OCENA STANU ODPORNOŚCI OWADÓW

advertisement
OCENA STANU
ODPORNOŚCI
OWADÓW
Marek Chmielewski
ODPORNOŚĆ
• Wrodzona lub nabyta niewrażliwość,
względnie zmniejszona podatność
organizmu, na czynniki szkodliwe
identyfikowane jako „nie własne”
(non-self), uwarunkowana
genetyczną konstytucją ustroju
oraz szeregiem mechanizmów
obronnych natury komórkowej i
humoralnej.
ODPORNOŚĆ
PRZECIWZAKAŹNA
• organizmu na choroby wywołane przez
drobnoustroje. Odczyny obronne
powodują likwidację, unieszkodliwienie lub
zniszczenie patogenu.
•
W rozważaniach nad odpornością bezkręgowców,
obydwie definicje są wykorzystywane, niekiedy
wzajemnie się uzupełniają.
MECHANIZMY WSPÓLNE
DLA WIELU GRUP
ZWIERZĄT
• Rozpoznanie self or non self
• Fagocytoza
• Aktywność bakteriobójcza enzymów
lizosomalnych fagocytów
• Aktywnośc typu lizozymu lub lysozymelike
• Obecność substancji przekaźnikowych
(cytokiny, chemokiny)
CHARAKTERYSTYKA
ODPORNOŚCI
BEZKRĘGOWCÓW
• nie jest związana z limfocytami B, T i Ig
• baza materialna (immunocyty, ciało
tłuszczowe)
• pojawia się szybko (godziny, dni)
• trwa krótko
• odporność nabyta nie występuje u wszystkich
grup
• wyjątkowo cechuje się swoistością
• z reguły brak pamięci immunologicznej
MECHANIZMY ODPORNOŚCI
BEZKRĘGOWCÓW
wspólne dla wszystkich grup
charakterystyczne dla
większości bezkręgowców
charakterystyczne dla typu lub
gromady bezkręgowców
W wyniku:
 zakażeń wirusowych i bakteryjnych
 inwazji pasożytniczych
 pod wpływem stresu (temperaturowy, pokarmowy,
socjobiologiczny)
ulega zaburzeniu odporność wewnętrzna owadów
uwarunkowana działaniem humoralnych i
komórkowych mechanizmów odporności.
Zaburzenia odporności mogą zostać spowodowane
również:
 stosowaniem pewnych leków
 nieodpowiednimi sposobami ich aplikacji
ODPORNOŚĆ PRZECIWZAKAZNA
Fizjologiczna
(wrodzona)
1. Przeciwzakaźne
bariery anatomicznofizjologiczne
2. Odporność sekrecyjna
3. Odporność
behawioralna
4. Mechanizmy
odporności
wewnętrznej
Nabyta
(indukowana)
Cekropiny
Attacyny
Cecropin likesubstances
Apidycyny
Abacyna
PRZECIWZAKAŹNE BARIERY
ANATOMICZNO-FIZJOLOGICZNE
 Okrywa ciała

