Dr hab. n. med Michał Mączewski Warszawa 19 marca 2013

Dr hab. n. med Michał Mączewski
Zakład Fizjologii Klinicznej
Warszawa 19 marca 2013
CMKP, w/m
Projekt badawczy pt.:
Podawanie preparatu żelaza w modelu pozawałowej niewydolności serca u
szczura: korzyść czy dodatkowe obciążenie? Badania na poziomie narządu i
komórek.
Streszczenie
 Niewydolności serca często towarzyszy niedokrwistość i obniżone stężenie żelaza.
 Gorsze rokowanie.
 Podawanie żelaza – kontrowersyjne. Z jednej strony poprawa morfologii i
ewentualnie układów enzymatycznych, z drugiej – wolne rodniki.
 Badanie kliniczne: karboksymaltoza żelazowa – poprawa objawowa, wpływ na
parametry hemodynamiczne, kardiomiocyty i obieg żelaza – nieznany.
 Celem projektu jest weryfikacja hipotezy, że podawanie preparatu żelaza
(karboksymaltozy żelazowej) u szczurów z pozawałową niewydolnością serca
doprowadzi
do
poprawy
przeżywalności,
przebudowy,
parametrów
hemodynamicznych lewej komory oraz obiegu wapnia i żelaza w kardiomiocytach
lewej komory.
I. Kontekst literaturowy projektu
Coraz więcej danych wskazuje na to, że przewlekła niewydolność serca jest chorobą
ogólnoustrojową, w której zaburzenia nie ograniczają się do mięśnia sercowego (Jessup &
Brozena 2003). Często przewlekłej niewydolności serca towarzyszy niedokrwistość, która w
tym kontekście wiąże się z gorszym rokowaniem pacjentów. W części przypadków jest to
najprawdopodobniej niedokrwistość chorób przewlekłych, a w części niedokrwistość z
niedoboru żelaza. Z tego powodu podejmowano próby korekty niedokrwistości, stosując
między innymi analogi erytropoetyny, jednakże bez wyraźnej korzyści.
Ostatnio zwrócono uwagę, że być może ważniejszym od samej niedokrwistości w
niewydolności serca jest niedobór żelaza (Comin-Colet et al. 2013); (Jankowska et al. 2010).
Potencjalne mechanizmy szkodliwego wpływu niedoboru żelaza obejmują nie tylko
zmniejszenie wytwarzania hemoglobiny, ale także upośledzenie aktywności enzymów
zawierających w swoim centrum aktywnym atom żelaza (m.in. enzymów zaangażowanych w
wytwarzanie ATP w mitochondriach). I stąd koncepcja podawania preparatów żelaza w
leczeniu niewydolności serca. W istocie pokazano, że preparaty żelaza poprawiają jakość
życia pacjentów z niewydolnością serca, ale ich wpływ na twarde punkty końcowe jest
nieznany (Avni et al. 2012).
Jednakże z drugiej strony wiadomo, że żelazo jest silnie toksyczne dla organizmu. Ta
toksyczność wynika głównie z udziału w produkcji wolnych rodników tlenowych (w tak
zwanej reakcji Fentona). Z tego względu żelazo jest poddane bardzo skrupulatnej kontroli w
organizmie. W wielu uznanych modelach eksperymentalnych nadmierna podaż żelaza
prowadzi do wzrostu stresu oksydacyjnego i licznych działań toksycznych.
1
Jony żelaza (Fe2+) wchłaniają się w jelicie cienkim, a następnie są utleniane (Fe3+) i
transportowane we krwi do różnych tkanek w połączeniu z białkiem transportowym,
transferryną. Żelazo przedostaje się do komórek organizmu, w tym komórek sercowych, za
pośrednictwem receptorów transferryny typu 1 lub 2 (TfR-1/-2). W kardiomiocytach istnieje
jeszcze jeden dodatkowy mechanizm: mianowicie jony żelaza mogą wchodzić do komórek
przez kanały wapniowe typu L. Żelaza w komórce albo jest bezpośrednio wykorzystywane,
albo wiąże się z białkiem ferrytyną, które zapobiega jego działaniom toksycznym.
