192294 pl 192294 b1 - Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(21) Numer zgłoszenia: 373641
192294
(13) B1
(22) Data zgłoszenia: 20.12.1996
(51) Int.Cl.8
(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:
C12N 15/12
C07K 14/705
C07K 16/28
C12N 5/20
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
321937
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
20.12.1996, PCT/US96/20759
(11)
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
26.06.1997, WO97/22698
PCT Gazette nr 27/97
(54)
Oczyszczony i izolowany polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową
receptora chemokin 88-2B, transkrypt RNA, biologicznie czynny wektor,
komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu 88-2B,
polinukleotyd kodujący polipeptyd 88-2B, oczyszczony i izolowany polipeptyd,
produkt typu przeciwciała, hybrydoma, sposób przesiewowego wykrywania
modulatora infekcji HIV in vitro, sposób wykrywania infekcji komórek wirusem HIV,
zastosowanie produktu typu przeciwciała do wytwarzania leku
do leczenia infekcji HIV i chorób związanych z HIV
(30) Pierwszeństwo:
20.12.1995,US,08/575,967
(73) Uprawniony z patentu:
ICOS CORPORATION,Bothell,US
(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
05.01.1998 BUP 01/98
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
29.09.2006 WUP 09/06
PL 192294 B1
(57)
Patrick W. Gray,Seattle,US
Viki L. Schweickart,Seattle,US
Carol J. Raport,Bothell,US
(74) Pełnomocnik:
Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o.
1. Oczyszczony i izolowany polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową receptora
chemokin 88-2B podaną na Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
2
PL 192 294 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony i izolowany polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową receptora chemokin 88-2B, transkrypt RNA, biologicznie czynny wektor, komórka gospodarza, sposób wytwarzania polipeptydu 88-2B, polinukleotyd kodujący polipeptyd 88-2B, oczyszczony
i izolowany polipeptyd, produkt typu przeciwciała, hybrydoma, sposób przesiewowego wykrywania
modulatora infekcji HIV In vitro, sposób wykrywania infekcji komórek wirusem HIV, zastosowanie
przeciwciała do wytwarzania leku do leczenia infekcji HIV i chorób związanych z HIV.
Ostatnie postępy biologii molekularnej spowodowały docenienie istotnej roli szlaków przekazywania sygnału w procesach biologicznych. Szlaki te stanowią kluczowy sposób, w jaki komunikują się
poszczególne komórki w organizmie wielokomórkowym, koordynując w ten sposób procesy biologiczne. Patrz, Springer i in., Cell 76:301-314 (1994), Tablica I podana jako model. Jedna z odnóg szlaków
przekazywania sygnału, określana przez wewnątrzkomórkowy udział białek wiążących nukleotyd guaninowy (białka G), bierze udział w wielu procesach biologicznych.
Lewin, Genes V 319-348 (1994) omawia ogólnie szlaki przekazywania sygnału białek G, które
obejmują, przynajmniej następujące składniki: sygnał zewnątrzkomórkowy (np. neuroprzekaźniki,
hormony peptydowe, cząsteczki organiczne, światło albo substancje zapachowe), receptor rozpoznający sygnał (receptor związany z białkiem G, omówiony przez Probst i in., DNA and Cell Biology,
11:1-20 (1992) i zwany również GPR albo GPCR) oraz wewnątrzkomórkowe, heterotrimeryczne białko
wiążące GTP albo białko G. W szczególności, szlaki te przyciągają uwagę z powodu ich roli w regulowaniu ruchu białych krwinek albo leukocytów.
Leukocyty stanowią grupę mobilnych komórek krwi obejmujących granulocyty (tj. neutrofile, bazofile i eozynofile), limfocyty i monocyty. Po uruchomieniu i aktywacji komórki te są głównie związane
z odpowiedzią organizmu na ciało obce. Zadanie to jest skomplikowane ze względu na różnorodności
normalnych i patologicznych procesów, w których uczestniczą leukocyty. Przykładowo, leukocyty działają w normalnej reakcji zapalnej na zakażenie. Leukocyty są również związane z licznymi patologicznymi stanami zapalnymi. Podsumowanie patrz, Schall i in., Curr. Opin. Immunol., 6:865-873 (1994).
Ponadto, każdy z tych procesów może obejmować unikalny udział, wielkość, rodzaj i trwanie każdego
z rodzajów leukocytów.
W badaniu tych reakcji odpornościowych, naukowcy początkowo skupiali się na sygnałach działających na leukocyty wnioskując, że do wywołania każdej postaci odpowiedzi potrzebny jest sygnał.
Murphy, Ann. Rev. Immunol., 12:593-633 (1994), omawia członków istotnej grupy sygnałów leukocytarnych, sygnałów peptydowych. Jeden z rodzajów sygnałów peptydowych obejmuje chemokiny
(z ang. chemoattractant cytokines), określane w Oppenheim i in., Ann. Rev. Immunol., 9:617-648
(1991) jako interkryny. Oprócz tego, Bagglioni i in., Advances in Immunol., 55:97-179 (1994) dokumentuje rosnącą liczbę chemokin, które zidentyfikowano i poddano analizie genetycznej i biochemicznej.
Porównanie sekwencji aminokwasowych znanych chemokin doprowadziło do powstania schematu klasyfikującego, który dzieli chemokiny na dwie grupy: grupa α, charakteryzującą się pojedynczym aminokwasem rozdzielającym pierwsze dwie cysteiny (CXC; względem końca N) oraz grupę β,
gdzie te dwie cysteiny przylegają do siebie (CC). Patrz, Bagglioni i in., wyżej. Stwierdzono korelacje
pomiędzy chemokinami i konkretnymi rodzajami leukocytów reagujących na te sygnały. Schall i in.,
wyżej opisuje, że chemokiny CXC ogólnie wpływają na neutrofile, chemokiny CC raczej wpływają na
monocyty, limfocyty, bazofile i eozynofile. Przykładowo, Baggiolini i in., wyżej, wymieniają, że RANTES, chemokina CC, działa jako chemoatraktant dla monocytów, limfocytów (tj. limfocytów T pamięci),
bazofilów i eozynofilów ale nie dla neutrofilów, wywołując uwolnienie histaminy z bazofilów.
Wykazano ostatnio (Cocchi i in., Science 270:1811-1815), że chemokiny hamują proliferację
HIV. Cocchi i in., wykazali, że RANTES, MIP-1α i MIP-1β hamują zakażenia przez HIV-1, HIV-2 i SIV
linii komórek CD4+ oznaczonej PM1 oraz pierwotnych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi
obwodowej.
