Rozwój bakteriofagów T4D, T4rI i T4rIII w głodzonych bakteriach

advertisement
Czy jest coś, czego się nie da
zrobid z bakteriofagiem?
Przegląd moich tematów
badawczych
Marcin Łoś
Katedra Biologii Molekularnej
Uniwersytet Gdaoski
Czym jest bakteriofag?
http://micro.magnet.fsu.edu/cells/virus.html
hu.cnsi.ucsb.edu
Fagi…
… są wszędzie…
…tam, gdzie istnieją organizmy żywe!
Najliczniejsze organizmy żywe na ziemi
to bakterie…
… ale wirusy są około 10x bardziej liczne
Zdecydowana ich większośd jest dla nas
nieszkodliwa. Są za to zabójcze dla bakterii
Szacowana ilośd cząstek wirusowych wynosi
na całej Ziemi 1031
Gdyby je ułożyd w jednym rzędzie utworzyłyby
linię 1013 razy dłuższą niż średnia odległośd
Ziemi od Słooca
Cykl infekcyjny bakteriofagów
www.celsalive.com
Rozwój bakteriofagów w
warunkach powolnego wzrostu
komórek gospodarza
Głodzone komórki bakteryjne
• Znacznie obniżona wydolnośd aparatu
biosyntezy białek
• Mniejszą objętośd komórek
• Większa odpornośd na uszkodzenia przez np.
antybiotyki, chloroform
• Namnażanie się faga ograniczone lub całkiem
zastopowane
Czemu takie badania są istotne?
• Wzrost bakterii używanych w wielu procesach
przemysłowych jest spowolniony – wynika to
głownie ze względów technologicznych
• Bakteriofagi są jednym z głównych zagrożeo
procesów biotechnologicznych opartych na
bakteriach
Procesy przemysłowe oparte na
bakteriach
Hodowle ciągłe
bakterii w
chemostatach:
• Stała objętość
hodowli.
• Czas generacji jest
uzależniony tylko od
tempa wymiany
pożywki w
chemostacie, a nie od
stężenia substancji
odżywczej
Rozwój bakteriofagów w
procesie biofermentacji
.
Funkcje kontrolowane
automatycznie:
• Pomiar DOT, pH, temperatury,
• Utrzymywanie stałego pH,
temperatury i dozowanie pożywki
• Sterowanie szybkością mieszania
przestawione na manualne w celu
zwiększenia kontroli nad przebiegiem
fermentacji
Funkcje kontrolowane manualnie:
• Pomiar OD
• Dostosowywanie prędkości
mieszania
• Dostosowywanie szybkości
przepływu powietrza
• Dozowanie substancji przeciwdziałającej
pienieniu się hodowli
Rola genów rI i rIII w rozwoju
bakteriofaga T4
Różnice w ekspresji białek w trakcie zakażenia
fagami T4D, T4rI i T4rIII
Bakteriofag T4 w głodzonych
kulturach bakteryjnych
1,0E+06
Phage titer
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
0
10
30
40
50
40
50
Time (days)
1,0E+06
Titer of infected bacteria
20
1,0E+05
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
0
10
20
30
Time (days)
• Miano fagów i
bakterii w
głodzonych
kulturach E. coli
MG1655
zakażonych
fagami T4D
(romby) T4rI
(trójkąty) i T4rIII
(kwadraty)
Jakie są powody różnic w poziomie
fagów w infekowanych hodowlach?
• Brak rozwoju mutantów T4rI i T4rIII w
głodzonych komórkach przy jednoczesnym
rozwoju T4D umożliwiającym podtrzymanie
populacji?
• Zróżnicowana adsorpcja mutantów i szczepu
dzikiego?
• Kombinacja obu?
• …?
Normalized free phage
Adsorpcja fagów na komórkach
gospodarza
•
1
0,1
0,01
0
5
10
15
20
25
30
35
Normalized free phage
Time (min)
1
0,1
0,01
0
5
10
15
20
Time (min)
25
30
35
Adsorpcja fagów ze
zwykłego lizatu
(romby) i lizatu
pasażowanego przez
hodowle głodzone
(kwadraty) na
komórkach
głodzonych (panel
górny) i rosnących
(dolny) w 30°C
Badania egzopolisacharydu w
biofilmach bakteryjnych
Budowa biofilmu
http://www3.niaid.nih.gov
Znaczenie biofilmu
• Szkody w procesach przemysłowych
• Duże znaczenie w patogenezie
(mukopolisacharydoza, rany, zapalenie
wsierdzia)
• Łatwa kolonizacja powierzchni (implanty i
endoprotezy, cewniki)
Cele projektu
• Optymalizacja metod hodowli biofilmów
bakteryjnych
• Dostarczenie dużych ilości materiału bogatego
w EPS
• Określenie struktury EPS produkowanych
przez różne gatunki bakterii
Metagenomiczne poszukiwanie
aktywności przeciwbakteryjnych i
przeciwbiofilmowych w
populacjach fagowych
Aktywności przeciwbakteryjne
• Ze względu na charakterystykę cyklu
życiowego fagów geny o działaniu
przeciwbakteryjnym (lizyny, lizozymy, holiny,
inhibitiory biosyntezy ściany komórkowej)
stanowią duży procent ich genomów
Aktywności przeciwbiofilmowe
• Naturalne populacje bakteryjne występują
często w postaci biofilmu, który jest fizyczna
barierą uniemożliwiającą penetrację m.in.
przez wirusy