Ostatnio pokazano, że obieg żelaza w kardiomiocytach w niewydolności serca może być
zaburzony (Leszek et al. 2012), mianowicie stężenie żelaza w kardiomiocytach pacjentów z
przewlekłą niewydolnością serca było niższe niż wskazywałyby na to parametry ustrojowej
gospodarki żelaza (stężenie ferrytyny, wysycenie transferyny).
To pokazuje, że rola zaburzeń obiegu żelaza i podawania preparatów żelaza w niewydolności
serca jest nie do końca jasna. Poznanie tych zaburzeń może stać się podstawą do opracowanie
nowych metod leczenia niewydolności serca.
II. Cel i założenia projektu
Celem projektu jest weryfikacja hipotezy, że podawanie preparatu żelaza (karboksymaltozy
żelazowej) u szczurów z pozawałową niewydolnością serca doprowadzi do poprawy
przeżywalności, przebudowy, parametrów hemodynamicznych lewej komory oraz obiegu
wapnia i żelaza w kardiomiocytach lewej komory.
Oceniane parametry:
 Przeżywalność
 Przebudowa
i
parametry
hemodynamiczne
lewej
komory:
oceniana
echokardiograficznie frakcja wyrzutowa, objętość końcoworozkurczowa i
końcowoskurczowa
 Parametry obiegu żelaza w organizmie: stężenie ferrytyny, transferryny, wysycenie
transferryny, receptory dla transferryny, stężenie żelaza w kardiomiocytach
 Parametry obiegu wapnia w kardiomiocytach: sygnał wapniowy, funkcja głównych
białek obiegu Ca2+ oraz zawartość Ca2+ w siateczce sarkoplazmatycznej
Dodatkowym celem projektu jest ocena zaburzeń gospodarki żelaza u szczurów z
pozawałową niewydolnością serca. Oceniane parametry:
 Stężenie ferrytyny, franferyny, żelaza w surowicy, wysycenie transferyny
 Stężenie żelaza i ferrytyny w kardiomiocytach lewej komory
 Ekspresja receptorów dla transferyny TfR-1 i TfR-2 w kardiomiocytach lewej komory.
 Pośrednia ocena transportu żelaza do kardiomiocytów przez kanały wapniowe typu L.
III. Materiał i Metody
III.1. Protokół badań
W pracy zostaną wykorzystane szczury Rasy Wistar-Kyoto o masie 250-270g. U zwierząt
będzie indukowany zawał lewej komory przez podwiązanie tętnicy wieńcowej lub zostanie
wykonana operacja pozorna (sham). Po zakończeniu operacji u zwierząt, u których dokonano
indukcji zawału będzie przeprowadzone badanie echokardiograficzne. Do dalszego badania
zostaną włączone tylko zwierzęta, u których udało się wywołać rozległy zawał (40%
powierzchni lewej komory). Następnie zwierzęta w grupie „sham” i w grupie „zawał” będą
obserwowane przez 4 tygodnie, potem, po wykonaniu kolejnego badania
echokardiograficznego, zostaną w sposób losowy przyporządkowane do dwóch podgrup,
2
otrzymującej karboksymaltozę żelazową (10 mg/kg masy ciała, 4 wstrzyknięcia dożylne w
odstępie 1 tygodnia) lub sól fizjologiczną (według takiego samego schematu).
Po upływie kolejnych 4 tygodni szczury będą ponownie usypiane, wykonywane będzie
badanie echokardiograficzne, badanie hemodynamiczne poprzez cewnikowanie lewej komory
serca w celu pomiaru ciśnień w lewej komorze. Po dokonaniu powyższych pomiarów serca będą
pobierane i przeznaczane do izolacji komórek w celu określenia oceny obiegu Ca2+ w
kardiomiocytach lub do badań molekularnych w celu określenia komórkowego obiegu żelaza.