Ostatnio jednakże, zwrócono uwagę na receptory komórkowe, które wiążą chemokiny, ponieważ wydaje się, że chemokiny zewnątrzkomórkowe kontaktują się z komórkami w sposób niewybiórczy, a więc pozbawione są swoistości potrzebnej do regulowania poszczególnych rodzajów komórek leukocytów.
Murphy, wyżej, donosi, że nadrodzina GPCR receptorów obejmuje rodzinę receptora chemokin.
Budowa typowego receptora chemokiny obejmuje zewnątrzkomórkową domenę wiążącą chemokinę,
położoną w pobliżu końca N, a następnie siedem regionów oddzielających zbudowanych głównie
PL 192 294 B1
3
z aminokwasów hydroforbowych, zdolnych do tworzenia helis α obejmujących błonę komórkową. Pomiędzy każdą z domen α-helikalnych znajdują się domeny hydrofilowe na przemian w przestrzeni
wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej. Właściwości te powodują powstanie wężowatej konformacji receptora chemokiny otoczonego błoną. Trzecia pętla wewnątrzkomórkowa zwykle oddziaływuje z białkami
G. Oprócz tego, Murphy, wyżej, zaznacza, że wewnątrzkomórkowy koniec karboksylowy jest również
zdolny do oddziaływania z białkami G.
Pierwszymi receptorami chemokin, które były analizowane technikami klonowania molekularnego, były dwa receptory neutrofilów dla ludzkiej IL-8, chemokiny CXC. Holmes i in., Science 253:1781280 (1991) i Murphy i in., Science 253:1280-1283 (1991) opisują klonowanie tych dwóch receptorów
dla IL-8. Lee i in., J.Biol. Chem., 267:16283-16287 (1992) analizowali cDNA kodujące te receptory
i stwierdzili 77% identyczność aminokwasową pomiędzy kodowanymi receptorami, z których każdy
wykazywał cechy rodziny receptorów związanych z białkami G. Jeden z tych receptorów jest swoisty
dla IL-8, podczas gdy drugi wiązał się i przekazywał sygnał w odpowiedzi na IL-8, gro/MGSA i NAP-2.
Manipulacje genetyczne na genach kodujących receptory IL-8 przyczyniły się do naszego zrozumienia
roli biologicznej wypełnianej przez te receptory. Przykładowo, Cacalano i in., Science 265:682-684
(1994) donoszą, że delecja homologa receptora IL-8 u myszy powoduje plejotropowy fenotyp obejmujący limfadenopatię i splenomegalię. Oprócz tego, badania nad mutacjami typu missens opisane przez
Leonga i in., J.Biol. Chem., 269:19343-19348 (1994) ujawniły aminokwasy w receptorze IL-8, które są
kluczowe dla wiązania IL-8. Doświadczenia nad zamianą domen, opisane w Murphy wyżej sugerują,
że amino-końcowa domena zewnątrzkomórkowa stanowi determinantę swoistości wiązania.
Zidentyfikowano i sklonowano kilka receptorów chemokin CC. CCCKR1 wiąże zarówno MlP-1α
jak i RANTES i powoduje wewnątrzkomórkowy napływ jonów wapnia w odpowiedzi na oba ligandy.
Charo i in., PNAS (USA) 91:2752-2756 (1994) donoszą, że inny receptor chemokin CC, MCP-R1
(CCCKR2) kodowany jest przez pojedynczy gen, który tworzy dwa warianty składania różniące się
domenami końca karboksylowego. Receptor ten oprócz MCP-1 wiąże i odpowiada na MCP-3.
Zidentyfikowano również receptor promiskuitywny, który wiąże zarówno chemokiny CXC jak
i CC. Receptor ten został początkowo zidentyfikowany na krwinkach czerwonych, zaś Horuk i in.,
Science 261:1182-1884 (1993) donoszą, że wiąże on IL-8, NAP-2, GROα, RANTES i MCP-1. Receptor erytrocytarny chemokin wykazuje około 25% identyczność z innymi receptorami chemokin i może
pomagać w regulowaniu poziomu krążących chemokin albo pomagać w prezentacji chemokin ich
cząsteczkom docelowym. Oprócz wiązania chemokin wykazano, że receptor erytrocytarny chemokin
jest również receptorem dla plasmodium vivax, głównej przyczyny malarii (id.). Wykazano, że inny
receptor związany z białkiem G, który jest blisko spokrewniony z receptorami chemokin, receptor
czynnika aktywującego płytki, jest receptorem dla ludzkiego patogenu, bakterii Streptococcus pneumoniae (Cundell i in., Nature 377:435-438 (1995)).
Oprócz receptorów chemokin ssaków, zidentyfikowano dwa wirusowe homologi receptorów
chemokin. Ahuja i in., J. Biol. Chem., 268:20691-20694 (1993) opisuje produkt genowy z Herpesvirus
saimiri, wykazujący około 30% identyczność z receptorami IL-8 i wiążący chemokiny CXC. Neote i in.,
Cell 72:415-425 (1993) donoszą, że ludzki wirus cytomegalii zawiera gen kodujący receptor wykazujący około 30% identyczność z receptorami chemokin CC, które wiążą MIP-1α, MIP-1β, MCP-1
i RANTES. Te receptory wirusowe mogą wpływać na normalną rolę chemokin i zapewniać wirusowi
swoistą przewagę patologiczną.
Z powodu znacznej różnorodności chemokin i ich aktywności, istnieją liczne receptory chemokin. Receptory, które scharakteryzowano, stanowią jedynie frakcję całkowitej liczby receptorów chemokin. Istnieje zatem w technice potrzeba identyfikacji dalszych receptorów chemokin. Dostępność
tych nowych receptorów może dostarczyć narzędzi do opracowania terapeutycznych modulatorów
chemokin albo funkcji receptorów chemokin. W niniejszym wynalazku rozważa się, że takie modulatory są przydatne jako środki terapeutyczne do leczenia miażdżycy, reumatoidalnego zapalenia stawów,
zahamowania wzrostu nowotworu, astmy, zakażeń wirusowych i innych stanów zapalnych. Alternatywnie, fragmenty albo odmiany receptorów chemokin albo przeciwciała rozpoznające te receptory są
uwzględniane jako środki terapeutyczne.
Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony i izolowany polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową receptora chemokin 88-2B podaną na Identyfikatorze Sekw. Nr 4., korzystnie jest on
DNA, bardziej korzystnie genomowym DNA lub cDNA, a szczególnie cDNA, który obejmuje DNA
o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.
