Metody diagnostyczne stosowane w analizie DNA

Metody diagnostyczne stosowane w analizie DNA
Anna Wawrocka
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej UM w Poznaniu
Izolacja DNA
Do najczęściej wykorzystywanych materiałów biologicznych, z których izoluje się DNA
człowieka należą:
- pełna krew obwodowa (limfocyty)
- komórki płynu owodniowego (AFC)
- komórki kosmówki (CVS)
- hodowle fibroblastów
- komórki epitelialne
- cebulki włosowe
- plamy krwi, nasienia
- fragmenty tkanek
- szpik kostny
Diagnostyka molekularna
Techniki analizy DNA:
Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne sekwencje w obrębie dwuniciowego DNA i
tną te sekwencje, co w efekcie prowadzi do powstania fragmentów określonych pod
względem długości i struktury końców. Tworzą fragmenty o tępych końcach lub o lepkich.
Hybrydyzacja (renaturacja) – tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami
DNA lub RNA pochodzącymi z różnych źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i
sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).
Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) – stosowana najczęściej,
dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród mieszaniny
fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:
- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz
-mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla
enzymu, stosowanego do trawienia DNA
DNA Fingerprinting
W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji
powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) – zmienna liczba tandemowych
powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznającymi
jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz
fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny
Zastosowanie:
-ustalanie ojcostwa
-badania medyczno-sądowe
Amplifikacja DNA metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy) – reakcja ta
odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie
powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji
odwrotnej transkrypcji).
Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z
których każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA.
Startery te są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy
DNA, w cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:
- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,
- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,
- synteza nici komplementarnej 68-72°C
Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki
DNA umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej
elektrody, a ich szybkość zależy od wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się
przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są
widoczne po naświetleniu światłem UV.
Na schemacie przedstawiono etapy reakcji PCR
Denaturacja
Wiązanie starterów
Synteza nici
komplementarnej
PCR-Multiplex
Umożliwia jednoczesną amplifikację kilku eksonów jednocześnie.
Zastosowanie:
- Identyfikacja dużych mutacji genowych: delecje, duplikacje, insercje
Np. Dystrofia mięśniowa Duchenne’a DMD
PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych)
Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP
(fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego trawieniu odpowiednim
enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym
restrykcyjny
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia
Sekwencjonowanie enzymatyczne metodą Sangera
Metoda polega na enzymatycznej replikacji jednoniciowej (denaturowanej) matrycy DNA,
rozpoczynającej się od jednego startera, a kończącej wbudowaniem dideoksynukleotydu do
nowopowstałego łańcucha DNA.
Diagnostyka cytogenetyczna
Kariotyp - uporządkowany wg kryteriów morfologicznych garnitur chromosomowy
(charakterystyczny dla danego gatunku zespół chromosomów).
Podstawową metodą badania cytogenetycznego jest klasyczna ocena kariotypu (najczęściej
metoda prążkowa GTG).
W przypadku złożonych lub małych zmian w obrębie struktury chromosomów niezbędna jest
analiza z zastosowaniem innych technik np. cytogenetyki molekularnej.
FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ.
Genetyka kliniczna FISH
•diagnostyka submikroskopowych aberracji chromosomowych
•identyfikacja złożonych aberracji struktury chromosomów
•identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego
•identyfikacja chromosomów markerowych
•szybka diagnostyka aneuploidii chromosomowych
Sondy stosowane w FISH:
•malujące (wcp. – ang. whole chromosome paint)
pokrywające chromosom lub poszczególne ramiona
•alfa-satelitarne (centromerowe, telomerowe)
•specyficzne (unikalne) dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus