA recognition motifs). RRM1 jest kluczowy dla rozpoznawania dwuzasadowych powtórzeń (TG)n/(UG)n w DNA i RNA, do których TDP-43 ma wysokie powinowactwo [24]. RRM2 wydaje się być natomiast niezbędny dla formowania właściwego strukturalnie kompleksu białkowo-nukleinowego [25]. W wyniku oddziaływania obydwu motywów z sekwencjami docelowymi, TDP-43 bierze udział w regulacji transkrypcji i alternatywnego składania RNA [26]. Pierwszą opisaną funkcją białka było hamowanie transkrypcji w genomie ludzkiego wirusa niedoboru odporności HIV-1, poprzez wiązanie się do polipirymidynowych powtórzeń w obrębie sekwencji TAR [27]. Analogiczna funkcja została potwierdzo- 161 Rycina 1. Schemat struktury 414 aminokwasowego białka TDP-43. Zaznaczone domeny: NLS — sygnał lokalizacji jądrowej; RRM1 i RRM2 — motywy rozpoznające RNA i DNA; NES — sygnał eksportu z jądra oraz GRR — region bogaty w glicyny. Rycinę przygotowano na podstawie [16], zmieniono. na także dla mysiego genu SP-10, kodującego białko akrosomalne spermatyd [28]. Tworząc kompleksy z innymi białkami, TDP-43 wiąże się do powtórzeń UG w obrębie intronów i reguluje mechanizmy kierujące alternatywnym składaniem RNA. Udowodniono, że może ono pośredniczyć zarówno w procesach wykluczania eksonów (eksonu 9 z mRNA błonowego regulatora przewodnictwa (CFTR, ang. cystic fibrosis transmembrane regulator) [25] i eksonu 3 z mRNA apolipoproteiny AII [29]), jak i ich włączania do transkryptu (włączanie eksonu 7 do mRNA SMN2 (ang. survival motor neuron) [30]. Według niektórych doniesień, (UG)n nie są ani konieczne, ani też wystarczające do wiązania TDP-43 [31]. Potwierdzonym przykładem oddziaływań niezależnych od powtórzeń UG, jest wiązanie do regionu TDPBR (ang. TDP-43 binding region) w obrębie swojego 3’ UTR (ang. untranslated region); skutkiem tego zjawiska jest możliwość regulacji przez TDP-43 poziomu własnej ekspresji [32]. Poprzez przyłączanie się do rejonów UTR TDP-43 pełni również funkcję stabilizatora cząsteczek mRNA. Co ciekawe, jednym z transkryptów regulowanych na tym poziomie jest hNFL, którego produkt, neurofilament, tworzy patologiczne agregaty w niektórych typach ALS [33]. Chociaż lokalizuje się głównie w jądrze komórkowym, TDP-43 jest również zaangażowane w procesy, które odbywają się w części cytoplazmatycznej. Analogicznie do innych białek z rodziny hnRNPs, pewna pula TDP-43 stale przemieszcza się między jądrem komórkowym a cytoplazmą [34]. Płynny transport pomiędzy przedziałami komórkowymi jest możliwy dzięki sekwencjom tworzącym sygnał lokalizacji jądrowej NLS (ang. nuclear localization signal) oraz sygnał eksportu z jądra NES (ang. nuclear export signal) [26]. Potencjalne konsekwencje zaburzenia tego procesu to nieprawidłowe rozmieszczenie komórkowe TDP-43, charakterystyczne dla procesów patologicznych. Wprowadzenie mutacji do sekwencji NLS i NES zaburza lokalizację TDP-43 w układach in vitro [35] i in vivo [36] oraz promuje tworzenie białkowych agregatów, co jest w rezultacie toksyczne dla komórek. Żadna jednak z opisanych dotąd mutacji w obrębie genu TARDBP, charakteryzująca ALS, nie dotyczy sekwencji NLS ani NES. Poza dwiema, wszystkie lokalizują się w bogatym w reszty glicynowe regionie karboksylowym (GRR, ang. glycine rich region), pośredniczącym w oddziaływaniach TDP-43 z innymi białkami [37]. Zaburzenie oddziaływań typu białko-białko jest kolejnym i jednym z najszerzej dyskutowanych mechanizmów wiążących TDP-43 z procesami degeneracyjnymi. I chociaż nie jest jasne na co dokładnie przekłada się obecność mutacji, za słusznością tej teorii przemawia fakt, że w skład typowych dla FTLD i ALS patologicznych agregatów TDP-43, wchodzą głównie ~25 i ~35 kDa C-końcowe fragmenty białka, CTFs (ang. C-terminal fragments) [38]. W warunkach fizjologicznych TDP-43 może występować jako dimer. Wykazuje skłonności do agregacji i wydaje się, że utrata natywnych partnerów dodatkowo 162 zwiększa jego powinowactwo do łączenia się w złogi [39]. Region bogaty w reszty glutaminy i asparaginy, promujący wzajemne oddziaływania TDP-43 zawiera się w obrębie C-końca i jest określany jako domena prionowa [40]. Umiejętność wiązania białek jest jedną z ważniejszych cech TDP-43. W wielu przypadkach oddziaływanie z innymi hnRNPs warunkuje funkcje TDP-43 jako negatywnego regulatora składania RNA [41]. Stosunkowo niedawno potwierdzono oddziaływanie TDP-43 z FUS, również należącym do rodziny hnRNP i zaangażowanym w patologię FTLD i ALS, w regulacji poziomu ekspresji mRNA deacetylazy histonu (HDAC)6 [42]. TDP-43 jest jednym z białek wchodzących w skład tzw. granul stresowych, białkowo-nukleinowych kompleksów, których rolą jest lokalne zahamowanie translacji w niekorzystnych warunkach. Nie potwierdzono co prawda obecności takich granul w tkankach pacjentów FTLD czy ALS, nie wyklucza to jednak ewentualnych zaburzeń kontroli procesów syntezy białek