Korzystnie polinukleotyd jest całkowicie albo częściowo chemicznie syntetyzowanym DNA.
4
PL 192 294 B1
Wynalazek ponadto dotyczy transkryptu RNA polinukleotydu, którym jest DNA.
W zakres wynalazku wchodzi biologicznie czynny wektor DNA obejmujący DNA według wynalazku. W korzystnym wykonaniu DNA jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję
DNA.
Zakresem wynalazku objęta jest również komórka gospodarza stabilnie transformowana albo
transfekowana DNA według wynalazku, w sposób umożliwiający ekspresję tego DNA.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania polipeptydu 88-2B, który obejmuje etapy hodowania
komórki gospodarza określonej powyżej w odpowiedniej pożywce i izolowania polipeptydu z komórki
albo z pożywki.
Wynalazek dotyczy też polinukleotydu kodującego polipeptyd 88-2B, który hybrydyzuje w surowych warunkach hybrydyzacji z polinukleotydem o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.
Poniżej przedstawiono przykładowe surowe warunki hybrydyzacji: hybrydyzacja w 42°C w 50%
formamidzie, 5xSSC, 20 mM fosforanie sodu, pH 6,8 i płukanie w 0,2xSSC w 55°C. Dla specjalistów
w dziedzinie jest zrozumiałe, że w zależności od długości i zawartości nukleotydów GC w sekwencji,
która ma hybrydyzować, mogą wystąpić odmiany w tych warunkach. Do określenia szczegółowych
warunków hybrydyzacji odpowiednie są wzory stanowiące standard w dziedzinie wiedzy. Patrz, Sambrook i in., 9.47-9.51 w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, Nowy York (1989).
Przedmiotem wynalazku jest ponadto produkt typu przeciwciała, który swoiście wiąże polipeptyd
obejmujący sekwencję aminokwasową receptora chemokin 88-2B podaną w Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
Wynalazek również dostarcza hybrydoma wytwarzającą produkt typu przeciwciała określony
w wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi też sposób przesiewowego wykrywania modulatora infekcji HIV in
vitro, który obejmuje następujące etapy:
a) doprowadzenie do kontaktu pierwszej kompozycji obejmującej receptor 88-2B człowieka
o Identyfikatorze Sekw. Nr 4 lub kodowany przez polinukleotyd według wynalazku, z drugą kompozycją obejmującą białko otoczki ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) w obecności lub nieobecności wykrywanego związku,
b) pomiar oddziaływań receptora 88-2B człowieka określonego w pkt. a) z białkiem otoczki HIV
w obecności lub nieobecności wykrywanego związku, oraz
c) przesiewowe wykrywanie modulatora infekcji HIV, w którym zmniejszony albo zwiększony
poziom oddziaływania receptora 88-2B człowieka określonego w pkt. a) z HIV w obecności związku
w porównaniu z poziomem oddziaływania w jego nieobecności wskazuje, czy związek jest modulatorem infekcji HIV. W korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku receptor 88-2B człowieka jest
ludzkim receptorem 88-2B o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
Korzystne jest gdy w sposobie według wynalazku pierwsza kompozycja obejmuje rekombinowaną
komórkę modyfikowaną tak, że wyraża receptor 88-2B człowieka na swojej powierzchni. W kolejnym
wykonaniu sposobu według wynalazku druga kompozycja obejmuje ludzki wirus niedoboru odporności, korzystne jest również gdy etap pomiarowy obejmuje pomiar infekcji komórki wirusem HIV.
Zakresem wynalazku objęty jest również sposób wykrywania infekcji komórek wirusem HIV, który obejmuje następujące etapy:
a) doprowadzenia do kontaktu rekombinowanej komórki modyfikowanej tak, że wyraża przynajmniej jeden ludzki 88-2B o Identyfikatorze Sekw. Nr. 4 lub kodowany przez polinukleotyd według
wynalazku, z wirusem HIV, oraz
b) wykrywania infekcji komórek wirusem HIV.
Produkt typu przeciwciało według wynalazku przeznaczony do zastosowania w terapii oraz do
leczenia infekcji HIV i chorób związanych z HIV jest również objęty zakresem wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie produktu typu przeciwciała według wynalazku,
do wytwarzania leku do leczenia infekcji HIV i chorób związanych z HIV.
Domeny zewnątrzkomórkowe 88-2B odpowiadają Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 i Identyfikatorowi
Sekw. Nr 4, w resztach aminokwasowych 1-36, 93-107, 171-196 i 263-284. Domeny zewnątrzkomórkowe 88-2B kodowane są przez sekwencje polinukleotydowe odpowiadające Identyfikatorowi Sekw.
Nr 3, w nukleotydach 362-469, 638-682, 872-949 i 1148-1213. Domeny zewnątrzkomórkowe 88C
odpowiadają Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 i Identyfikatorowi Sekw. Nr 2, w resztach aminokwasowych
1-32, 89-112, 166-191 i 259-280. Domeny wewnątrzkomórkowe 88-2B obejmują aminokwasy 60-71,
131-151, 219-240 i 306-355 Identyfikatora Sekw. Nr 3 i Identyfikatora Sekw. Nr 4. Domeny te są ko-
PL 192 294 B1
5
dowane przez sekwencje polinukleotydowe odpowiadające Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach, odpowiednio, 539-574, 752-814, 1016-1081 i 1277-1426. Peptydy odpowiadające jednej lub
wielu domenom zewnątrzkomórkowym albo wewnątrzkomórkowym, albo przeciwciała wywołane przeciwko tym peptydom, rozważane są jako modulatory aktywności receptora, zwłaszcza aktywności
receptora wiążącej ligand albo białko G.
Sekwencje nukleotydowe według wynalazku mogą być zastosowane do opracowania oligonukleotydów wykorzystywanych jako znakowane sondy w celu izolacji genomowych DNA, kodujących
88-2B w surowych warunkach hybrydyzacji (tj. analizą metodą Southern blot albo metodą reakcji łańcuchowej polimerazy). Ponadto te sondy oligonukleotydowe mogą być zastosowane do wykrywania
poszczególnych alleli genów kodujących 88-2B ułatwiając diagnozę i terapię genową stanów związanych z konkretnym allelem. Oprócz tego, te oligonukleotydy mogą być zastosowane w celu zmiany
genetyki receptora chemokin, aby ułatwić identyfikację modulatorów receptora chemokin. Również
sekwencje nukleotydowe mogą być zastosowane w celu opracowania antysensownych elementów
genetycznych do zastosowania w celu badania albo zmiany genetyki i ekspresji 88-2B. Możliwe jest
uzyskanie replik biologicznych (tj. kopii izolowanych DNA wytworzonych in vivo albo in vitro) i transkryptów RNA na matrycy DNA według wynalazku. Możliwe jest również uzyskanie autonomicznie
replikujących rekombinowanych konstruktów takich jak plazmidy, wektory kwasu nukleinowego wirusowe albo chromosomalne (np. YAC) skutecznie obejmujące polinukleotydy 88-2B i w szczególności
wektory, w których DNA kodujący 88-2B jest połączony funkcjonalnie z jedną lub wieloma endogennymi albo heterologicznymi sekwencjami kontrolującymi ekspresję.