III.2. Grupy eksperymentalne
Planujemy zbadać 4 grupy zwierząt, w każdej przynajmniej 10 zwierząt:
1. Zwierzęta z zawałem lewej komory otrzymujące karboksymaltozę żelazową (Zawał +
Fe);
2. Zwierzęta z zawałem lewej komory otrzymujące sól fizjologiczną (Zawał)
3. Zwierzęta operowane pozornie otrzymujące karboksymaltozę żelazową (Sham + Fe);
4. Zwierzęta operowane pozornie otrzymujące sól fizjologiczną (Sham)
III.3. Model zawału serca szczura
Zwierzęta będą usypiane za pomocą podawanej dootrzewnowo mieszaniny ketaminy (100
mg/kg m.c.) z ksylazyną (5 mg/kg m.c.). Następnie, po wygoleniu lewej części klatki
piersiowej wykonywane bedzie cięcie poprzeczne w V międzyżebrzu i odpreparowywano
mięśnie piersiowe. Na ranę zakładany będzie szew „kapciuchowy”. Następnie po otwarciu
klatki piersiowej, przecinane będą opłucna i osierdzie. Do rany w klatce piersiowej wkładany
będzie drut zakończony pętlą, którą serce będzie chwytane i wyłaniane na zewnątrz. Na
tętnicę wieńcową, gałąź przednią zstępującą, około 2-4 mm poniżej uszka lewego przedsionka
zakładana będzie podwiązka. W grupie „zawał” podwiązka będzie zaciskana i zawiązywana,
w grupie „sham” wyciągana po przełożeniu wokół tętnicy wieńcowej. Następnie serce
umieszczane będzie z powrotem w klatce piersiowej, do rany wkładany będzie dren i rana
zamykana będzie przez ściągnięcie szwu kapciuchowego a następnie odma opłucnowa będzie
odsysana przez dren. Ok. 1 godzinę po operacji zwierzęta dostaną jednorazowo
dootrzewnowo narkotyk oraz antybiotyk.
III.4. Badanie echokardiograficzne
Badanie echokardiograficzne będzie wykonywane w określonych punktach czasowych przy
użyciu aparatu MyLab25 (ESAOTE, Włochy), głowicą liniową LA523 o częstotliwości 12,5
MHz. Szczury będą usypiane za pomocą podawanej dootrzewnowo mieszaniny ketaminy (75
mg/kg m.c.) z ksylazyną (3,5 mg/kg m.c.). Następnie, po wygoleniu klatki piersiowej szczury
będą umieszczane w pozycji leżącej na grzbiecie. W projekcji przymostkowej będą
wykonywane badania M-mode i 2D. Obliczane będą następujące parametry służące do oceny
wielkości, budowy i kurczliwości lewej komory: wymiar końcowoskurczowy, wymiar
końcoworozkurczowy, frakcja skracania i frakcja wyrzutowa z obrysu oraz grubość przedniej
i tylnej ściany lewej komory w skurczu i rozkurczu. Dodatkowo odcinkowa kurczliwość ścian
lewej komory oceniana będzie zgodnie z wcześniejszym opisem (Maczewski & Maczewska
2006). Każdy z 12 segmentów w projekcji poprzecznej i każdy z 11 segmentów w projekcji
podłużnej lewej komory oceniany będzie jako 1 (prawidłowa kurczliwość) lub 0
(nieprawidłowa kurczliwość - hipokineza, akineza lub dyskineza) i obliczany będzie
całkowity wskaźnik kurczliwości ścian komory (WMI). U zdrowych zwierząt wynosi on 23,
w naszych wcześniejszych badaniach pokazaliśmy, że WMI = 15 odpowiada zawałowi serca
3
~ 40% (potwierdzonemu barwieniem przy użyciu tetrazoliny) oraz że WMI ściśle koreluje z
wielkością zawału, szczególnie dla dużych zawałów.
Z tego powodu będziemy posługiwali się WMI jako wskaźnikiem wielkości zawału in vivo.
Do grup „Zawał” będą włączone tylko zwierzęta o wskaźniku WMI >=15
III.5. Pomiary hemodynamiczne in situ - pomiar ciśnień w lewej komorze.
Szczury będą usypiane za pomocą podawanej dootrzewnowo mieszaniny ketaminy (100
mg/kg m.c.) z ksylazyną (5 mg/kg m.c.). Następnie, po odpreparowaniu, do prawej tętnicy
szyjnej wspólnej wkładany będzie 1.0 mm wenflon, przez który włożony zostanie 2,0-Fr
cewnik do pomiaru ciśnienia (SPC-320, Millar Instruments Inc.), a następnie umieszczony w
lewej komorze serca. Przy użyciu odpowiedniego oprogramowania komputerowego
rejestrowane będą następujące parametry: rytm serca, ciśnienie w lewej komorze, ciśnienie
końcoworozkurczowe w lewej komorze, maksymalna szybkość wzrostu ciśnienia w lewej
komorze (dp/dt) - wskaźnik kurczliwości komory oraz ciśnienie tętnicze w aorcie.