• Niektóre fagi wytworzyły w odpowiedzi
enzymy degradujące EPS (egzopolisacharyd).
Enzymy takie mogą byd zasocjowane z
kapsydem, lub wydzielane przez lizujące
komórki bakteryjne
Czemu takie aktywności są cenne?
• Alternatywa dla antybiotyków, szczególnie w
leczeniu miejscowym
• Poznanie mechanizmów działania
przeciwbakteryjnego
• Niszczenie biofilmów istotne w przemyśle,
służbie zdrowia oraz leczenia niektórych
chorób
Cele projektu
• Znalezienie w ekspresyjnych bibliotekach
genowych jak największej ilości genów
godujących interesujące nas aktywności
• Scharakteryzowanie wybranych genów
• Analiza bioinformatyczna sekwencji w celu
ustalenia pokrewieostwa wybranych genów z
sekwencjami zdeponowanymi w bazach
danych
Rozwój bakteriofagów
kodujących geny toksyn Shiga
Bakteriofagi jako czynniki
patogenności
• Poza bakteriobójczym działaniem bakteriofagi
mogą również odpowiadad za zmianę
fenotypu bakterii chorobotwórczych
• Ze względu na szerokie spektrum gospodarzy
mogą zapewnid horyzontalny transfer genów
między gatunkami bakterii
• Poznanie mechanizmów regulacji rozwoju
fagów oraz regulacji aktywności genów stx
może mied duże znaczenie dla zrozumienia
patogenezy zakażeo.
Indukcja H2O2
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–
27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Indukcja mitomycyną C
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta
tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Indukcja norfloksacyną
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–
27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Indukcja szokiem solnym
Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty–
27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox
Bakteriofagi jako składniki
systemu detekcji bakterii
Czy fagi mogą zastąpid
przeciwciała?
Shabani et al. Anal. Chem., 2008, 80, 9475–9482
Czy są jakieś zalety stosowania
fagów zamiast przeciwciał?
• Fagi maja zwykle znacznie stabilniejsze
domeny odpowiadające za oddziaływanie z
bakterią
• Są tanie w produkcji i stosunkowo łatwe w
izolacji
• Występują fagi zarówno o bardzo szerokich
spektrach gospodarza, jak i bardzo waskich, co
umożliwia dobranie specyficzności faga do
danego testu.
Czy to działa?
1,600
Ilośd faga/test
1,400
1,200
1,00E+08
1,00E+07
OD 405 nm
1,000
1,00E+06
1,00E+05
0,800
1,00E+04
1,00E+03
0,600
kontrola bez przeciwciał biotynylowanych
kontrola bez surowicy
0,400
kontrola bez bakterii
0,200
kontrola bez faga
0,000
T4D
λcIb2
P1vir
O1
-0,200
ilość faga na studzienkę
• Ilośd bakterii/test
0,450
0,400
0,350
1,00E+08
1,00E+07
0,300
OD 405 nm
1,00E+06
0,250
1,00E+05
1,00E+04
0,200
1,00E+03
kontrola bez przeciwciał biotynylowanych
0,150
kontrola bez surowicy
0,100
kontrola bez bakterii
kontrola bez faga
0,050
0,000
O1
T4D
λcIb2
-0,050
ilość bakterii na studzienkę
P1vir
Wykorzystanie bakteriofagów w
hodowli i domieszkowaniu
kryształów
Fagi filamentarne
hu.cnsi.ucsb.edu
www.ncbi.nlm.nih.gov
Rozmiary faga: grubość – 6-7 nm
Długość: 900 nm
Phage display
hu.cnsi.ucsb.edu
• Bakteriofagi filamentarne i ogoniaste
umożliwiają modyfikacje niektórych
składników kapsydu
• Pozwala to na produkcje dużych ilości ściśle
zdefiniowanych peptydów, które są
eksponowane na zewnątrz wirusa
Po co?
• Zastosowao jest wiele – od produkcji
sztucznych przeciwciał do nanostruktur
• Możliwe jest tworzenie fagów o mieszanym
składzie wiążącym różne elementy
• Po opłaszczeniu faga np. koloidalnymi
zawiesinami metali lub ich związków
uzyskujemy wysoko zorganizowane
nanostruktury
• Ze wstępnych badao wynika, że użycie fagów
eksponujących sekwencje wiążące takie
związki może katalizowad ich krystalizacje
• Dzięki możliwościom techniki phage display
takie kryształy mogą byd precyzyjnie
domieszkowane wybranymi związkami lub
pierwiastkami
• Wystarczy wyselekcjonowad peptydy, które je
wiążą
Mgr Joanna Łoś
Mgr Agata Jurczak
Mgr Piotr Golec
Mgr Magdalena Jakubowska
Prof. Grzegorz Węgrzyn
dr hab. Borys Wróbel
Prof. UG dr hab. Janusz Madaj
Prof. Andrzej Kłonkowski
Prof. Peter Neubauer
(Uniwersytet w Oulu,
Finlandia)
Download
Random flashcards
bvbzbx

2 Cards oauth2_google_e1804830-50f6-410f-8885-745c7a100970

Motywacja w zzl

3 Cards ypy

Create flashcards