w początkowych stadiach chorób [43]. Zasugerowano również udział TDP-43 w modulacji procesów plastyczności neuronalnej jako zaangażowanego w regulację transportu cząsteczek RNA i lokalnej translacji. Zaobserwowano bowiem jego lokalizację w wypustkach dendrytycznych, gdzie w wyniku pobudzenia wspólnie z białkami FMRP (ang. fragile X mental retardation syndrome protein) i Staufen1 tworzy granule RNA [44]. Jedną z coraz częściej badanych funkcji TDP-43 jest udział w procesach dojrzewania i obróbki cząsteczek miRNA. Białko wchodzi w skład jądrowego kompleksu DROSHA i cytoplazmatycznego DICER, procesujących miRNA, oraz wiąże się do samych prekursorów miRNA [45]. Każde miRNA może regulować nawet kilkaset mRNA, a zaburzenia ich produkcji w OUN wywołują degenerację komórek nerwowych [46]. Jest więc możliwe, że zmiany poziomu transkryptów obserwowane w przypadkach FTLD i ALS, chociaż w części wynikają z nieprawidłowości w procesach powstawania miRNA, które z kolei mogą być efektem deregulacji TDP-43 [47]. Podsumowując, opisane przykłady pokazują jak bardzo wszechstronne jest TDP-43 w sensie oddziaływania z innymi białkami, RNA i DNA. Oszacowano, że oddziałuje z około 30% puli transkryptów występujących w mysim mózgu i dziesiątkami białek [31,48]. Tak szerokie spektrum sprawowanych funkcji utrudnia wyselekcjonowanie tych, których zaburzenia prowadzą do zmian i degeneracji komórek, charakterystycznych dla chorób neurozwyrodnieniowych. TDP-43 W PATOLOGII KOMÓREK NERWOWYCH Główną cechą charakterystyczną grupy chorób określanych jako proteinopatie TDP-43, jest obecność w komórkach OUN nieprawidłowych agregatów białka TDP-43. Ich odkrycie było przełomowe dla poznania wcześniej nie zdefiniowanych typów FTLD i ALS. Do dziś nie zostało jednak jednoznacznie www.postepybiochemii.pl stwierdzone czy obecność inkluzji białkowych jest przyczyną, czy konsekwencją procesu chorobowego. Nadal nie wiemy, które funkcje TDP-43 zostają zaburzone w wyniku mutacji genu TARDBP czy też czemu mutacje w obrębie innych genów kierują je na szlak agregacji. Chociaż ogniwo łączące TDP-43 z degeneracją komórek pozostaje nieznane, sam obraz patologii TDP-43 w chorobach neurozwyrodnieniowych został opisany. Charakterystyczna dla stanu fizjologicznego punktowa dystrybucja TDP-43 w jądrze komórkowym, zostaje w warunkach chorobowych przesunięta w stronę lokalizacji cytoplazmatycznej. Procesowi temu towarzyszy zanikanie sygnału jądrowego, co zaobserwowano zarówno w komórkach nerwowych, jak i glejowych tkanek zmienionych. TDP-43 tworzy w cytoplazmie inkluzje o bardzo różnym kształcie, od fibrylarnych po paciorkowate. Zdecydowana większość takich agregatów jest ubikwitylowana. Taka modyfikacja, występująca w wielu typach chorób neurozwyrodnieniowych, może świadczyć o kierowaniu patologicznego białka do degradacji proteasomalnej. Jednak przyczyny i konsekwencje dodawania cząsteczek ubikwityny do białek wchodzących na ścieżkę agregacji, nie są jasne [22]. Kolejnym znacznikiem biologicznym nieprawidłowych depozytów TDP-43 jest nadmierna fosforylacja, która dotyczy głównie reszt serynowych końca karboksylowego, umiejscowionych w pozycjach 409 i 410 [49] oraz w mniejszym stopniu Ser 379 i Ser 403/404 [50]. Ufosforylowane epitopy są najprawdopodobniej tworzone przez kinazy kazeinowe CK-1 i CK-2 (ang. casein kinases). Użycie przeciwciał selektywnie rozpoznających tak zmodyfikowane warianty, uwidacznia znacznie więcej inkluzji TDP-43 w tkankach pacjentów FTLD i ALS, niż przeciwciało znakujące ubikwitynę [50]. Pozostaje niejasne czy i w jakiej formie w warunkach fizjologicznych TDP-43 podlega fosforylacji oraz czym skutkuje taka modyfikacja w stanach patologicznych. Pokazano, że przyłączanie przez kinazy kazeinowe reszt fosforanowych do rekombinowanego TDP-43 promuje jego oligomeryzację i fibrylizację [50]. Z kolei według innych doniesień, fosforylacja nie jest wyznacznikiem agregacji i następuje na późniejszych etapach tworzenia inkluzji białkowych [51]. Cechą niespotykaną w tkankach prawidłowych jest obecność ~25 i ~35 kDa CTFs TDP-43. Przyczyny ani konsekwencje powstawania krótkich fragmentów C-końcowych nie są jasne. Udowodniono jednak, że synteza CTFs w hodowlach komórkowych indukuje cytotoksyczność i rekapituluje cechy patologii, włączając ubikwitylację i fosforylację. TDP-43 jest substratem dla proteolitycznych kaspaz i wydaje się, że enzymy te są chociaż w części odpowiedzialne za cięcie TDP-43 w chorobach zwyrodnieniowych [38]. Rycina 2 przedstawia uproszczone ujęcie wybranych funkcji TDP43 w komórce nerwowej i konsekwencje ich zaburzeń. ZWIERZĘCE MODELE PROTEINOPATII ZWIĄZANYCH Z TDP-43 Określenie głównego białka patologicznego danego schorzenia czy też rodzaju i lokalizacji mutacji w genomie niesie ze sobą możliwości przeprowadzenia specyficznych analiz w układach in vitro oraz in vivo. Bardzo cennym