Układ tchawkowy
 Bariery przeciwzakaźne przewodu
pokarmowego
 Mechanizmy odporności
przeciwzakaźnej przedżołądka
 Mechanizmy środowiska biochemicznego
jelita środkowego
 Antybioza i kompetycja bakteryjna
 Błona perytroficzna jelita
 Ściana jelita środkowego
Odporność sekrecyjna
 Mleczko pszczele
 Kit pszczeli (propolis)
 Układ antybiotyczny miodu
 Układ antybiotyczny nektaru
 Układ antybiotyczny pyłku
Odporność behawioralna
 Wykrywanie chorych i martwych osobników, usuwanie
z ula, czyszczenie plastrów (hygenic behaviour) 2
recesywne geny
 Oczyszczanie (cleanining behaviour) –
samooczyszczania (self cleaning), taniec oczyszczający
(grooming dance) i oczyszczania grupowe (group cleaning)
 Rójka
 Mechanizmy chrponiące czerw przed zakażeniem
Mechanizmy odporności wewnętrznej
KOMÓRKOWE
HUMORALNE
FAGOCYTOZA
Lizozym
INKAPSULACJA
Układ fenylooksydazy
NODULACJA
Lektyny
Humoralna inkapsulacja
Aktywność zbliżona do
dopełniacza
KOAGULACJA HEMOLIMFY
MELANIZACJA KRWI
Lizozym
• Muramidaza, N-acetylomuramylhydrolaza
(EC.3.2.1.1.7) - eznym rozkładający wiązania endo
beta (1—4) pomiędzy kwasem N-acetylomuraminowym
i N-acetyloglu-kozaminą ściany komórkowej bakterii
gram dodatnich.
• Lizozym jest białkiem zasadowym o punkcie
izoelektrycznym 10,5—1,0 i masie cząsteczkowej około
15 000 stabilnym w kwaśnym pH w wyższych
temnpratu-rach, a ulegającym inaktywacji w
zasadowym pH.
Lizozym
• Powoduje on lizę zawiesiny
Micrococcus lysodeikticus z
następowym uwalnianiem cukrów
redukujących i aminokwasów.
• Enzym ten działa przeciwbakteryjnie
na bakterie gram dodatnie takie jak:
M. lysodeikticus, Sarcina lutea
i
Bacillus subtilis
Lizozym
• Fizjologiczny poziom lizozymu wynosi w
hemolimfie larw Apis mellifera od 5,0 do
10,0 (ug/ml) poczwarek i imago od 5,0 do
25,0 ug/ml). Ten niski wrodzony poziom
lizozymu wzrasta kilkakrotnie po
zakażeniach i pod wpływem działania
stresu, osiągając maksymalne wartości po
24-48 godzinach.
Lizozym
• Uważa się, że u owadów lizozym jest jednym
z głównych czynników odporności humoralnej
o działaniu bakteriobójczym. Jest on
syntetyzowany de novo w ciele tłuszczowym.
U owadów holometabolicznych lizozym
współdziała z cekropinami i atacynami w
likwidacji zakażeń bakteryjnych. Ze względu
na fakt, że poziom lizozymu jest pewnym
odzwierciedleniem stanu odporności
humoralnej owadów, określanie jego
aktywności jest wykorzystywane w ocenie
stanu odporności.
Określanie aktywności
lizozymu metodą biologiczną
• Próbki hemolimfy (5 ug)
dodaje się do 25 ug płynu
fizjologicznego zawierającego
kryształek fenylotiomocznika,
a następnie wkrapla się do
baseników wyciętych w żelu
agarozowym w ilości 7,5 ug.
Określanie aktywności
lizozymu metodą biologiczną
• Żel sporządza się dodając do 9
ml buforu Sorensena (0,062 M,
pH 6,4) zawiesinę o składzie: 1
ml buforu Sorensena, 75 mg
zliofilizowanych komórek Micrococcus lysodeikticus i 300
mg oxytetracykliny, dokładnie
roztartą.
Określanie aktywności
lizozymu metodą biologiczną
• Następnie do tak uzyskanego
roztworu, po ogrzaniu dodaje się
0,1 g agarozy i wylewa na płytki
(grubość żelu 2,5—3,0 mm). Po
zestaleniu żelu wycina się baseniki
o pojemności 7,5 µg. Płytki z
wypełnionymi basenikami
inkubuje się w 28°C przez 24
godziny.
Określanie aktywności
lizozymu metodą biologiczną
• Aktywność lizozymu ocenia się
z krzywej regresji na
podstawie wielkości strefy
przejaśnienia (bakteriolizy)
mnożąc uzyskane wyniki przez
6 (współczynnik rozcieńczenia
hemolimfy).
Określanie aktywności
lizozymu metodą biologiczną
• Krzywą regresji sporządza się dla
następujących stężeń lizozymu:
15,62; 7,81; 3,9; 1,8; 0,9; 0,45;
0,22 (yg lizozymu białka jaja
kurzego/ /mililitr), odcinając na
osi x stężenie lizozymu w µg/ml
zaś na osi y średnią strefy
bakteriolizy w milimetrach.
Hemolimfa
Złożona z osocza i hemocytów nie bierze udziału w
wymianie gazowej:
 Rezerwuar wody
 Środek transportu dla składników
pokarmowych i produktów przemiany materii
 Hormonu i enzymy
 Działa buforująco
 Warunkuje turgor ciała,
 procesy krzepnięcia krwi i reparacji ran
 Odtoksycznia wiele związków biologicznie
czynnych
Hemolimfa

