Rozwój bakteriofagów T4D, T4rI i T4rIII w głodzonych bakteriach
advertisement
Czy jest coś, czego się nie da zrobid z bakteriofagiem? Przegląd moich tematów badawczych Marcin Łoś Katedra Biologii Molekularnej Uniwersytet Gdaoski Czym jest bakteriofag? http://micro.magnet.fsu.edu/cells/virus.html hu.cnsi.ucsb.edu Fagi… … są wszędzie… …tam, gdzie istnieją organizmy żywe! Najliczniejsze organizmy żywe na ziemi to bakterie… … ale wirusy są około 10x bardziej liczne Zdecydowana ich większośd jest dla nas nieszkodliwa. Są za to zabójcze dla bakterii Szacowana ilośd cząstek wirusowych wynosi na całej Ziemi 1031 Gdyby je ułożyd w jednym rzędzie utworzyłyby linię 1013 razy dłuższą niż średnia odległośd Ziemi od Słooca Cykl infekcyjny bakteriofagów www.celsalive.com Rozwój bakteriofagów w warunkach powolnego wzrostu komórek gospodarza Głodzone komórki bakteryjne • Znacznie obniżona wydolnośd aparatu biosyntezy białek • Mniejszą objętośd komórek • Większa odpornośd na uszkodzenia przez np. antybiotyki, chloroform • Namnażanie się faga ograniczone lub całkiem zastopowane Czemu takie badania są istotne? • Wzrost bakterii używanych w wielu procesach przemysłowych jest spowolniony – wynika to głownie ze względów technologicznych • Bakteriofagi są jednym z głównych zagrożeo procesów biotechnologicznych opartych na bakteriach Procesy przemysłowe oparte na bakteriach Hodowle ciągłe bakterii w chemostatach: • Stała objętość hodowli. • Czas generacji jest uzależniony tylko od tempa wymiany pożywki w chemostacie, a nie od stężenia substancji odżywczej Rozwój bakteriofagów w procesie biofermentacji . Funkcje kontrolowane automatycznie: • Pomiar DOT, pH, temperatury, • Utrzymywanie stałego pH, temperatury i dozowanie pożywki • Sterowanie szybkością mieszania przestawione na manualne w celu zwiększenia kontroli nad przebiegiem fermentacji Funkcje kontrolowane manualnie: • Pomiar OD • Dostosowywanie prędkości mieszania • Dostosowywanie szybkości przepływu powietrza • Dozowanie substancji przeciwdziałającej pienieniu się hodowli Rola genów rI i rIII w rozwoju bakteriofaga T4 Różnice w ekspresji białek w trakcie zakażenia fagami T4D, T4rI i T4rIII Bakteriofag T4 w głodzonych kulturach bakteryjnych 1,0E+06 Phage titer 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 0 10 30 40 50 40 50 Time (days) 1,0E+06 Titer of infected bacteria 20 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 0 10 20 30 Time (days) • Miano fagów i bakterii w głodzonych kulturach E. coli MG1655 zakażonych fagami T4D (romby) T4rI (trójkąty) i T4rIII (kwadraty) Jakie są powody różnic w poziomie fagów w infekowanych hodowlach? • Brak rozwoju mutantów T4rI i T4rIII w głodzonych komórkach przy jednoczesnym rozwoju T4D umożliwiającym podtrzymanie populacji? • Zróżnicowana adsorpcja mutantów i szczepu dzikiego? • Kombinacja obu? • …? Normalized free phage Adsorpcja fagów na komórkach gospodarza • 1 0,1 0,01 0 5 10 15 20 25 30 35 Normalized free phage Time (min) 1 0,1 0,01 0 5 10 15 20 Time (min) 25 30 35 Adsorpcja fagów ze zwykłego lizatu (romby) i lizatu pasażowanego przez hodowle głodzone (kwadraty) na komórkach głodzonych (panel górny) i rosnących (dolny) w 30°C Badania egzopolisacharydu w biofilmach bakteryjnych Budowa biofilmu http://www3.niaid.nih.gov Znaczenie biofilmu • Szkody w procesach przemysłowych • Duże znaczenie w patogenezie (mukopolisacharydoza, rany, zapalenie wsierdzia) • Łatwa kolonizacja powierzchni (implanty i endoprotezy, cewniki) Cele projektu • Optymalizacja metod hodowli biofilmów bakteryjnych • Dostarczenie dużych ilości materiału bogatego w EPS • Określenie struktury EPS produkowanych przez różne gatunki bakterii Metagenomiczne poszukiwanie aktywności przeciwbakteryjnych i przeciwbiofilmowych w populacjach fagowych Aktywności przeciwbakteryjne • Ze względu na charakterystykę cyklu życiowego fagów geny o działaniu przeciwbakteryjnym (lizyny, lizozymy, holiny, inhibitiory biosyntezy ściany komórkowej) stanowią duży procent ich genomów Aktywności przeciwbiofilmowe • Naturalne populacje bakteryjne