III.6. Badania biochemiczne
Przy użyciu testów ELISA wykonywane będą następujące oznaczenia: stężenie transferyny i
ferrytyny we krwi, stężenie ferrytyny, gęstość receptorów transferyny (TfR-1 i TfR-2) w
izolowanych kardiomiocytach lewej komory. Stężenie żelaza w izolowanych kardiomiocytach
lewej komory będzie oznaczane metodą spektroskopii rezonansu magnetycznego.
III.7.Badania w izolowanych kardiomiocytach lewej komory
Serca z każdej podgrupy zostaną poddanych procedurze izolacji kardiomiocytów metodą
enzymatyczną (Mackiewicz et al. 2000).
Izolowane kardiomiocyty lewej komory zostaną umieszczone w kamerze perfuzyjnej
znajdującej się na stoliku mikroskopu (Nikon). W każdym sercu zostaną zmierzone wymiary
(długość i szerokość) przynajmniej 30 przypadkowo wybranych kardiomiocytów w celu
oszacowania ich przerostu. Po pomiarach morfologicznych komórki będą perfundowane
normalnym płynem Tyroda i drażnione z częstotliwością 1Hz. Będzie rejestrowana
wewnątrzkomórkowa zmiana stężenia jonów Ca2+ w czasie (tzw. sygnał wapniowy) i skurcz
komórki.
Do rejestracji sygnału wapniowego użyjemy sondy fluorescencyjnej INDO-1. Sonda ta
przenika przez błonę i wiąże się z jonami Ca2+. Charakterystyka widma fluorescencji
emitowanej przez INDO-1 zależy od wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca2+. Zmiany
fluorescencji przetworzone na sygnał elektryczny przez fotopowielacze i fluorymetr
(Biomedical Instrumentation Group) odzwierciedlają zmiany wewnątrzkomórkowego
stężenia Ca2+ w czasie.
Skurcze rejestrowane będą przy pomocy układu w skład, którego wchodzi kamera TV
instalowana w bocznym porcie mikroskopu i detektor krawędzi komórki (UCLA Medical
Group). Zmiana położenia detektora podczas skurczu komórki jest miarą stopnia skrócenia
komórki. Można przyjąć, że stopień skrócenia komórki wbrew siłom jej przylegania do
podłoża jest wskaźnikiem jej zdolności do generowania siły.
Pomir czynności białek obiegu Ca2+
Czynność białek obiegu Ca2+ (SERCA, NCX, RyRs oraz PMCA) oraz zawartość Ca2+ w
siateczce sarkoplazmatycznej zostaną oszacowane przy użyciu protokołu przedstawionego na
Rycinie 2.
4
Komórki będą perfundowane normalnym płynem Tyroda (NT) i drażnione z częstotliwością 1
Hz. Będzie rejestrowany sygnał wapniowy. Następnie drażnienie będzie przerywane i
komórki będą perfundowane płynem Tyroda nie zawierającym jonów Na+ i Ca2+ (0Na0Ca) w
celu zablokowania wymiany NCX. W tym czasie będzie monitorowana fluorescencja
odzwierciedlająca spoczynkowe stężenie Ca2+ (F). Następnie podawana będzie kofeina, która
uwalnia zgromadzony w siateczce Ca2+, jednocześnie uniemożliwiając jego transport do
siateczki przez SERCA. Po rejestracji sygnału kofeinowego komórki będą kolejny raz
pobudzane elektrycznie, po czym kofeina będzie podawana powtórnie, tym razem na tle
normalnego płynu Tyroda (NT). Opadanie sygnału wapniowego w komórkach pobudzanych
elektrycznie jest spowodowane usuwaniem Ca2+ z cytoplazmy do siateczki i na zewnątrz
komórki odpowiednio przez SERCA, NCX i PMCA Opadanie sygnału wywołanego
podaniem kofeiny na tle perfuzji normalnym płynem Tyroda jest miarą transportu przez NCX
i PMCA (kofeina blokuje transport Ca2+ przez SERCA), a opadanie sygnału kofeinowego
wywołanego na tle perfuzji płynem 0Na0Ca jest realizowane tylko przez PMCA (kofeina
blokuje SERCA, płyn 0Na0Ca blokuje wymiennik NCX). Do opadającego zbocza sygnałów
zostaną dopasowane krzywe monoeksponencjalne opisane równaniem y=Ae-xr+B, gdzie „r”
jest stałą szybkości opadania krzywej. Za pomocą opisanej powyżej metody bezpośrednio
mierzona jest szybkość transportu Ca2+ przez PMCA (rPMCa) szybkość transportu przez NCX
jest obliczana ze wzoru rNCX = rSL-rPMCA, a szybkość transportu przez SERCA ze wzoru
rSERCA=rTOTAL - rSL. Metoda pomiaru czynności białek obiegu Ca2+ za pomocą parametru „r”
krzywych monoesponencjalnych dopasowywanych do opadającego zbocza sygnału
wapniowego została opisana przez Choi & Einer (1999).
Rycina 1
Indo-1 ratio
(405/495)
1.1
rPMCA
A
F
0.9
NT
0Na0Ca
0Na0Ca + Caffeine
60 s
rTOTAL
NT
rSL
NT+Caffeine
1s
Ryc. 1. Protokół pomiaru parametrów obiegu Ca 2+ w izolowanych kardiomiocytach lewej komory. Objaśnienia
w tekście
Szczelność receptorów rianodynowych (RyRs) zostanie oszacowana za pomocą metody
opisanej przez Shannon et al. (2003). Nieszczelne RyRs uwalniają Ca2+ nie tylko przed
skurczem ale również w fazie wypełniania siateczki i w komórce nie pobudzanej. W sytuacji
kiedy wyciekający z siateczki Ca nie może być usuwany na zewnątrz komórki przez NCX
(perfuzja płynem 0Na0Ca) prowadzi to do wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów
Ca2+ i zmiany fluorescencji INDO-1. Tak więc zmiana fluorescencji spoczynkowej F (Rycina
5
2) jest miarą ewentualnego wycieku Ca2+ z siateczki a tym samym miarą „szczzelności”
RyRs.
Zawartość Ca2+ w siateczce sarkoplazmatycznej zostanie oszacowana przez pomiar
amplitudy (A) sygnału kofeinowego wywołanego na tle płynu 0N0Ca (Rycina 2). Pod
wpływem kofeiny cały zgromadzony w siateczce Ca2+ jest z niej uwalniany do cytoplazmy i
w momencie wydzielenia nie jest usuwany z cytoplazmy (kofeina uniemożliwia wychwyt
przez SERCA a płyn 0Na0Ca blokuje odkomórkowy transport przez wymiennik NCX). Stąd
amplituda sygnału wapniowego aktywowanego w tych warunkach jest miarą zawartości Ca2+
w siateczce sarkoplazmatycznej.
III.8. Opracowanie statystyczne wyników
Na wstępie zostaną zbadana normalność rozkładów wyników uzyskanych w
poszczególnych grupach. W zależności od wyników analizy normalności porównania miedzy
grupami zostaną wykonane albo przy pomocy analizy wariancji i odpowiedniego testu post
hoc, lub przy pomocy testu Kruskala-Walice’a o odpowiedniego testu post hoc.
Za istotne statystycznie będą przyjmowane różnice przy p<0,05.
IV. Finansowanie projektu
Preparat żelaza (karboksymaltoza żelazowa) będzie dostarczona bezpłatnie. W Zakładzie
Fizjologii Klinicznej dysponujemy aparaturą do wykonania wszystkich zaplanowanych w
projekcie badań. Potrzebne odczynniki (koszt ok. 10.000 zł) zostaną zakupione z obecnie
realizowanych w Zakładzie grantów zewnętrznych. Zwierzęta do badań (ok. 100 szczurów koszt jednego szczura ok. 34 zł) zostaną zakupione z dotacji CMKP na utrzymanie potencjału
badawczego.
Nie będę ubiegać się o finansowanie powyższego projektu z dotacji na rozwój młodych
pracowników oraz uczestników studiów doktoranckich w CMKP
IV. Bibliografia
Avni T, Leibovici L, Gafter-Gvili A. 2012. Iron supplementation for the treatment of chronic heart failure and
iron deficiency: systematic review and meta-analysis. Eur J Heart Fail 14(4):423-9
Comin-Colet J, Enjuanes C, Gonzalez G, Torrens A, Cladellas M et al. 2013. Iron deficiency is a key
determinant of health-related quality of life in patients with chronic heart failure regardless of anaemia status.
Eur J Heart Fail 15(10):1164-72
Jankowska EA, Rozentryt P, Witkowska A, Nowak J, Hartmann O et al. 2010. Iron deficiency: an ominous sign
in patients with systolic chronic heart failure. Eur Heart J 31(15):1872-80
Jessup M, Brozena S. 2003. Heart Failure. N Engl J Med 348(20):2007-18
Leszek P, Sochanowicz B, Szperl M, Kolsut P, Brzoska K et al. 2012. Myocardial iron homeostasis in advanced
chronic heart failure patients. Int J Cardiol 159(1):47-52 (Abstr.)
Mackiewicz U, Emanuel K, Lewartowski B. Dihydropyridine receptors functioning as voltage sensors in cardiac
myocytes. J Physiol Pharmacol. 2000 Dec;51(4 Pt 2):777-98.
Maczewski M, Maczewska J. Hypercholesterolemia exacerbates ventricular remodeling in the rat model of
myocardial infarction. J Card Fail. 12, 399-405. 2006.
6
Dorobek naukowy Michał Mączewskiego za ostatnich 5 lat
Mackiewicz U, Gerges JY, Chu S, Duda M, Dobrzynski H, Lewartowski B, Mączewski M.
Ivabradine protects against ventricular arrhythmias in acute myocardial infarction in the rat. J
Cell Physiol. 2014 Jan; 229(6):813-23.
Yanni J, Maczewski M, Mackiewicz U, Siew S, Fedorenko O, Atkinson A, Price M,
Beresewicz A, Anderson RH, Boyett MR, Dobrzynski H. Structural and functional alterations
in the atrioventricular node and atrioventricular ring tissue in ischaemia-induced heart failure.
Histol Histopathol. 2013 Dec 25 (w druku)
Tulacz D, Mackiewicz U, Maczewski M, Maciejak A, Gora M, Burzynska B. Transcriptional
profiling of left ventricle and peripheral blood mononuclear cells in a rat model of
postinfarction heart failure. BMC Med Genomics. 2013 Nov 8;6:49.
Dobrzyn P, Pyrkowska A, Duda MK, Bednarski T, Maczewski M, Langfort J, Dobrzyn A.
Expression of lipogenic genes is upregulated in the heart with exercise training-induced but
not pressure overload-induced left ventricular hypertrophy. Am J Physiol Endocrinol Metab.
2013 Jun 15;304(12):E1348-58
Yanni J, Tellez JO, Maczewski M, Mackiewicz U, Beresewicz A, Billeter R, Dobrzynski H,
Boyett MR. Changes in Ion Channel Gene Expression Underlying Heart Failure-induced
Sinoatrial Node Dysfunction. Circ Heart Fail. 2011; 4: 496-508.
Mackiewicz U, Mączewski M, Klemenska E, Brudek M, Konior A, Czarnowska E,
Lewartowski B. Brief postinfarction calcineurin blockade affects left ventricular remodeling
and Ca2+ handling in the rat. J Mol Cell Cardiol 2010, 48: 1307-15.
Nowis D, Mączewski M, Mackiewicz U, Kujawa M, Ratajska A, Więckowski M, Wilczyński
GM, Malinowska M, Bil J, Salwa P, Bugajski M, Wójcik C, Siński M, Abramczyk P,
Winiarska M, Dąbrowska-Iwanicka A, Duszyński J, Jakóbisiak M, Golab J. Cardiotoxicity of
the anticancer therapeutic agent bortezomib. Am J Pathol, 2010; 176:2658-2668.
Mackiewicz U, Mączewski M, Konior A, Tellez JO, Nowis D, Dobrzynski H, Boyett MR,
Lewartowski B. Sarcolemmal Ca2+-ATPase ability to transport Ca2+ gradually diminishes
after myocardial infarction in the rat. Cardiovasc Res 2009, 81: 546-554.
Stec R, Grala B, Mączewski M, Bodnar L, Szczylik C. Chromophobe renal cell cancer-review of the literature and potential methods of treating metastatic disease. J Exp Clin
Cancer Res. 2009 Oct 7;28:134.
7