Receptory 88-2B mogą być wytwarzane naturalnie, rekombinacyjnie albo syntetycznie. Komórki
gospodarza (prokariotycznego albo eukariotycznego) transformowane albo transfekowane polinukleotydami według wynalazku metodami standardowymi mogą być zastosowane w celu wyrażania receptorów chemokin 88-2B. Oprócz kompletnych produktów genowych 88-2B, można też wytwarzać biologicznie czynne fragmenty 88-2B, analogi 88-2B i peptydy syntetyczne otrzymane z sekwencji aminokwasowych 88-2B podanych jako Identyfikator Sekw. Nr 4.
Ponadto, produkty genowe 88-2B albo fragmenty biologicznie czynne któregokolwiek z produktów genowych, po wytworzeniu przez komórkę eukariotyczną, mogą być modyfikowane potranslacyjnie (np. przez tworzenie mostków dwusiarczkowych, glikozylację, fosforylację, mirystylację,
palmitylację, acetylację itp.). Produkty genowe 88-2B, albo ich fragmenty biologicznie czynne mogą
istnieć w konformacjach monomerycznych, homomultimerycznych albo heteromultimerycznych.
Niniejszy wynalazek obejmuje też produkty typu przeciwciał zdolne do swoistego wiązania receptorów chemokin 88-2B. Produkty typu przeciwciał są wytwarzane sposobami standardowymi
w dziedzinie stosując jako immunogen rekombinowane receptory 88-2B, peptydy syntetyczne albo
fragmenty peptydowe receptorów 88-2B, komórki gospodarza wyrażające na swej powierzchni 88-2B,
albo receptory 88-2B oczyszczone ze źródeł naturalnych. Produkty typu przeciwciał mogą obejmować
przeciwciała monoklonalne albo przeciwciała poliklonalne z dowolnego źródła i dowolnego podtypu.
Ponadto produkty typu przeciwciał obejmują przeciwciała monomeryczne, homomultimeryczne i heteromultimeryczne oraz fragmenty przeciwciał, a także przeciwciała o przeszczepionych CDR, przeciwciała humanizowane i inne zmodyfikowane produkty typu przeciwciał zachowujące zdolność do swoistego wiązania receptora chemokin.
Produkty typu przeciwciał według wynalazku mogą być zastosowane do wykrywania produktów
genowych 88-2B, ich analogów albo ich fragmentów biologicznie czynnych. Przykładowo, produkty
typu przeciwciał mogą być zastosowane w procedurach diagnostycznych opracowanych w celu ujawnienia korelacji pomiędzy ekspresją 88-2B i różnymi stanami normalnymi albo patologicznymi. Oprócz
tego produkty typu przeciwciał mogą być zastosowane do diagnozowania tkankowo swoistych odmian
ekspresji 88-2B, ich analogów albo ich fragmentów biologicznie czynnych. Produkt typu przeciwciał
swoiste wobec receptorów chemokin 88-2B mogą działać jako modulatory aktywności receptora chemokin. W innym aspekcie, produkty typu przeciwciał przeciwko receptorom 88-2B są przydatne do
celów terapeutycznych.
Przedmioty wynalazku umożliwiają przeprowadzenie testów na ligandy zdolne do oddziaływania
z receptorami chemokin według wynalazku. Testy te mogą obejmować bezpośrednie wykrywanie
aktywności receptora chemokin, przykładowo przez śledzenie wiązania znakowanego liganda z receptorem. Oprócz tego, testy te mogą być zastosowane w celu pośredniej oceny oddziaływania liganda
z receptorem chemokin. W znaczeniu tu użytym, określenie „ligand” obejmuje cząsteczki, które są
agonistami i antagonistami 88-2B i inne cząsteczki, które wiążą się z receptorami.
6
PL 192 294 B1
Bezpośrednie wykrywanie wiązania liganda z receptorem chemokin może być uzyskane przy
zastosowaniu poniższego testu. Badany związek (tj. domniemany ligand) jest znakowany w sposób
umożliwiający wykrycie (np. jodem radioaktywnym). Znakowane w sposób umożliwiający wykrycie
związki badane doprowadzane są do kontaktu z preparatami błonowymi zawierającymi receptor chemokin według wynalazku. Korzystnie, błony są wypreparowane z komórek gospodarza wyrażających
receptory chemokin według wynalazku z wektorów rekombinowanych. Po okresie inkubacji, w celu
ułatwienia kontaktu pomiędzy receptorami chemokin zanurzonymi w błonie i związkami badanymi
znakowanymi w sposób umożliwiający wykrycie, materiał membran jest zbierany na filtrach metodą
filtracji pod próżnią. Wykrywalny znacznik związany z filtrami jest następnie badany ilościowo. Przykładowo, znaczniki radioaktywne są obliczane przy użyciu spektrofotometrii scyntylacyjnej w fazie
płynnej. Stosując tę technikę, identyfikowane są ligandy wiążące receptory chemokin. W celu potwierdzenia identyfikacji liganda, związek badany znakowany w sposób umożliwiający wykrycie jest eksponowany na preparat błonowy wykazujący obecność receptora chemokin, w obecności rosnących stężeń związku badanego w stanie nieznakowanym. Postępująca redukcja poziomu znacznika związanego z filtrem, podczas dodawania rosnących ilości nieznakowanego związku, potwierdza identyfikację tego liganda.
Agonistami są ligandy, które wiążą się z receptorem i wywołują przekazanie sygnału wewnątrzkomórkowego, zaś antagonistami są ligandy, które wiążą się z receptorem ale nie wywołują przekazania sygnału wewnątrzkomórkowego. Określenie, czy konkretny ligand jest agonistą czy antagonistą,
może być przeprowadzone, przykładowo przez ocenę szlaków przekazywania sygnału związanych
z białkiem G. Aktywacja tych szlaków może być stwierdzona przez pomiar dokomórkowego napływu
Ca++, aktywności fosfolipazy C albo aktywności cyklazy adenylowej, oprócz innych testów (patrz przykład 5 i 6).