występują często w postaci biofilmu, który jest fizyczna barierą uniemożliwiającą penetrację m.in. przez wirusy • Niektóre fagi wytworzyły w odpowiedzi enzymy degradujące EPS (egzopolisacharyd). Enzymy takie mogą byd zasocjowane z kapsydem, lub wydzielane przez lizujące komórki bakteryjne Czemu takie aktywności są cenne? • Alternatywa dla antybiotyków, szczególnie w leczeniu miejscowym • Poznanie mechanizmów działania przeciwbakteryjnego • Niszczenie biofilmów istotne w przemyśle, służbie zdrowia oraz leczenia niektórych chorób Cele projektu • Znalezienie w ekspresyjnych bibliotekach genowych jak największej ilości genów godujących interesujące nas aktywności • Scharakteryzowanie wybranych genów • Analiza bioinformatyczna sekwencji w celu ustalenia pokrewieostwa wybranych genów z sekwencjami zdeponowanymi w bazach danych Rozwój bakteriofagów kodujących geny toksyn Shiga Bakteriofagi jako czynniki patogenności • Poza bakteriobójczym działaniem bakteriofagi mogą również odpowiadad za zmianę fenotypu bakterii chorobotwórczych • Ze względu na szerokie spektrum gospodarzy mogą zapewnid horyzontalny transfer genów między gatunkami bakterii • Poznanie mechanizmów regulacji rozwoju fagów oraz regulacji aktywności genów stx może mied duże znaczenie dla zrozumienia patogenezy zakażeo. Indukcja H2O2 Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox Indukcja mitomycyną C Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox Indukcja norfloksacyną Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox Indukcja szokiem solnym Wypełnione kółka– lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24B, trójkąty– 27delta tox, wypełnione kwadraty– 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox Bakteriofagi jako składniki systemu detekcji bakterii Czy fagi mogą zastąpid przeciwciała? Shabani et al. Anal. Chem., 2008, 80, 9475–9482 Czy są jakieś zalety stosowania fagów zamiast przeciwciał? • Fagi maja zwykle znacznie stabilniejsze domeny odpowiadające za oddziaływanie z bakterią • Są tanie w produkcji i stosunkowo łatwe w izolacji • Występują fagi zarówno o bardzo szerokich spektrach gospodarza, jak i bardzo waskich, co umożliwia dobranie specyficzności faga do danego testu. Czy to działa? 1,600 Ilośd faga/test 1,400 1,200 1,00E+08 1,00E+07 OD 405 nm 1,000 1,00E+06 1,00E+05 0,800 1,00E+04 1,00E+03 0,600 kontrola bez przeciwciał biotynylowanych kontrola bez surowicy 0,400 kontrola bez bakterii 0,200 kontrola bez faga 0,000 T4D λcIb2 P1vir O1 -0,200 ilość faga na studzienkę • Ilośd bakterii/test 0,450 0,400 0,350 1,00E+08 1,00E+07 0,300 OD 405 nm 1,00E+06 0,250 1,00E+05 1,00E+04 0,200 1,00E+03 kontrola bez przeciwciał biotynylowanych 0,150 kontrola bez surowicy 0,100 kontrola bez bakterii kontrola bez faga 0,050 0,000 O1 T4D λcIb2 -0,050 ilość bakterii na studzienkę P1vir Wykorzystanie bakteriofagów w hodowli i domieszkowaniu kryształów Fagi filamentarne hu.cnsi.ucsb.edu www.ncbi.nlm.nih.gov Rozmiary faga: grubość – 6-7 nm Długość: 900 nm Phage display hu.cnsi.ucsb.edu • Bakteriofagi filamentarne i ogoniaste umożliwiają modyfikacje niektórych składników kapsydu • Pozwala to na produkcje dużych ilości ściśle zdefiniowanych peptydów, które są eksponowane na zewnątrz wirusa Po co? • Zastosowao jest wiele – od produkcji sztucznych przeciwciał do nanostruktur • Możliwe jest tworzenie fagów o mieszanym składzie wiążącym różne elementy • Po opłaszczeniu faga np. koloidalnymi zawiesinami metali lub ich związków uzyskujemy wysoko zorganizowane nanostruktury • Ze wstępnych badao wynika, że użycie fagów eksponujących sekwencje wiążące takie związki może katalizowad ich krystalizacje • Dzięki możliwościom techniki phage display takie kryształy mogą byd precyzyjnie domieszkowane wybranymi związkami lub pierwiastkami • Wystarczy wyselekcjonowad peptydy, które je wiążą Mgr Joanna Łoś Mgr Agata Jurczak Mgr Piotr Golec Mgr Magdalena Jakubowska Prof. Grzegorz Węgrzyn dr hab. Borys Wróbel Prof. UG dr hab. Janusz Madaj Prof. Andrzej Kłonkowski Prof. Peter Neubauer (Uniwersytet w Oulu, Finlandia)