narzędziem umożliwiającym wgląd w proces degeneracji komórek w różnych stadiach zaawansowania są modele zwierzęce ludzkich chorób. Zaburzenia w grupie proteinopatii związanych z TDP-43 manifestowane są w bardzo różnej formie. Ogniwo łączące TDP-43 z FTLD można określić jako głównie neuropatologiczne. Nieprawidłowości genetyczne w postaci mutacji TARDBP zdecydowanie częściej przekładają się na ALS. Wynika z tego zasadność tworzenia modeli eksprymujących zarówno prawidłowe, jak i zmutowane TDP-43. Początkowo podejrzewano, że zwierzęta ze sztucznie wprowadzonym genem o właściwej sekwencji będą roz- Rycina 2. Schemat wybranych funkcji TDP-43. A. W warunkach fizjologicznych, głównie jądrowe białko, bierze udział w szeregu procesów związanych z metabolizmem RNA i DNA, m.in. regulacji składania RNA czy transkrypcji. Pewna pula TDP-43 stale wędruje pomiędzy jądrem a cytoplazmą, gdzie TDP-43 we współpracy z innymi białkami stabilizuje tranksrypty i bierze udział w transportowaniu cząsteczek RNA wzdłuż dendrytów. B. W stanach patologicznych TDP-43 opuszcza przedział jądrowy, co wiąże się z utratą jego jądrowych funkcji, oraz w formie ubikwitylowanej i/lub fosforylowanej akumuluje się w cytoplazmie. W tkance chorobowo zmienionej obecne są również C-końcowe fragmenty białka. Patologiczne TDP-43 jest słabiej rozpuszczalne i bardziej skłonne do agregacji. Użyte skróty: P — grupa fosforanowa; U — ubikwityna. Rycinę przygotowano na podstawie [22], zmieniono. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 163 wijać objawy rekapitulujące zespół otępienny, a ekspresja wariantu z mutacją będzie prowadzić do ALS. Do dnia dzisiejszego powstały bardzo liczne i różnorodne modele zmodyfikowanych genetycznie pod kątem TDP-43 zwierząt. Użycie promotorów konstytutywnych o szerokim działaniu tkankowym prowadzi do stosunkowo wczesnego wystąpienia fenotypu. Myszy eksprymujące zarówno prawidłowe, jak i zmutowane warianty TDP-43, w przeciągu kilku miesięcy, a nawet tygodni rozwijają poważne zaburzenia ruchowe typowe dla ALS. Zaobserwowano, że stopień nasilenia objawów jest wprost proporcjonalny do poziomu ekspresji genu heterologicznego w OUN [52]. W wielu przypadkach ostre zaburzenia lokomotoryczne we wczesnym wieku uniemożliwiają ocenę zwierząt pod kątem otępienia. Mimo występowania różnic pomiędzy poszczególnymi liniami zmodyfikowanych genetycznie zwierząt, modele TDP-43 potwierdziły szczególną podatność warstwy piątej kory czołowej na powstawanie ubikwitylowanych agregatów białka. Procesowi temu zwykle towarzyszy spadek liczby neuronów i wzmożona astroglejoza [53,54]. Zmiany w obrazie histopatologicznym warstwy piątej kory mózgowej są również charakterystyczne dla pacjentów FTLD i FTLD/ALS [55]. W nielicznych przypadkach uwidoczniono natomiast typową dla ALS degenerację i agregację mitochondriów w neuronach ruchowych rdzenia [54,56]. Pojawiły się również dowody, że powstawanie agregatów TDP-43 nie musi być wyznacznikiem degeneracji [53]. Bardziej precyzyjne modelowanie polega na użyciu promotorów specyficznych dla danego typu tkanki czy nawet określonego jej obszaru. Ekspresja prawidłowego wariantu TDP-43 w hipokampie, prążkowiu i korze mózgu, kierowana przez promotor CamKII, powoduje degenerację komórek nerwowych i deficyty behawioralne u tak zmodyfikowanych myszy [57,58]. Potwierdzono także efekt zależny od nadekspresji. Już 0,8-krotne zwiększenie poziomu ludzkiego TDP-43 ponad endogenny poziom mysiego białka prowadzi do utraty ~75% komórek zakrętu zębatego. Degeneracja w obszarze kory mózgu jest w tym wypadku również bardziej nasilona w jej niższych warstwach. Wymuszona mutacją sekwencji NLS lokalizacja cytoplazmatyczna TDP-43 prowadzi do spadku liczby neuronów drogi korowo-rdzeniowej i idącej za tym dysfunkcji ruchowej [57]. Z kolei dwukrotnie wyższy poziom mysiej formy prawidłowego TDP-43 znacząco zaburza pamięć, uczenie i plastyczność synaptyczną [58]. Co więcej, zwierzęta takie rozwijają zaburzenia motoryczne mimo braku ekspresji transgenu w rdzeniu kręgowym [57,58]. Powstało także kilka linii eksprymujących cały ludzki gen TARDBP, zarówno o sekwencji prawidłowej, jak i zmutowanej. Myszy takie prezentowały poziom ekspresji około trzykrotnie wyższy ponad endogenny. Zwierzęta, niezależnie od wariantu TDP-43, rozwijały nasiloną astroglejozę do piątego miesiąca życia, a około siódmego manifestowały deficyty uczenia się i pamięci. W dziesiątym miesiącu pojawiały się ubikwitylowane wtręty TDP-43 [59]. Modele typu „knock-out” stanowią doskonałe narzędzie do weryfikacji skutków utraty funkcji danego białka. Całkowite usunięcie TDP-43 (Tardbp-/-) okazało się być jednak 164 letalne na etapie embrionalnym, co wynika jak się wydaje z nieprawidłowości w rozwoju węzła zarodkowego. Myszy heterozygotyczne pod względem modyfikacji (Tardbp+/-) mają natomiast prawidłowy poziom białka i