Jak to dalej szczegółowo omówiono w przykładach chemokiny, które wiążą się z receptorem
88-2B obejmują RANTES.
Modulatory funkcji receptora chemokin mogą być zidentyfikowane przy użyciu testów podobnych do zastosowanych tu w celu identyfikacji ligandów. Preparaty błonowe wykazujące obecność
receptora chemokin są eksponowane na stałą i znaną ilość znakowanego w sposób wykrywalny funkcjonalnego liganda. Oprócz tego, receptor chemokiny związany z błoną jest również eksponowany na
rosnące ilości badanego związku, podejrzanego o to, że posiada aktywność modulującą receptor
chemokin. Jeżeli poziom znacznika związanego z filtrem koreluje z ilością badanego związku, związek
jest modulatorem aktywności receptora chemokin. Jeżeli poziom znacznika związanego z filtrem
zwiększa się wraz z rosnącymi ilościami badanego związku, zidentyfikowano aktywator. Przeciwnie,
jeżeli poziom znacznika związanego z filtrem zmienia się odwrotnie do ilości badanego związku, zidentyfikowano inhibitor aktywności receptora chemokin. Badanie w kierunku modulatorów wiązania
z receptorem umożliwia w ten sposób szybkie przesiewanie wielu domniemanych modulatorów, ponieważ pule zawierające wiele potencjalnych modulatorów mogą być badane równocześnie w tej samej reakcji.
Pośrednie testy wiązania receptora obejmują pomiar stężenia albo poziomu aktywności któregokolwiek ze składników spotykanych w odpowiednim szlaku przekazywania sygnału. Aktywacja receptora chemokin jest często związana z dokomórkowym napływem jonów Ca++. Komórki wyrażające
receptory chemokin mogą być naładowane barwnikiem wrażliwym na wapń. Po aktywacji wyrażanego
receptora, napływ Ca++ dzięki barwnikowi powinien się stać możliwy do wykrycia spektrofotometrycznie. Alternatywnie, napływ Ca++ powinien być wykrywalny mikroskopowo. Testy równoległe, przy użyciu obu technik, mogą być wykonywane w obecności albo pod nieobecność domniemanych ligandów.
Przykładowo, stosując mikroskopowy test napływu Ca++, zidentyfikowano, że RANTES, chemokina
CC, jest ligandem receptora chemokin 88-2B. Specjaliści w dziedzinie zauważą, że testy te są również
przydatne do identyfikacji i monitorowania oczyszczania modulatorów aktywności receptora. Aktywatory i inhibitory receptora powinny w tych testach, odpowiednio aktywować albo hamować oddziaływanie
receptorów z ich ligandami.
Alternatywnie, związek receptorów chemokin z białkami G oferuje możliwości oceniania aktywności receptora przez śledzenie aktywności białka G. Charakterystyczna aktywność białek G, hydroliza GTP może być śledzona przy użyciu, przykładowo GTP znakowanego 32P.
Białka G wpływają również na wiele innych cząsteczek, dzięki ich udziałowi w szlakach przekazywania sygnału. Przykładowo, cząsteczka efektorowa białka G obejmuje cyklazę adenylową, fosfolipazę C, kanały jonowe i fosfodiesterazy. Testy skupiające się na tych efektorach mogą być zastoso-
PL 192 294 B1
7
wane w celu śledzenia aktywności receptora chemokin wywołanej związaniem liganda w komórce
gospodarza, która jednocześnie wyraża interesujący receptor chemokin i kontaktuje się z odpowiednim ligandem. Przykładowo, jedna z metod, dzięki której może być zmierzona aktywność receptorów
chemokin obejmuje mierzenie aktywności fosfolipazy C. W tym teście, wykrywane jest wytwarzanie
znakowanego radioaktywnie fosforanu inozytolu przez komórkę gospodarza wyrażającą receptor
chemokin w obecności agonisty. Wykrywanie aktywności fosfolipazy może wymagać równoczesnej
transfekcji DNA kodującym egzogenne białko G. Gdy wymagana jest równoczesna transfekcja, test
ten może być wykonywany przez równoczesną transfekcję DNA chimerycznego białka G, przykładowo
Gqi5 (Conklin i in., Nature 363:274-276 (1993)), DNA 88-2B albo 88C i wykrywanie wytwarzania fosfoinozytolu, gdy komórka jest eksponowana na agonistę receptora 88-2B albo 88C. Specjaliści w dziedzinie wiedzy zauważą, że testy skupiające się na cząsteczkach efektorowych białka G są również
przydatne do identyfikacji i śledzenia oczyszczania modulatorów aktywności receptora. Aktywatory
i inhibitory receptora, odpowiednio aktywują albo hamują oddziaływanie receptorów z ich ligandami
w tych testach.
Chemokiny powiązano z wieloma chorobami zapalnymi, takimi jak łuszczyca, zapalenie stawów, zwłóknienie płuc i miażdżyca, patrz Baggiolini i in., wyżej. Inhibitory działania chemokin mogą
być przydatne do leczenia tych stanów. W jednym przykładzie Broaddus i in., J. Of Immunol.
152:2960-2967 (1994) opisują przeciwciało przeciwko IL-8, które potrafi hamować rekrutację neutrofilów w zapaleniu opłucnej wywołanej endotoksyną modelu ostrego zapalenia płuc u królika. Rozważa
się również, że ligand albo modulator wiązania z albo aktywacji receptora 88C może być przydatny do
leczenia zakażeń HIV albo chorób związanych z HIV. Modulatory wiązania chemokin ze swoistymi
receptorami mogą obejmować przeciwciała skierowane przeciwko chemokinie albo receptorowi, małe
cząsteczki chemiczne albo biologiczne albo syntetyczne peptydy odpowiadające fragmentom chemokiny albo receptora.
Możliwe jest podawanie kompozycji zawierającej modulatory 88-2B osobnikom ssaczym, w celu
śledzenia albo leczenia normalnych albo patologicznych reakcji odpornościowych i zakażeń wirusowych obejmujących zakażenie retrowirusami takimi jak HIV-1, HIV-2 i SIV, w szczególności możliwe
jest łagodzenie reakcji zapalnej, nienormalnych procesów hematopoezy i zakażeń wirusowych przez
dostarczenie dopuszczalnej farmaceutycznie ilości modulatorów receptora chemokin 88-2B. Możliwe
jest dostarczenie tych substancji czynnych w kompozycjach dopuszczalnych farmaceutycznie obejmujących nośniki, rozcieńczalniki albo leki. Możliwe są różne drogi podawania. Przykładowo, substancje
aktywne mogą być podawane poniższymi drogami: dożylnie, podskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo, doustnie, doodbytniczo (tj. w postaci czopków) albo drogą przezpłucną (tj. przez inhalatory, rozpylacze, nebulizery itp.).