Jest środowiskiem dla hemocytów,
polipeptydów i białek odpowiedzialnych
za odporność komórkową i humoralną
Hemolimfa
Stanowi od 25 do 30 % masy ciała, np.. 116
µl u poczwarki robotnic z brązowymi oczami i
160 ml u poczwarki trutnia, 30 – 40 µl u świeżo
wygryzionych pszczół, 19 u pszczół ulowych i 16
µl u zbieraczek.
 Ciężar właściwy:
Robotnica 1,038 – 1,045
Truteń 1,050
Matka 1,051

Hemolimfa
Odczyn zbliżony do obojętnego :
Czerw – 6,77 do 6,93
Imago – 6,7
Zdolność buforująca bardzo niska
nieznacznie przekracza zdolność
buforyjącą wody
Hemolimfa
Zmienny skład w zależności od:
 Wieku,
 Grupy osobniczej (kasty)
 Płci
 Stadium rozwojego
 Diety
 Głodzenia
Hemolimfa
Profil białek hemolimfy
THC
Zdrowie
choroba
DHC
Egzoproteinazy
bakteryjne
Egzoproteinazy
pasożytnicze
Leki
Hemolimfa - pobieranie



Czerw (larwy)– ostrożnie wyjąć z komórki
plastra, położyć na szkiełko podstawowe,
naciąć naskórek (np. b. cienka igła) i
pobierać mikropipetą
Przedpoczwarki, poczwarki i dorosłe –
dekapitacja i lekkie uciśnięcie tułowia
Poczwarki i imago – zatoka grzbietowa,
między 3 a 4 tergitem odwłoka po stronie
grzbietowej
Hemolimfa - rozmaz




Po pobraniu do kapilary przenosi się na
szkiełko podstawowe
Rozmaz krawędzią nakrywkowego
Schnie w temperaturze pokojowej
Szkiełka odtłuszczane w mieszaninie
96% etanolu i eteru do narkozy (1:1)
Hemolimfa - barwienie





Wyschnięty preparat zalewa się 2-3 ml barwnika
Wrighta na 1 minutę
Dodaje się identyczną objętość buforu fosforanowego
(KH2PO4 – 3, 315 g, Na HPO – 1,28 g, woda
destylowana – 500,00 ml, miesza się do pojawienia
się metalicznego połysku na powierzchni barwnika z
buforem
Po 2-3 minutach od dodania buforu powierzchnię
preparatu zmywa się szybko wodą bieżącą
Uwaga! Nadmierne zmywanie odbarwia preparat
Wysuszyć i oglądać pod imersją przy pow. co
najmniej 700 x.
Hemocyty



Wywodzą się z mezodermy zarodka
Równowaga pomiędzy pojawianiem się
nowych i zamieraniem starych
Równowaga pomiędzy hemocytami
krążącymi a osiadłymi senssile
haemocytes)
Hemocyty



Wywodzą się z komórki pnia (stem cell) prohemocytu
(podstawowa komórka hemolimfy)
Prohemocyty skupione wzdłuż przedniego odcinka
grzbietowego naczynia krwionośnego wykształcają
plazmatocyty i (?) komórki sferyczne
Rozplem i diferencjacja hemocytów w hemolimfie
głównie przez podziały mitotyczne związane z
rozowojem osobniczym, tuż przed kolejną zmianą
stadium wzrosta THC (obserwowane również u
imago)
Hemocyty
Układ endokrynalny owada (głównie
ekdyson)
Wzajemne stosunki
pomiędzy typami
hemocytów
Wielkość indeksu
mitotycznego
Przechodzenie z
narządów
hemopoetycznych
do hemolimfy
Mobilizacja komórek
osiadłych
Hemocyty – Ciało tłuszczowe