nie rozwijają objawów neuropatologii [60,61]. Co ciekawe, w modelu warunkowanym, w którym gen Tardbp jest usuwany u zwierząt dorosłych, w kilka dni po zainicjowaniu modyfikacji genetycznej zaobserwowano zwiększoną śmiertelność. Zaskakujące okazało się, że na skutek zwiększonego poziomu oksydacji tkanki tłuszczowej i znaczącej utraty masy ciała, a nie degeneracji komórek OUN [62]. Istnieje jedynie kilka linii szczurzych modelujących proteinopatie TDP-43 i tylko w części prezentują one rodzaj patologii obserwowany u myszy. Wprowadzenie całego ludzkiego TDP-43 o prawidłowej sekwencji na sztucznym chromosomie bakteryjnym BAC (ang. bacterial artificial chromosome) nie prowadzi do widocznych zmian degeneracyjnych nawet u zwierząt kilkumiesięcznych. Natomiast szczury eksprymujące formę zmutowaną, rozwijały paraliż wyjątkowo wcześnie, bo już w 29 dniu życia [63]. Zasugerowano w związku z tym występowanie różnic gatunkowych kierujących rozbieżnościami skutków modyfikacji związanych z TDP-43. Potwierdzeniem tej tezy mogą być wyniki nadprodukcji ludzkiego prawidłowego wariantu białka u makaka jawajskiego i u szczura. Lokalną ekspresję transgenu w odcinku krzyżowym rdzenia kręgowego uzyskano przy użyciu wektorów AAV (ang. adeno-associated virus). Małpy rozwijały szereg cech typowych dla ALS, takich jak postępujące osłabienie siły mięśniowej, zanik mięśni i powstawanie agregatów zawierających cystatynę C. Zaobserwowano także zwiększenie dystrybucji cytoplazmatycznej TDP-43 w miejscu iniekcji, czemu towarzyszył spadek poziomu sygnału jądrowego. Model ten potwierdził, że fosforylacja TDP-43 zachodzi na późniejszych etapach postępującej degeneracji. Co ciekawe, szczury traktowane w analogiczny sposób cechowała wyłącznie jądrowa lokalizacja transgenu, bez zmian świadczących o jego redystrybucji czy śmierci komórek [64]. TDP-43 jest białkiem wysoce konserwowanym ewolucyjnie. Porównanie sekwencji genu ludzkiego, mysiego, muszki owocowej Drosophila melanogaster i nicienia Caenorhabditis elegans potwierdziło bardzo wysoki stopień homologii sugerując, że białko sprawuje analogiczne funkcje u tych gatunków [65]. Istotnie, usunięcie homologa genu TARDBP u D. melanogaster prowadzi do zaburzeń motorycznych i zmian na synapsach mięśniowych, a efekt ten jest odwracalny poprzez wprowadzenie ludzkiego TDP-43 [66]. Natomiast C. elegans z ludzkim TDP-43 prezentuje zaburzoną lokomotorykę, a taki fenotyp jest dodatkowo zaostrzony u osobników eksprymujących warianty zmutowane [67,68]. Opisane modele zwierzęce odzwierciedlają fenotyp FTLD i ALS w bardzo różnej formie i nasileniu. Może się wydawać, że samo wystąpienie cech charakterystycznych dla danego schorzenia powinno ułatwić ustalenie mechanizmu odpowiadającego za degenerację komórek. Chociaż myszy i szczury zmodyfikowane pod kątem TDP-43 rozwijają typowe dla obrazu neuropatologicznego występującego u ludzi agregaty białkowe czy CTFs, dotychczas nie umożliwiły odkrycia ogniwa prowadzącego poprzez te nieprawidłowości do deficytów behawioralnych i lokomotorycznych. Kluczowww.postepybiochemii.pl wą kwestią będzie określenie, która cecha najbliżej koreluje z funkcjonalnymi zaburzeniami typowymi dla FTLD i ALS. Jedną z powtarzalnych charakterystyk wśród zmodyfikowanych genetycznie linii zwierząt odzwierciedlających patologię TDP-43 jest nasilenie fenotypu zależne od poziomu ekspresji genu heterologicznego. Fakt ten może świadczyć, że poziom TDP-43 jest ściśle kontrolowany i jakiekolwiek przekroczenie wartości granicznych jest dla komórek wyjątkowo niekorzystne. Potwierdzeniem tej hipotezy mogą być scharakteryzowane trzy przypadki mutacji w obrębie 3’ UTR mRNA TARDBP. Nieprawidłowości sekwencji poprzez którą TDP43 reguluje swoją własną ekspresję, przekładają się na około dwukrotne podwyższenie ilości transkryptu i prowadzą do wystąpienia objawów FTLD, ALS oraz FTLD/ALS [69]. Co więcej, nadprodukcja TDP-43 w modelach zwierzęcych zwykle skutkuje obniżeniem poziomu endogennego TDP-43, co może potwierdzać niską tolerancję organizmu na wahania jego stężenia. Występowanie analogicznych skutków syntezy wariantów TDP-43 o sekwencjach prawidłowej i zmutowanej stanowi dodatkowy argument świadczący, że dla komórki zaburzenie poziomu TDP-43 jest równoznaczne z obecnością zmienionych, być może nie w pełni funkcjonalnych form białka. Co ciekawe, przykłady takie są odmienne od chociażby modeli SOD1, w których wyłącznie formy zmutowane prowadzą do fenotypu ALS [9]. Wyniki badań przeprowadzanych na modelach zwierzęcych przyczyniły się również do sformułowania hipotezy, że agregacja i fosforylacja TDP-43 nie są krytyczne dla rozwinięcia fenotypu choroby i mogą stanowić konsekwencje procesu zwyrodnieniowego. Modele zwierzęce powstają, by umożliwić udzielenie odpowiedzi na nurtujące pytania, na które nie bylibyśmy w stanie odpowiedzieć analizując jedynie materiał