Aneta Gerszberg i Andrzej K. Kononowicz

Aneta Gerszberg i Andrzej K. Kononowicz
Zakład Cytogenetyki i Biologii Molekularnej Roślin
Uniwersytet Łódzki
Molekularna uprawa
Termin molekularna uprawa (ang. molecular farming),
odnosi się do produkcji na masową skalę (uprawy polowe)
rekombinowanych białek przez rośliny. Możliwość
wykorzystania roślin jako systemów produkcyjnych dla
białek o znaczeniu farmakologicznym została wykazana
w drugiej połowie lat 90’.
Molekularna uprawa poprzedzona jest identyfikacją białka
o
pożądanej
aktywności
terapeutycznej
czy
diagnostycznej, jego analizą na poziomie molekularnym
i wreszcie jego ekspresją w heterologicznym systemie
komórkowym.
Zalety molekularnej uprawy
możliwość otrzymania materiału roślinnego na masową skalę przy niskich
kosztach produkcji;
opracowanie skutecznych technik transformacji oraz regeneracji in vitro;
obecność eukariotycznych szlaków biosyntezy białek, co pozwala na uzyskanie
prawidłowego produktu białkowego;
uzyskanie bezpiecznego produktu; nie istnieje bowiem niebezpieczeństwo
zakażenia człowieka takimi patogenami jak wirus HIV, priony czy wirus żółtaczki;
pominięcie lub uproszczenie procedury oczyszczania produktu białkowego;
tkanki mogą być wykorzystane jako jadalne szczepionki;
docelowe kierowanie białek do wewnątrzkomórkowych przedziałów np.
chloroplastów (transformacja chloroplastów minimalizuje ryzyko horyzontalnego
transferu genów oraz umożliwia akumulację produktu białkowego do poziomu
46% całkowitego rozpuszczalnego białka; gwarantuje stabilną ekspresję
transgenu).
Wady molekularnej uprawy
niewłaściwe wstawienie, integracja genu i w konsekwencji
ograniczenie jego ekspresji; możliwość potranskrypcyjnego
wyciszenia genu,
wtórny i pleiotropowy efekt ekspresji genu,
obecność roślinnych specyficznych glikanaz (np. α-1,3-fukozy czy
β-1,2-ksylozy), które mogą zmieniać właściwości rekombinowanych
białek w roślinach,
indukcja insercyjnej mutagenezy będącej wynikiem integracji
transgenu w obszarze endogennego genu;
horyzontalny transfer genów (złamanie barier międzygatunkowych
wśród roślin za pośrednictwem transgenicznego pyłku)
Roślinne kultury tkankowe w produkcji
rekombinowanych białek
zawiesiny komórkowe
¾ kultury korzeniowe
¾ kultury somatycznych zarodków
¾
Lista wybranych biofarmaceutyków
produkowanych przy wykorzystaniu systemów
roślinnych
Potencjalne
zastosowanie
Roślina
transgeniczna
Białko
Poziom
ekspresji
Zapalenie wątroby typu
BiC
Ryż
Tytoń
Interferon α
Interferon β
< 0,01 % świeżej
masy
Inhibitor trypsyny dla
zabiegów
transplantacyjnych
Kukurydza
Aprotynina
-
Antybakteryjne
Ziemniak
Laktoferyna
0,10 %
Hormon wzrostu
Tytoń
Somatotropina
7,00 %
Oparzenia, operacje
chirurgiczne
Tytoń
Albumina
0,02 %
Inhibitor trombiny
Rzepak
Hirudyna
0,30 %
Kolagen
Tytoń
Homotrimeryczny < 0,01 % świeżej
kolagen
masy
Zabliźnianie ran
Tytoń
Czynnik wzrostu
< 0,01 %
Białka i enzymy przemysłowe uzyskiwane
z roślin transgenicznych
awidyna, lakaza, trypsyna i β-glukuronidaza produkowane
w transgenicznej kukurydzy,
laktoferyna i β-kazeina produkowane w transgenicznych
ziemniakach,
bakteryjna celulaza produkowana w Arabidopsis thaliana,
ksylanaza grzybowa produkowana w rzepaku i tytoniu,
fitaza produkowana w rzepaku,
hirudyna w połączeniu z oleozyną produkowaną w rzepaku
Stafylokinaza
Stafylokinaza jest białkiem wytwarzanym i wydzielanym przez niektóre
szczepy Staphyloccocus aureus, a także S. epidermidis, S. lentus, S. sciuri,
S. lugdunensis, S. xylosus, S. hominis.
Obecnie do produkcji stafylokinazy wykorzystuje się różnorodne systemy
ekspresyjne np. Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pichia pastoris, Bacillus
subtilis.
Model aktywacji plazminogenu przez stafylokinazę
wg. Collen i Lijnen, 1993.
[2]
[1]
Plg + Sak
Plg - Sak
Pli - Sak
[3]
1. nieaktywny kompleks Plg – Sak
2. generowanie aktywnej plazminy ze
stafylokinazą Pli – Sak
3. wytwarzanie aktywnej plazminy
Plg
Pli
W toku naszych dotychczasowych badań skonstruowaliśmy
transgeniczne rośliny ziemniaka (Solanum tuberosum cv.
Desireé) produkujące białko fuzyjne recSAK-mGFP-GUS, którego
domena recSAK wykazuje właściwości amidolityczne,
charakteryzujące bakteryjną stafylokinazę.
Do transformacji wykorzystano szczep AGL1 Agrobacterium
tumefaciens, ze zrekombinowanym plazmidem pCAMBIA1304
zawierającym fuzję genową stafylokinazy i genów reporterowych,
pod kontrolą promotora CaMV 35S.
Nośnikiem zrekombinowanego genu stafylokinazy był plazmid
binarny pCAMBIA 1304 (Center for the Application of Molecular
Biology to International Agriculture, Canberra, Australia).
W odcinku T-DNA tego plazmidu znajduje się roślinny gen
selekcyjny odporności na higromycynę oraz marker
reporterowy w postaci fuzji genowej mgfp5-gusA-His6.
METODY
Transformacja Solanum tuberosum za pośrednictwem A. tumefaciens.
Histochemiczna analiza poziomu ekspresji β-glukuronidazy.
Histochemiczna analiza aktywności β-glukuronidazy in situ.
Izolacja genomowego DNA z tkanki S. tuberosum.
Amplifikacja DNA techniką PCR.
Rozdziały elektroforetyczne w żelach agarozowych.
Izolacja białek z tkanki przetransformowanych roślin S. tuberosum.
Analiza Western blot oraz elektroforeza białek (SDS-PAGE).
Test na aktywność amidolityczną
z transgenicznych roślin S. tuberosum.
ekstraktu
białkowego
1 mm
A
1 mm
B
1 mm
C
1 mm
D
Kolejne etapy regeneracji
Solanum tuberosum cv.
Desireé po transformacji
Agrobacterium
tumefaciens
A i B – różnicująca się tkanka
kalusowa
C – G – formujące się roślinki
2 mm
1 mm
E
G
2 mm
2 cm
F
H
H – transformant na pożywce
selekcyjnej
Regeneranty Solanum tuberosum
A – roślina kontrolna (z lewej), roślina transgeniczna (z prawej)
B – rośliny transgeniczne
A
B
Elektroforegram produktów amplifikacji sekwencji
kodującej stafylokinazę na matrycy genomowego DNA
S. tuberosum, po transformacji A. tumefaciens.
1
2
3
4
5
6
7
kanał 1 – wzorzec mas
kanał 2 – roślina kontrolna
kanał 3 – S5
kanał 4 – S7
kanał 5 – S13
kanał 6 – S23
8
9 10
11 12
kanał 7 – S24
kanał 8 – S25
kanał 9 – S26
kanał 10 – S27
kanał 11 – S28
Elektroforegram produktów amplifikacji sekwencji
kodującej stafylokinazę na matrycy genomowego DNA
Solanum tuberosum po transformacji A. tumefaciens.
1
2
3
4
5
6
kanał 1 – wzorzec mas
kanał 2 – roślina kontrolna
kanał 4 – S8
kanał 6 – S17
kanał 8 – S19
kanał 10 – S22
7
8
9
10
kanał 3 – S6
kanał 5 – S9
kanał 7 – S18
kanał 9 – S21
1 mm
A
1 mm
C
200 µm
E
1 mm
1 mm
100 µm
B
D
F
Histochemiczna
analiza aktywności
β-glukuronidazy
w zregenerowanych
roślinach Solanum
tuberosum.
A – kontrola negatywna
B – roślina GUS-pozytywna
C-D – przykłady chimeryzmu
genu gusA w tkankach
S. tuberosum
E-F – mikroskopowa detekcja
ekspresji GUS
Analiza Western blot
1
2
3
4
5
2
3
4
5
119 kDa
97,4 kDa
A
A – elektroforeza białek
kanał 1 – wzorzec mas
kanał 2- S6
kanał 3 – roślina kontrolna
kanał 4 – S8
kanał 5 – S9
B
B – Western blot
kanał 4 – S8
kanał 5 – S9
Aktywność amidolityczna stafylokinazy
Kontrola
Transgeniczne rośliny
WNIOSKI
Konstrukcja transgenicznych roślin Solanum tuberosum
produkujących białko fuzyjne SAK-mGFP-GUSA
analiza PCR wykazała obecność sekwencji sak będącej elementem
transgenu CaMV::sak-mgfp-gusA w genomowym DNA 22,5%
zregenerowanych roślin Solanum tuberosum,
ekspresja białka fuzyjnego SAK-mGFP-GUSA została potwierdzona
testem histochemicznym na aktywność β-glukuronidazy,
analiza Western blot ujawniła obecność stafylokinazy w ekstrakcie
białkowym z dwóch na sześć analizowanych roślin,
w preparacie białkowym tylko jednej z dotychczas zbadanych roślin,
stwierdzono aktywność amidolityczną charakteryzującą stafylokinazę,
rozbieżności pomiędzy wynikami analiz PCR, aktywności GUS,
Western blot i aktywności amidolitycznej ekstraktów białkowych
wskazują na wysokie prawdopodobieństwo u otrzymanych roślin
transgenicznych z jednej strony uszkodzeń lub rearanżacji transgenu,
z drugiej zaś – na możliwość zakłóceń w ekspresji genu i aktywności
jego produktu białkowego
PODSUMOWANIE
Niniejsza praca dostarczyła po raz pierwszy eksperymentalnych
dowodów na możliwość wprowadzenia do roślin genu
kodującego stafylokinazę, jego ekspresję w otrzymanych
roślinach oraz uzyskania tą drogą produktu białkowego
wykazującego właściwości amidolityczne.
Praca ta dowodzi możliwości wykorzystania roślin jako
naturalnych bioreaktorów do produkcji rekombinowanej
stafylokinazy, białkowego aktywatora plazminogenu, preparatu
białkowego do wykorzystania w terapii chorób układu krążenia
krwi u człowieka, spowodowanych wewnątrznaczyniowymi
zakrzepami.
Andrzej K. Kononowicz
Aneta Gerszberg
Piotr Łuchniak
Joanna Kaźmierczak
Uniwersytet Łódzki
Aneta WiktorekWiktorek-Smagur
Katarzyna Hnatuszko
Tomasz Sakowicz
Uniwersytet Medyczny
Janusz Szemraj
Tadeusz Pietrucha