Pochodzenia mezodermalnego
Wielkość zmienna wraz z rozwojem
larwalnym – najwięcej komórek u larw 2
– 3 dniowych
U pszczoły dorosłej jest cienką
warstewka wyściełającą od wewnątrz
ścianę odwłoka(zatoka krwionośna
grzbietowa i brzuszna)
Hemocyty – Ciało tłuszczowe
prohemocyt
plazmatocyt
Komórka
sferyczna
Komorka ziarnista
cystosyt
Hemocyty - identyfikacja
Klasyfikacje:
 Jonesa (1962) – 9 typów hemocytów
 Ville i Vecchi (1966) - 8 typów
 Gilliam i Shimanuki (1971) – 7 typów
obecnych w hemolimfie i 2 typy
komórek pnia – enocyty i komórki
perikardialne
PROLEUKOCYT
3,4 - 6,0 µ
Jądro: jasnoniebieskie
Cytoplazma: niebieska
Neutrofil
3,0 – 7,0 µ
Jadro: ciemnoniebieskie ziarniste Cytoplazma: niewidoczna
Eozynofil
3,0 – 6,0 µ
Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: jasnoróżowa
Bazofil 2,0 – 4,5 µ
Jądro: ciemnopurpurowa Cytoplazma: praktycznie niewidoczna
Leukocyt normalny
3,0 – 7,0 µ
Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: niebieska
Pyknoleukocyt
12-18 x 2,5- 7,5 µ
Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: lekko różowa
Hialinocyt
7 – 11 x 3,5 – 7,0 µ
Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: lekko różowa
Reakcje między komórkami
immunoreaktywnymi
Owady – hemokiny przekaźnikami informacji między
immunocytami

TNF (czynnik martwicy nowotworów – reguluje
niekóre odczyny immunologiczne

TNF wspólnie z gallizyną 2 kontroluje utrzymanie
integralności ciała owada (wzrost, zranienia)



Gallizyna 2 wraz z plazmatocytami współdziała:
w fagocytowaniu uszkodzonych komórek ciała
w gojeniu ran i tworzeniu nowych tkanek
Model aktywności hemokin
owada
Odczyny
komórkowe
1. Adherencja
2. 2.Fagocytoza
3. Nodulacja
zakażenie
hemocyty
Aktywowane
hemocyty
Aktywność
1. Lizozymu
2. Układu oksydazy
polifenolowej
Regulacja
Kontrola
nowotworzenia
Przebudowa
tkanek
Uszkadzanie
komórek
HEMOKINY
Ciało tłuszczowe
Po;ipeptydy i białka bakteriobójcze
Rola hemocyta ziarnistego
owada
Apidycyny
Lizozym bakteriocydia
bakteriocydia
Fagocytoza
Nodulacja i
inkapsulacja
Koagulogeny
Krzepnięcie
hemolimfy
Profenylooksyda
za
Lektyny
rozpoznawanie
rozpoznawanie
Fagocytoza
• Fagocytoza jest to proces, polegający
na pochłanianiu, niszczeniu lub
sekwestracji substancji obcych dla:
organizmu owada, które przedostały
się do jego hemocelu. U owadów
przebiega ona w kilku etapach:
chemotaksja, adherencja,
pochłanianie i trawienie.
Fagocytoza
• Stanowi ona jeden z głównych
mechanizmów komórkowego ramienia
odporności owadów, w którym
zaangażowane są wyspecjalizowane
komórki krwi owadów.
Fagocytoza-Typy hemocytów
zaangażowane w reakcjach
odpornościowych
Odporność
komórkowa
Plazmatocyty
Koagulacja Trefocytoza 0dkładanie substancji obcych,
transport produktów
krwi
przemiany materii,
odtoksycznianie związków
biologicznie czynnych
Cystocyty
Adipohemocyty podocyty
Prohemocyty
Hemocyty
ziarniste
Hemocyty
ziarniste
Adipohemocyty
Fagocytoza
• Fagocytoza ulega zwiększeniu w
początkowych fazach zakażenia, wybitnie
spada w niektórych inwazjach
pasożytniczych, np. w przebiegu warozy.
• Wgląd w aktywność fagocytarną hemocytów
daje indeks fagocytarny, który wskazuje na
średnią liczbę bakterii pochłoniętych przez 1
hemocyt obdarzony zdolnością fagocytarną.
Określanie wartości indeksu fagocytarnego
wykorzystuje się powszechnie w ocenie
efektywności komórkowego ramienia
odporności owadów.
Fagocytoza
Najstarszy filogenetycznie mechanizm
obronny reprezentowany przez
wyspecjalizowane komórki krwi i
niektóre komórki osiadłe - fagocyty
 wychwytywanie
 niszczenie
obcych materiałów
Fagocytoza
U owadów wyróżniono cztery typy reakcji
fagocytarnych (Metalnikow i Chorine, 1929)
1. calkowity brak lub słabą fagocytoze
(f. nieefektywna jako odczyn obronny)
2. fagocytoza tylko w początkowym okresie
zakażenia i jej stopniowe zanikanie
3. Brak f. na początku zakażenia i jej stopniowy
rozwój w miarę postępów zakażenia
4. Silna i efektywną f. na takim samym
poziomie przez cały okres zakażenia
Fagocytoza u pszczół





Plazmatocyty
Hemocyty ziarniste (granulocyty)
Fagocytozę u A. mellifera wspomaga nodulacja i
inkapsulacja
„intensywana” współpraca z humoralnymi odczynami
obronnymi prowadząca do oczyszczenia hemocelu
(clearance) z drobnoutsrojów (przede wszystkim
bakterii)
Skuteczna w zakażeniach bakteryjnych do momentu
przekroczenia charakterystycznych ilośći bakterii dla
danej postaci rozwojowej (lub gatunku owada). Dla
pszczoły nie przekracza zapewne 1000 komórek/µl
hemolimfy
Określanie wartości
indeksu fagocytarnego
• Do probówki Eppendorfa lub
silikonowanej probówki szklanej
pobiera się około 5 µl krwi czerwia
lub pszczoły. Krew od czerwia
uzyskuje się poprzez nakłucie
pipetą miarową oskórka, natomiast
od pszczoły z zatoki
okołosercowej.
Określanie wartości
indeksu fagocytarnego
• Następnie dodaje się do probówki
identyczną objętości 18-godzinnej
hodowli bulionowej komórek
Sarcina lutea przemytej 2—3-razy
jałowym płynem fizjologicznym o
końcowym stężeniu ok. 3 x 105
komórek/ml. Mieszaninę wstawia
się na 15—30 minut do termostatu
o temperaturze 22—24°C,
okresowo wstrząsając.
Określanie wartości
indeksu fagocytarnego
• Na odtłuszczonym szkiełku
podstawowym sporządza się
gruby rozmaz i barwi go po
wyschnięciu błękitem
metylenowym lub fuksyną
zasadową przez okres 15—20
minut.
Określanie wartości
indeksu fagocytarnego
• Preparat ogląda się pod obiektywem
immersyjnym i oblicza się ilość
pochłoniętych komórek S. lutea przez 50
hemocytów.
• Z tych danych oblicza się średnią ilość
bakterii pochłoniętą przez 1 hemocyt
(indeks fagocytarny).
Nodulacja


Przekroczenie granicznej „pojemności”
fagocytozy uruchamia nodulację, bardziej
złożony proces komórkowy
wspomagający fagocytozę.
W najprostszej formie: otoczenie
fagocytujących (albo już rozpadłych
hemocytów kilkoma warstwami
komórek krwi z równoczesnym
odłożeniem melaniny
Nodulacja
Typowy guzek składa się z:
W centrum
 Z ziarnistych nieuszkodzonych lub/i zabitych
hemocytów
 Skupisk bakterii
 Matrixu
 Melaniny
Na zewnątrz:
 Kilka warstw spłaszczonych hemocytów
Stanowi to dobra izolację bakterii od hemolimfy owada
Nodulacja




Guzki unoszone są z prądem krwi
Guzki osadzają się na powierzchni
narządów zewnętrznych owada
Otaczane są twory o wymiarach
poniżej 10 µm
Im zjadliwsze bakterie tym guzki
większe a czas ich tworzenia
krótszy
Nodulacja
Proces wielostopniowy:
Bezpośredni kontakt subst. obcej z ziarnistym
hemocytem aktywuje hemocyt powodując
degranulację ziarnistości cytoplazmatycznych
Zaktywowany hemocyt wydziela substancje
hemotaktyczne przyciągające plazmatocyty (ew. inne
kom. krwi) w okolicę aktywnego hemocyta. Zwiększa
się adhezyjność
Skupiska fagocytujących hemocytów, rozpadłych
hemocytów, agregatów bakterii, uwolnionych
składników cytoplazmy hemocytów
Melanizacja guzka jest następstwem aktywacji układu
oksydazy polifenolowej przez produkty rozpadu
aktywnych w nodulacji hemocytów
Nodulacja u pszczoły miodnej