ludzki, prezentujący końcowe stadia procesów zwyrodnieniowych. Należy jednak pamiętać, że nawet najbardziej wiarygodne modele rekapitulują tylko niektóre aspekty chorób i powinny być z rozwagą wykorzystywane do formułowania i sprawdzania stawianych hipotez. Nie możemy zakładać, że jest w pełni możliwe odtworzenie konsekwencji zdarzeń z przestrzeni kilkudziesięciu lat życia człowieka w dwa lata życia myszy laboratoryjnej. Niemniej jednak, modele zwierzęce stanowią najlepsze i najbardziej wiarygodne narzędzie do badań mechanizmów procesów patologicznych. PODSUMOWANIE Wyniki badań biochemicznych, immunohistochemicznych i genetycznych potwierdzają niezaprzeczalnie udział białka TDP-43 w patogenezie szeregu chorób neurozwyrodnieniowych. Identyfikacja głównej składowej agregatów w komórkach OUN licznej grupy pacjentów FTLD i ALS była przełomowa, pozwoliła bowiem na scharakteryzowanie szerokiego spektrum schorzeń, których cechą centralną są zaburzenia związane z TDP-43. Do dnia dzisiejszego opisano kilkadziesiąt mutacji genu TARDBP i szereg zmian patologicznych angażujących białko. Wykorzystanie nowoczesnych technik biologii molekularnej bezsprzecznie poszerzyło stan wiedzy na temat cech patologii, nie doprowadziło jednak do rozwiązania zagadnień kluczowych. Większość pytań poruszających przyczyny degeneracji komórek pozostaje ciągle bez odpowiedzi. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 Rola TDP-43 w patogenezie może być traktowana jako przyczynowa, gdy zaburzenia są efektem mutacji TARDBP, bądź pośrednia, gdy mutacje dotyczą innego genu lub nie występują. Jaki jest jednak powód zainicjowania i rozpoczęcia procesu chorobowego, pozostaje niewiadomą. Być może degeneracja komórki nerwowej w przypadkach FTLD i ALS jest konsekwencją utraty jednej bądź kilku fizjologicznych funkcji TDP-43. Zakładając, że taki scenariusz ma miejsce, nasuwa się pytanie z czego wynika utrata funkcji białka? Może jest skutkiem zmienionego poziomu TDP-43 w komórce i zaburzeń procesów autoregulacji? A może to za wysoki poziom TDP-43 w cytoplazmie przesuwa preferencję białka w stronę tworzenia agregatów? Te oraz inne kwestie pozostają do rozwiązania w przyszłości. Przypisanie białku TDP-43 roli w patogenezie skierowało naukę o chorobach neurozwyrodnieniowych na nowe tory. Proteinopatie TDP-43 są aktualnie coraz częściej traktowane jako prototyp rodzaju deregulacji, wynikającej z szerokich funkcji TDP-43 kierujących metabolizmem RNA. Od momentu opisania jego udziału w FTLD i ALS, pojawiły się doniesienia o kolejnych białkach regulujących różne aspekty obróbki RNA i zaangażowanych w procesy patologiczne. Zaczęto postulować, że zmiany degeneracyjne mogą wynikać z zaburzonego poziomu transkryptów czy procesowania miRNA. Chociaż obecnie brakuje mocnych dowodów na potwierdzenie tej hipotezy, wydaje się ona prawdopodobna. Zaburzenie chociaż jednej funkcji białka o tak szerokim spektrum oddziaływań może prowadzić do różnorodnych i poważnych konsekwencji. Zarówno utrata, jak i nabycie nowej, nie spełnianej fizjologicznie roli będzie w wypadku TDP-43 prowadzić do rozregulowania całej puli cząsteczek RNA. TDP-43 jest określane jako białko wielofunkcyjne. Kluczowe dla poznania jego roli w patologii chorób neurozwyrodnieniowych będzie dokładniejsze poznanie jego funkcji fizjologicznych i określenie partnerów interakcji w komórkach OUN. PIŚMIENNICTWO 1. Neumann M, Sampathu DM, Kwong LK, Truax AC, Micsenyi MC, Chou TT, Bruce J, Schuck T, Grossman M, Clark CM, McCluskey LF, Miller BL, Masliah E, Mackenzie IR, Feldman H, Feiden W, Kretzschmar HA, Trojanowski JQ, Lee VM (2006) Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science 314: 130-133 2. Piguet O, Hornberger M, Mioshi E, Hodges JR (2011) Behavioural-variant frontotemporal dementia: diagnosis, clinical staging, and management. In Lancet Neurol. Vol 10, 2010/12/15 Edn, str. 162-172 3. Neumann M, Kwong LK, Sampathu DM, Trojanowski JQ, Lee VM (2007) TDP-43 proteinopathy in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis: protein misfolding diseases without amyloidosis. Arch Neurol 64: 1388-1394 4. Sieben A, Van Langenhove T, Engelborghs S, Martin JJ, Boon P, Cras P, De Deyn PP, Santens P, Van Broeckhoven C, Cruts M (2012) The genetics and neuropathology of frontotemporal lobar degeneration. Acta Neuropathol 124: 353-372 5. Elman LB, McCluskey L, Grossman M (2008) Motor neuron disease and frontotemporal lobar degeneration: a tale of two disorders linked to TDP-43. Neurosignals 16: 85-90 6. Grossman M, Libon DJ, Forman MS, Massimo L, Wood E, Moore P, Anderson C, Farmer J, Chatterjee A, Clark CM, Coslett HB, Hurtig HI, Lee VM, Trojanowski JQ (2007) Distinct antemortem profiles in 165 patients with pathologically defined frontotemporal dementia. Arch Neurol 64: 1601-1609 7. Borroni B, Bonvicini C, Alberici A, Buratti E, Agosti