Informacja pochodząca z sekwencji DNA dostarczonych w niniejszym wynalazku umożliwia wytworzenie strategią rekombinacji homologicznej albo „knockout” (patrz, Kapecchi i in., Science
244:1288-1292 (1989)) gryzoni, które nie wyrażają funkcjonalnego receptora chemokin 88-2B albo
wyrażają odmiany receptora. Alternatywnie, dobrze znanymi technikami laboratoryjnymi mogą być
również wytworzone zwierzęta transgeniczne, które wyrażają klonowany receptor 88-2B (Manipulating
the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, (wyd.) Brigid Hohan, Frank Constantini i Elizabeth Lacy
(1986) Cold Spring Harbor Laboratory ISBN 0-87969-175-I). Gryzonie takie są przydatne jako model
do badania aktywności receptorów 88-2B in vivo.
Inne aspekty i zalety niniejszego wynalazku staną się oczywiste dla specjalistów w dziedzinie
wiedzy po uwzględnieniu poniższych przykładów.
Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Przykład 1 opisuje izolację genomowych DNA kodujących receptory chemokin 88-2B. Przykład 2 przedstawia izolację i sekwencjonowanie cDNA kodujących ludzkie 88-2B i 88C oraz 88C makaka. Przykład 3 dostarcza opisu analizy metodą Northern blot,
ukazującej wzorzec ekspresji receptorów 88-2B w różnych tkankach. Przykład 4 pokazuje rekombinacyjną ekspresję receptorów 88-2B. Przykład 5 opisuje testy napływu Ca++, testy hydrolizy fosfoinozytolu i testy wiązania na aktywność receptora 88-2B w odpowiedzi na różne potencjalne ligandy.
Doświadczenia opisujące rolę 88-2B jako współreceptory dla HIV przedstawiono w Przykładzie 6 i 7.
Wytwarzanie i charakteryzacja przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych aktywnych wobec 88C
opisana jest w Przykładzie 8. Przykład 9 opisuje dodatkowe testy przeznaczone do identyfikacji ligandów albo modulatorów 88-2B.
8
PL 192 294 B1
Przykład 1
Częściowe klony genomowe kodujące nowe geny receptora chemokin według wynalazku wyizolowano stosując reakcję PCR opartą na konserwowanych sekwencjach stwierdzonych w uprzednio
zidentyfikowanych genach i opartą na skupieniu się genów receptorów chemokin w ludzkim genomie.
Genomowy DNA amplikowano standardowymi sposobami PCR, stosując zdegenerowane startery
oligonukleotydowe.
Matrycami do amplifikacji PCR były dostępne w handlu źródła rekombinowanych ludzkich genomowych DNA klonowanych w sztucznych chromosomach drożdży (tj. YAC). (Research Genetics
Inc., Huntsville, AL, YAC Library Pools, nr kat. 95011 B). Wektor YAC może pomieścić wstawki 5001000 tysięcy par zasad. Początkowo, pule klonów DNA w YAC przesiewano przez PCR stosując startery swoiste wobec genu kodującego CCCKR1. W szczególności CCCKR(2)-5', starter nici sensownej
(odpowiadający nici sensownej CCCKR1) przedstawiony jest w Identyfikatorze Sekw. Nr 15. Starter
CCCKR(2)-5; obejmował sekwencję 5'-CGTAAGCTTAGAGAAGCCGGGATGGGAA-3', w której podkreślone nukleotydy oznaczają kodon start dla CCCKR1. Starterem nici antysensownej był CCCKR-3'
(odpowiadający nici antysensownej CCCKR1) zaś jego sekwencja pokazana jest w Identyfikatorze
Sekw. Nr 16. Sekwencja CCCKR-3', 5-GCCTCTAGAGTCAGAGACCAGCAGA-3', zawierała odwrotne
dopełnienie dla kodonu stop CCCKR1 (podkreślone). Pule klonów DNA YAC dawały wykrywalne produkty PCR (tj. prążki DNA po elektroforezie na żelu) identyfikując odpowiednie podpule klonów YAC,
w oparciu o własny system identyfikacji. (Research Genetics Inc., Huntsville, AL). Reakcje PCR zapoczątkowano przez inkubację w 94°C przez cztery minuty. Amplifikację sekwencji uzyskano stosując 33
cykle denaturacji w 94°C przez minutę, przyłączania w 55°C przez minutę i wydłużania w 72°C przez
dwie minuty.
Podpule klonów DNA YAC poddano następnie drugiej rundzie PCR stosując warunki i startery,
które zastosowano w pierwszej rundzie PCR. W ich wyniku, z przesiewania pod-pul zidentyfikowano
pojedyncze klony zdolne do podtrzymywania reakcji PCR ze starterami swoistymi wobec CCCKR1.
Jeden z klonów, 881F10 zawierał 640 kb ludzkiego genomowego DNA z chromosomu 3p21, obejmującego geny dla CCCKR1 i CCCKR2, jak określono przez PCR i hybrydyzację. Nakładający się klon
YAC, 941A7 zawierał 700 kb ludzkiego genomowego DNA i również zawierał geny dla CCCKR1
i CCCKR2. Przeprowadzono dalsze mapowanie stosując te dwa klony YAC. Analizy metodą hybrydyzacji typu Southern wykazały, że CCCKR1 i CCCKR2 położone są około 100 kb od siebie.
Bliskie sąsiedztwo genów CCCKR1 i CCCKR2 sugeruje, że nowe pokrewne geny mogą być
powiązane z CCCKR1 i CCCKR2. Stosując DNA z drożdży zawierających klony YAC 881F10 i 941A7
jako matryce, wykonano reakcje PCR w celu amplifikacji jakiegokolwiek powiązanego genu receptora.