Wspomaga fagocytoze przy sepsach
bakteryjnych w jamie ciała
Nodulowane bywają spory Nosema apis
Niewykluczona nodulacja zarodników
niektórych grzybów
Inkapsulacja
Tworzenie otoczki jest komórkowym
rzadziej humoralnym odczynem
obronnym
 Komórkowa:
 Gdy cząstka substancji obcej za duża do
sfagocytowania, powstaje otoczka z
kilku a nawet kilkudziesięciu hemocytów
Z reguły o średnicy większej niż 10 µm
•Inkapsulacja
Z reguły o średnicy większej niż 10 µm
Konidia,
Strzepki grzybów
Pasożyty i ich jaja
Większe skupiska bakterii
Upostaciowane większe twory
W inkapsulacji humoralnej otoczkę tworzy wartswa
melaniny
Inkapsulacja
Dwa typy otoczek:
Typu ribesia – wiele warstw hemocytów
bez melanizacji lub jest m. słaba
Typu balteata – jedynie kilka warstw
hemocytów ale jest silnie
zmelanizowana
Inkapsulacja
Dotyczy najczęściej pasożytów i przejawia się :
1.
brak odczynu obronnego, przy b. dobrej adaptacji pasożyta
do gospodarza (pasożyt rozwija się w jamie ciała
gospodarza)
2.
Brak reakcji hemocytarnej, ale z z osłabieniem lub
zahamowanie wzrostu pasożyta
3.
Odczynom komórkowych ulegają wyłącznie osłabione i
martwe pasożyty
4.
Odczyn obronny ograniczony do określonego stadium
rozwojowego pasożyta
5.
Dotyczy żywych pasożytów i polega na tworzeniu nacieków
hemocytarnych w niektórych miejscach ciała pasożyta
6.
Powstawanie typowych otoczek zarówno wokół żywych
(pasożyty, skupiska bakterii jak i martwych (zabite jaja,
znekrotyzowane pasożyty) obiektów
Inkaspulacja u pszczoły
Dotyczy:
 Zarodników mikrosporidiów (N. apis)
 Hurmaczków
 Niekiedy wiciowców (Leptomonas apis)
Przy niewielkim porażeniu z reguły
skuteczna
Krzepnięcie krwi i gojenie ran
Przyczyny urazów:
 Mechaniczne
 Ataki pasożytów zewnętrznych (V.destructor)
 Inwazje pasożytów wewnętrznych Nosema apis,

Leptomonas apis, Leidyana apis, Epigregarina
stammeri, Acarapis woodi i inne Acarapis
Ataki drapieżców (Meloe variegatus, barcielaTrichodes apiarus, wachlarki-Stylops mellite, muchy –
Physocphala vittata lub larw Senotainia tricuspis)
Krzepnięcie krwi i gojenie ran


1.
2.
Ubytki krwi niewielkie
Koagulacja krwi:
Wypełnienie rany szybko krzepnąca
hemolimfą „czop” – kilka sekund
Odczyn hemocytarny – naciek granulocytów
i plazmatocytów, adhezję między sobą i do
brzegów rany oraz różnicowanie części
hemocytów i tworzenie filopoidiów
Krzepnięcie krwi i gojenie ran





Pojawia się skrzep w formie siatki z białek
uwalnianych z hemocytów, materiału
niebiałkowego i hemocytów
Natychmiast po zranieniu zasklepianie
Naciek komórkowy po 1 minucie (granulocyty
i plazmatocyty)
Czynniki zranienia (injury factors)
Mobilizacja hemocytów osiadłych, szybka
mitoza i wzrost ich liczby
Gojenie rany
Wieloetepowo
Uszkodzone i martwe tkanki, bakterie usuwane w
fagocytozie
Hemocyty nagromadzone w ranie różnicują się w formy
podobne do fibroblastów
Na osnowie skrzepu formuje się nowy nabłonek
Plazmatocyty tworzą nabłonek rzekomy na który
nasuwa się nabłonek właściwy.
Stowarzyszony wzrost syntezy w ciele tłuszczowym
białek hemolimfy (polipeptydy o działaniu
przeciwbakteryjnym).
Download