C, Archetti S, Papetti A, Stuani C, Di Luca M, Gennarelli M, Padovani A (2009) Mutation within TARDBP leads to frontotemporal dementia without motor neuron disease. Hum Mutat 30: E974-983 8. Synofzik M, Born C, Rominger A, Lummel N, Schols L, Biskup S, Schule C, Grasshoff U, Klopstock T, Adamczyk C (2014) Targeted high-throughput sequencing identifies a TARDBP mutation as a cause of early-onset FTD without motor neuron disease. Neurobiol Aging 35: 1212 e1211-1215 9. Kunst CB (2004) Complex genetics of amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet 75: 933-947 10.Geser F, Brandmeir NJ, Kwong LK, Martinez-Lage M, Elman L, McCluskey L, Xie SX, Lee VM, Trojanowski JQ (2008) Evidence of multisystem disorder in whole-brain map of pathological TDP-43 in amyotrophic lateral sclerosis. Arch Neurol 65: 636-641 11.Oliveira AS, Pereira RD (2009) Amyotrophic lateral sclerosis (ALS): three letters that change the people’s life. For ever. Arq Neuropsiquiatr 67: 750-782 12.Al-Chalabi A, Jones A, Troakes C, King A, Al-Sarraj S, van den Berg LH (2012) The genetics and neuropathology of amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol 124: 339-352 13.Del Bo R, Ghezzi S, Corti S, Pandolfo M, Ranieri M, Santoro D, Ghione I, Prelle A, Orsetti V, Mancuso M, Soraru G, Briani C, Angelini C, Siciliano G, Bresolin N, Comi GP (2009) TARDBP (TDP-43) sequence analysis in patients with familial and sporadic ALS: identification of two novel mutations. Eur J Neurol 16: 727-732 14.Bruijn LI, Miller TM, Cleveland DW (2004) Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu Rev Neurosci 27: 723-749 15.Tovar YRLB, Santa-Cruz LD, Tapia R (2009) Experimental models for the study of neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Mol Neurodegener 4: 31 16.Lagier-Tourenne C, Cleveland DW (2009) Rethinking ALS: the FUS about TDP-43. Cell 136: 1001-1004 17.Da Cruz S, Cleveland DW (2011) Understanding the role of TDP-43 and FUS/TLS in ALS and beyond. Curr Opin Neurobiol 21: 904-919 18.Smethurst P, Sidle KC, Hardy J (2014) Prion-like mechanisms of TDP-43 in ALS. Neuropathol Appl Neurobiol, Dec 9. doi: 10.1111/ nan.12206 19.Liscic RM, Grinberg LT, Zidar J, Gitcho MA, Cairns NJ (2008) ALS and FTLD: two faces of TDP-43 proteinopathy. Eur J Neurol 15: 772-780 20.Van Deerlin VM, Leverenz JB, Bekris LM, Bird TD, Yuan W, Elman LB, Clay D, Wood EM, Chen-Plotkin AS, Martinez-Lage M, Steinbart E, McCluskey L, Grossman M, Neumann M, Wu IL, Yang WS, Kalb R, Galasko DR, Montine TJ, Trojanowski JQ, Lee VM, Schellenberg GD, Yu CE (2008) TARDBP mutations in amyotrophic lateral sclerosis with TDP-43 neuropathology: a genetic and histopathological analysis. Lancet Neurol 7: 409-416 21.Giordana MT, Ferrero P, Grifoni S, Pellerino A, Naldi A, Montuschi A (2011) Dementia and cognitive impairment in amyotrophic lateral sclerosis: a review. Neurol Sci 32: 9-16 22.Chen-Plotkin AS, Lee VM, Trojanowski JQ (2010) TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol 6: 211-220 23.D’Ambrogio A, Buratti E, Stuani C, Guarnaccia C, Romano M, Ayala YM, Baralle FE (2009) Functional mapping of the interaction between TDP-43 and hnRNP A2 in vivo. Nucleic Acids Res 37: 4116-4126 24.Ayala YM, Pantano S, D’Ambrogio A, Buratti E, Brindisi A, Marchetti C, Romano M, Baralle FE (2005) Human, Drosophila, and C.elegans TDP43: nucleic acid binding properties and splicing regulatory function. J Mol Biol 348: 575-588 25.Buratti E, Baralle FE (2001) Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9. J Biol Chem 276: 36337-36343 26.Wang IF, Wu LS, Shen CK (2008) TDP-43: an emerging new player in neurodegenerative diseases. Trends Mol Med 14: 479-485 166 27.Ou SH, Wu F, Harrich D, Garcia-Martinez LF, Gaynor RB (1995) Cloning and characterization of a novel cellular protein, TDP-43, that binds to human immunodeficiency virus type 1 TAR DNA sequence motifs. J Virol 69: 3584-3596 28.Abhyankar MM, Urekar C, Reddi PP (2007) A novel CpG-free vertebrate insulator silences the testis-specific SP-10 gene in somatic tissues: role for TDP-43 in insulator function. J Biol Chem 282: 36143-36154 29.Mercado PA, Ayala YM, Romano M, Buratti E, Baralle FE (2005) Depletion of TDP 43 overrides the need for exonic and intronic splicing enhancers in the human apoA-II gene. Nucleic Acids Res 33: 6000-6010 30.Bose JK, Wang IF, Hung L, Tarn WY, Shen CK (2008) TDP-43 overexpression enhances exon 7 inclusion during the survival of motor neuron pre-mRNA splicing. J Biol Chem 283: 28852-28859 31.Polymenidou M, Lagier-Tourenne C, Hutt KR, Huelga SC, Moran J, Liang TY, Ling SC, Sun E, Wancewicz E, Mazur C, Kordasiewicz H, Sedaghat Y, Donohue JP, Shiue L, Bennett CF, Yeo GW, Cleveland DW (2011) Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43. Nat Neurosci 14: 459-468 32.Buratti E, Baralle FE (2012) TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends Biochem Sci 37: 237-247 33.Strong MJ, Volkening K, Hammond R, Yang W, Strong W, Leystra-Lantz C, Shoesmith C (2007) TDP43 is a human low molecular weight neurofilament (hNFL) mRNA-binding protein. Mol Cell Neurosci 35: 320-327 34.Ayala YM, Zago P, D’Ambrogio A, Xu YF, Petrucelli L, Buratti E, Baralle FE (2008) Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. J Cell Sci 121: 3778-3785 35.Winton MJ, Igaz LM, Wong MM, Kwong LK, Trojanowski JQ, Lee VM (2008) Disturbance of nuclear and cytoplasmic TAR DNA-binding protein (TDP-43) induces disease-like redistribution, sequestration, and aggregate formation. J Biol Chem 283: 13302-13309 36.Miguel L, Frebourg T, Campion D, Lecourtois M (2011) Both cytoplasmic and nuclear accumulations of the protein are neurotoxic in Drosophila models of TDP-43 proteinopathies. Neurobiol Dis 41: 398-406 37.Igaz LM, Kwong LK, Chen-Plotkin A, Winton MJ, Unger TL, Xu Y, Neumann M, Trojanowski JQ, Lee VM (2009) Expression of TDP-43 C-terminal Fragments in Vitro Recapitulates Pathological Features of TDP-43 Proteinopathies. J Biol Chem 284: 8516-8524 38.Zhang YJ, Xu YF, Cook C, Gendron TF, Roettges P, Link CD, Lin WL, Tong J, Castanedes-Casey M, Ash P, Gass J, Rangachari V, Buratti E, Baralle F, Golde TE, Dickson DW, Petrucelli L (2009) Aberrant cleavage of TDP-43 enhances aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA 106: 7607-7612 39.Sun Y, Arslan PE, Won A, Yip CM, Chakrabartty A (2014) Binding of TDP-43 to the 3’UTR of its cognate mRNA enhances its solubility. Biochemistry 53: 5885-5894 40.Budini M, Buratti E, Stuani C, Guarnaccia C, Romano V, De Conti L, Baralle FE (2012) Cellular model of TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) aggregation based on its C-terminal Gln/Asn-rich region. J Biol Chem 287: 7512-7525 41.Buratti E, Brindisi A, Giombi M, Tisminetzky S, Ayala YM, Baralle FE (2005) TDP-43 binds heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B through its C-terminal tail: an important region for the inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator exon 9 splicing. J Biol Chem 280: 37572-37584 42.Kim SH, Shanware NP, Bowler MJ, Tibbetts RS (2010) Amyotrophic lateral sclerosis-associated proteins TDP-43 and FUS/TLS function in a common biochemical complex to co-regulate HDAC6 mRNA. J Biol Chem 285: 34097-34105 43.Colombrita C, Zennaro E, Fallini C, Weber M, Sommacal A, Buratti E, Silani V, Ratti A (2009) TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. J Neurochem 111: 1051-1061 44.Wang IF, Wu LS, Chang HY, Shen CK (2008) TDP-43, the signature protein of FTLD-U, is a neuronal activity-responsive factor. J Neurochem 105: 797-806 www.postepybiochemii.pl 45.Kawahara Y, Mieda-Sato A (2012) TDP-43 promotes microRNA biogenesis as a component of the Drosha and Dicer complexes. Proc Natl Acad Sci USA 109: 3347-3352 46.Konopka W, Kiryk A, Novak M, Herwerth M, Parkitna JR, Wawrzyniak M, Kowarsch A, Michaluk P, Dzwonek J, Arnsperger T, Wilczynski G, Merkenschlager M, Theis FJ, Kohr G, Kaczmarek L, Schutz G (2010) MicroRNA loss enhances learning and memory in mice. J Neurosci 30: 14835-14842 47.Gascon E, Gao FB (2014) The emerging roles of microRNAs in the pathogenesis of frontotemporal dementia-amyotrophic lateral sclerosis (FTD-ALS) spectrum disorders. J Neurogenet 28: 30-40 48.Freibaum BD, Chitta RK, High AA, Taylor JP (2010) Global analysis of TDP-43 interacting proteins reveals strong association with RNA splicing and translation machinery. J Proteome Res 9: 1104-1120 49.Inukai Y, Nonaka T, Arai T, Yoshida M, Hashizume Y, Beach TG, Buratti E, Baralle FE, Akiyama H, Hisanaga S, Hasegawa M (2008) Abnormal phosphorylation of Ser409/410 of TDP-43 in FTLD-U and ALS. FEBS Lett 582: 2899-2904 50.Hasegawa M, Arai T, Nonaka T, Kametani F, Yoshida M, Hashizume Y, Beach TG, Buratti E, Baralle F, Morita M, Nakano I, Oda T, Tsuchiya K, Akiyama H (2008) Phosphorylated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Ann Neurol 64: 60-70 51.Dormann D, Capell A, Carlson AM, Shankaran SS, Rodde R, Neumann M, Kremmer E, Matsuwaki T, Yamanouchi K, Nishihara M, Haass C (2009) Proteolytic processing of TAR DNA binding protein-43 by caspases produces C-terminal fragments with disease defining properties independent of progranulin. J Neurochem 110: 1082-1094 52.Wils H, Kleinberger G, Janssens J, Pereson S, Joris G, Cuijt I, Smits V, Ceuterick-de Groote C, Van Broeckhoven C, Kumar-Singh S (2010) TDP-43 transgenic mice develop spastic paralysis and neuronal inclusions characteristic of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proc Natl Acad Sci USA 107: 3858-3863 53.Wegorzewska I, Bell S, Cairns NJ, Miller TM, Baloh RH (2009) TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration. Proc Natl Acad Sci USA 106: 18809-18814 54.Xu YF, Gendron TF, Zhang YJ, Lin WL, D’Alton S, Sheng H, Casey MC, Tong J, Knight J, Yu X, Rademakers R, Boylan K, Hutton M, McGowan E, Dickson DW, Lewis J, Petrucelli L (2010) Wild-type human TDP-43 expression causes TDP-43 phosphorylation, mitochondrial aggregation, motor deficits, and early mortality in transgenic mice. J Neurosci 30: 10851-10859 55.Roberson ED (2012) Mouse models of frontotemporal dementia. Ann Neurol 72: 837-849 56.Shan X, Chiang PM, Price DL, Wong PC (2010) Altered distributions of Gemini of coiled bodies and mitochondria in motor neurons of TDP-43 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 107: 16325-16330 57.Igaz LM, Kwong LK, Lee EB, Chen-Plotkin A, Swanson E, Unger T, Malunda J, Xu Y, Winton MJ, Trojanowski JQ, Lee VM (2011) Dysregu- lation of the ALS-associated gene TDP-43 leads to neuronal death and degeneration in mice. J Clin Invest 121: 726-738 58.Tsai KJ, Yang CH, Fang YH, Cho KH, Chien WL, Wang WT, Wu TW, Lin CP, Fu WM, Shen CK (2010) Elevated expression of TDP-43 in the forebrain of mice is sufficient to cause neurological and pathological phenotypes mimicking FTLD-U. J Exp Med 207: 1661-1673 59.Swarup V, Phaneuf D, Bareil C, Robertson J, Rouleau GA, Kriz J, Julien JP (2011) Pathological hallmarks of amyotrophic lateral sclerosis/ frontotemporal lobar degeneration in transgenic mice produced with TDP-43 genomic fragments. Brain 134: 2610-2626 60.Sephton CF, Good SK, Atkin S, Dewey CM, Mayer P, 3rd, Herz J, Yu G (2010) TDP-43 is a developmentally regulated protein essential for early embryonic development. J Biol Chem 285: 6826-6834 61.Wu LS, Cheng WC, Hou SC, Yan YT, Jiang ST, Shen CK (2010) TDP-43, a neuro-pathosignature factor, is essential for early mouse embryogenesis. Genesis 48: 56-62 62.Chiang PM, Ling J, Jeong YH, Price DL, Aja SM, Wong PC (2010) Deletion of TDP-43 down-regulates Tbc1d1, a gene linked to obesity, and alters body fat metabolism. Proc Natl Acad Sci USA 107: 16320-16324 63.Zhou H, Huang C, Chen H, Wang D, Landel CP, Xia PY, Bowser R, Liu YJ, Xia XG (2010) Transgenic rat model of neurodegeneration caused by mutation in the TDP gene. PLoS Genet 6: e1000887 64.Uchida A, Sasaguri H, Kimura N, Tajiri M, Ohkubo T, Ono F, Sakaue F, Kanai K, Hirai T, Sano T, Shibuya K, Kobayashi M, Yamamoto M, Yokota S, Kubodera T, Tomori M, Sakaki K, Enomoto M, Hirai Y, Kumagai J, Yasutomi Y, Mochizuki H, Kuwabara S, Uchihara T, Mizusawa H, Yokota T (2012) Non-human primate model of amyotrophic lateral sclerosis with cytoplasmic mislocalization of TDP-43. Brain 135: 833-846 65.Wang HY, Wang IF, Bose J, Shen CK (2004) Structural diversity and functional implications of the eukaryotic TDP gene family. Genomics 83: 130-139 66.Feiguin F, Godena VK, Romano G, D’Ambrogio A, Klima R, Baralle FE (2009) Depletion of TDP-43 affects Drosophila motoneurons terminal synapsis and locomotive behavior. FEBS Lett 583: 1586-1592 67.Ash PE, Zhang YJ, Roberts CM, Saldi T, Hutter H, Buratti E, Petrucelli L, Link CD (2010) Neurotoxic effects of TDP-43 overexpression in C. elegans. Hum Mol Genet 19: 3206-3218 68.Liachko NF, Guthrie CR, Kraemer BC (2010) Phosphorylation promotes neurotoxicity in a Caenorhabditis elegans model of TDP-43 proteinopathy. J Neurosci 30: 16208-16219 69.Gitcho MA, Bigio EH, Mishra M, Johnson N, Weintraub S, Mesulam M, Rademakers R, Chakraverty S, Cruchaga C, Morris JC, Goate AM, Cairns NJ (2009) TARDBP 3’-UTR variant in autopsy-confirmed frontotemporal lobar degeneration with TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathol 118: 633-645 RNA processing TDP-43 protein has a main pathological role in FTLD and ALS Paulina Koza* Laboratory of Neurobiology, Department of Molecular and Cellular Neurobiology, Nencki Institute of Experimental Biology, 3 Pasteur St., 02-093 Warsaw, Poland * e-mail: [email protected] Key words: ALS, FTLD, protein aggregates, proteinopathies, TDP-43 ABSTRACT TDP-43 is mainly a nuclear protein belonging to the heterogeneous ribonucleoproteins family. It plays a crucial role in the regulation of gene transcription and RNA processing. In 2006, TDP-43 was characterized as the main component of ubiquitin-positive inclusions observed in Frontotemporal Lobar Degeneration (FTLD) and Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) cases. Since then, its central role in a number of neurodegenerative diseases was confirmed, originating the TDP-43 proteinopathies term. Pathological TDP-43 redistributes and accumulates in the cytoplasm forming toxic aggregates. Plethora of animal models recapitulating features typical for human TDP-43 proteinopathies has been generated. However, the mechanism involving TDP-43 and causing functional disturbances, like dementia and motoneurons degeneration, remains unknown. Loss and gain of function hypotheses are proposed, but they still need to be verified. Postępy Biochemii 61 (2) 2015 167