Jako startery PCR zaprojektowano zdegenerowane oligodezoksyrybonukleotydy. Te oligonukleotydy
odpowiadały regionom kodującym drugą pętlę wewnątrzkomórkową i szóstą domenę śródbłonową
receptorów chemokin CC, jak wywnioskowano z porównania sekwencji CCCKR1, CCCKR2 i V28. V28
zastosowano ponieważ jest to receptor sierocy, który wykazuje cechy charakterystyczne receptora
chemokin: V28 zmapowano również na ludzkim chromosomie 3. Raport i in., Gene 163:295-299
(1995). Należy dalej zaznaczyć, że dwa warianty składania CCCKR2, CCCKR2A I CCCKR2B są identyczne w drugiej pętli wewnątrzkomórkowej i szóstej domenie śródbłonowej zastosowanej do analizy.
Starter 5', oznaczony V28degf2 zawierał wewnętrzne miejsce BamHI (patrz niżej), jego sekwencję
pokazano w Identyfikatorze Sekw. Nr 5. Sekwencja startera V28degf2 odpowiadała DNA kodującemu
region drugiej pętli wewnątrzkomórkowej struktury receptora. Patrz, Probst i in., wyżej. Starter 3'
oznaczony V28degr2, zawierał wewnętrzne miejsce Hindlll (patrz niżej), jego sekwencję przedstawiono na Identyfikatorze Sekw. Nr 6. Sekwencja startera V28degr2 odpowiadała DNA kodującemu region
szóstej pętli śródbłonowej struktury receptora.
Amplifikowany DNA trawiono następnie BamHI i Hindlll tworząc fragmenty długości około 390 bp,
zgodnie z wielkością fragmentów przewidzianą na podstawie badania sekwencji. Po trawieniu endonukleazami, fragmenty PCR klonowano do pBluescript (Stratagene Inc., La Jolla, CA). Automatycznej
analizie sekwencji poddano 54 klonowane fragmenty. Oprócz sekwencji CCCKR1 i CCCKR2 zidentyfikowano sekwencje nowych genów receptorów chemokin oznaczonych 88-2B i 88C.
Mapowanie endonukleazami restrykcyjnymi i hybrydyzacje zastosowano w celu zmapowania
względnego położenia genów kodujących receptory 88C, 88-2B, CCCKR1 i CCCKR2. Te cztery geny
leżą blisko siebie, 88C około 18 kbp od genu CCCKR2 na ludzkim chromosomie 3p21.
PL 192 294 B1
9
Przykład 2
cDNA pełnej długości 88-2B i 88C wyizolowano z biblioteki cDNA makrofagów następującą procedurą. Początkowo, skonstruowano bibliotekę cDNA jak to opisano w Tjoelker i in., Nature 374:549553 (1995) w pRc/CMV (Invitrogen Corp., San Diego, CA) z mRNA ludzkich makrofagów. Bibliotekę
cDNA przeszukiwano na obecność klonów cDNA 88-2B i 88C przez PCR stosując unikalne pary starterów odpowiadające 88-2B i 88C. Protokół PCR obejmował początkową denaturację w 94°C przez
cztery minuty. Amplifikację sekwencji uzyskano stosując 33 cykle denaturacji w 94°C przez minutę,
przyłączania w 55°C przez minutę i wydłużania w 72°C przez dwie minuty. Pierwszym starterem swoistym dla 88-2B był starter 88-2B-f1 przedstawiony w Identyfikatorze Sekw. Nr 11. Odpowiadał on nici
sensownej Identyfikatora Sekw. Nr 3 w nukleotydach 844-863. Drugim starterem swoistym wobec
genu kodującego 88-2B był starter 88-2B-r1, przedstawiony w Identyfikatorze Sekw. Nr 12; sekwencja
88-2B-r1 odpowiadała nici antysensownej Identyfikatora Sekw. Nr 3 w nukleotydach 1023-1042. Podobnie, sekwencja pierwszego startera swoistego dla genu kodującego 88C, startera 88C-f1, przedstawiona jest w Identyfikatorze Sekw. Nr 13 i odpowiada nici sensownej Identyfikatora Sekw. Nr 1
w nukleotydach 453-471. Drugim starterem swoistym wobec genu kodującego 88C jest starter 88C-r3
przedstawiony w Identyfikatorze Sekw. Nr 14, sekwencja 88C-r3 odpowiada nici antysensownej Identyfikatora Sekw. Nr 1 w nukleotydach 744-763.
Przeszukiwanie zidentyfikowało klon 777, klon cDNA 88-2B. Klon 777 zawierał wstawkę DNA
wielkości 1915 bp obejmującą sekwencję kodującą pełnej długości 88-2B jak to określono na podstawie następujących kryteriów: klon zawierał otwartą ramkę odczytu zaczynającą się kodonem ATG,
posiadał sekwencję Kozaka i miał powyżej w ramce odczytu kodon stop. DNA i wywnioskowane sekwencje aminokwasowe wstawki klonu 777 pokazane są odpowiednio, na Identyfikatorze Sekw. Nr 3
i Identyfikatorze Sekw. Nr 4. Transkrypt 88-2B był względnie rzadki w bibliotece cDNA makrofagów.
Podczas przesiewania biblioteki zidentyfikowano tylko trzy klony 88-2B z ocenionej całkowitej liczby
trzech milionów klonów.
Przesiewanie klonów cDNA kodujących receptor chemokiny 88C zidentyfikowało klony 101
i 134, które zdawały się zawierać cały region kodujący 88C wraz z domniemanym kodonem startu.
Jednakże, klony te pozbawione były dodatkowej sekwencji 5' niezbędnej do potwierdzenia tożsamości
kodonu startu. Transkrypt 88C był względnie liczny w bibliotece cDNA makrofagów. Podczas przesiewania biblioteki oceniono, że 88C występował jako jeden na 3000 transkryptów (ogółem około trzy
miliony klonów w bibliotece).
RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends) wykonano w celu wydłużenia istniejącej sekwencji klonu 88C, ułatwiając dokładną charakteryzację końca 5' cDNA 88C. cDNA śledziony ludzkiej
gotowy do 5'-RACE zakupiono w Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA, i zastosowano według
zaleceń producenta. cDNA przygotowano do 5'-RACE PCR przez ligację do sekwencji kotwiczącej do
końców 5' fragmentów cDNA. Sekwencja kotwicząca jest komplementarna do startera kotwiczącego
dostarczonego przez Clontech Laboratories Inc. Polinukleotydowy dupleks sekwencji kotwiczącej/startera kotwiczącego zawiera miejsce EcoRI. cDNA śledziony ludzkiej wybrano jako matrycowy
DNA ponieważ badanie Northern blot wykazało, że 88C ulega ekspresji w tej tkance. Reakcje PCR
zapoczątkowano przez denaturację w 94°C przez cztery minuty. Amplifikację sekwencji uzyskano
stosując 35 cykli denaturacji w 94°C przez minutę, przyłączania w 60°C przez 45 sekund i wydłużania
w 72°C przez dwie minuty. Pierwszą rundę PCR wykonano na mieszaninach reakcyjnych zawierających 2 µl cDNA śledziony gotowego do 5'-RACE, 1 µl startera kotwiczącego i 1 µl startera 88c-r4
(100 ng/µl) w objętości końcowej 50 µl. Starter swoisty wobec 88C, 88c-r4 (5'-GATAAGC-CTCACAGCCCTGTG-3') pokazano na Identyfikatorze Sekw. Nr 7. Sekwencja startera 88c-r4 odpowiadała nici sensownej Identyfikatora Sekw. Nr 1 w nukleotydach 745-765. Drugą rundę PCR wykonywano na mieszaninach reakcyjnych zawierających 1 µl pierwszej reakcji PCR z 1 µl pierwszej reakcji PCR z 1 µl startera kotwiczącego i 1 µl startera 88c-r1b (100 ng/µl) zawierającego następującą
sekwencję (5'GCTAAGCTTGATGACTATCTTTAATGTC-3') i pokazanego na Identyfikatorze Sekw.
Nr 8. Sekwencja startera 88C-r1b zawiera wewnętrzne miejsce Hindlll (podkreślone). Sekwencja 3'
miejsca Hindlll odpowiada nici antysensownej Identyfikatora Sekw. Nr 1 w nukleotydach 636-654.
Powstały produkt PCR trawiono EcoRI i Hindlll i frakcjonowano na 1% żelu agarozowym. Fragment
wielkości około 700 bp wyizolowano i klonowano do pBluescript. Sekwencjonowano klony zawierające
największe wstawki. Alternatywnie, całe produkty PCR ligowano do wektora pCR stosując dostępny
w handlu zestaw do klonowania TA (Invitrogen Corp.) do określania sekwencji nukleotydowej.
10
PL 192 294 B1
cDNA 88-2B i 88C sekwencjonowano stosując zestaw PRISM™ Ready Reaction DyeDideoxy™
Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer Corp., Foster City, CA) i sekwenator Applied Biosystems 373A DNA Sequencer. Wstawka klonu 777 dostarczyła dwuniciowej matrycy do reakcji sekwencjonowania w celu określenia sekwencji cDNA 88-2B. Sekwencję całego klonu 777 określono i przedstawiono jako sekwencję cDNA 88-2B zaś wywnioskowaną sekwencję aminokwasową pokazano jako
Identyfikator Sekw. Nr 3. Sekwencja miała długość 1915 bp, obejmując 361 bp nie ulegającego translacji DNA 5' (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach 1-361), region kodujący
1065 bp (odpowiadający Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach 362-1426) i 489 bp nie ulegającego translacji DNA 3' (odpowiadający Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach 1427-1915). Genomowy DNA 88-2B opisany w przykładzie 1 powyżej, odpowiadał Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach 746-1128. Sekwencja cDNA 88C i wywnioskowana sekwencja aminokwasowa przedstawiona została na Identyfikatorze Sekw. Nr 1. Sekwencja cDNA 88C jest kompletną sekwencją uzyskaną z cDNA RACE-PCR, z klonu 134 i klonu 101. cDNA RACE-PCR zastosowano jako matrycę do
sekwencjonowania w celu określenia sekwencji nukleotydów 1-654 Identyfikatora Sekw. Nr 1, w tym
identyfikacji 9 bp nie ulegającej translacji sekwencji 5' cDNA Identyfikatora Sekw. Nr 1 w nukleotydach
1-9. Sekwencja uzyskana z cDNA RACE PCR potwierdziła położenie pierwszego kodonu metioniny
w nukleotydach 55-57 w Identyfikatorze Sekw. Nr 1 i potwierdziła wniosek, że klon 134 i klon 101 zawierał kopie pełnej długości regionu kodującego 88C. Klon 134 zawierał 45 bp nie ulegającego translacji cDNA 5' (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 10-54), regionowi kodującemu 88C wielkości 1056 bp (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 55-1110)
i nie ulegający translacji cDNA 3' wielkości 492 bp (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 1
w nukleotydach 1111-1602). Klon 101 zawierał 25 bp nie ulegającego translacji cDNA 5' (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 30-54), regionowi kodującemu 88C wielkości 1056
bp (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 55-1110) i nie ulegający translacji
cDNA 3' wielkości 2273 bp (odpowiadającego Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 11113383). Genomowy DNA 88C opisany w przykładzie 1, powyżej odpowiadał Identyfikatorowi Sekw. Nr 1
w nukleotydach 424-809.
Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa 88-2B i 88C wykazała profil hydrofobowości charakterystyczny dla GPCR, obejmując siedem domen hydrofobowych odpowiadających domenom śródbłonowym GPCR. Porównanie sekwencji z innymi GPCR wykazało również pewien stopień identyczności. Co istotne, wywnioskowane sekwencje aminokwasowe 88-2B i 88C wykazały najwyższy stopień identyczności z sekwencjami receptorów chemokin. Tabela 1 pokazuje wyniki porównania sekwencji aminokwasowej.
Tabela 1
Receptory Chemokin
88-2B
88C
IL-8RA
30%
30%
IL-8RB
31%
30%
CCCKR1
62%
54%
CCCKR2A
46%
66%
CCCKR2B
50%
72%
88-2B
100%
50%
88-C
50%
100%
Tabela 1 pokazuje, że 88-2B jest najbardziej podobny do CCCKR1 (62% podobieństwa na poziomie aminokwasowym) zaś 88C jest najbardziej podobny do CCCKR2 (72% podobieństwa na poziomie aminokwasowym).
Wywnioskowane sekwencje aminokwasowe 88-2B i 88C również wykazały domeny wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe charakterystyczne dla GPCR. Domeny zewnątrzkomórkowe 88-2B
odpowiadały sekwencji aminokwasowej pokazanej jako Identyfikator Sekw. Nr 3 i Identyfikator Sekw.
Nr 4, w resztach aminokwasowych 1-36, 93-107, 171-196 i 263-284. Domeny zewnątrzkomórkowe 882B są kodowane przez odpowiadające Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach 362-469, 638-682,
PL 192 294 B1
11
872-949 i 1148-1213. Domeny zewnątrzkomórkowe 88C obejmowały reszty aminokwasowe 1-32,
89-112, 166-191 i 259-280 Identyfikatora Sekw. Nr 1 i Identyfikatora Sekw. Nr 2. Domeny zewnątrzkomórkowe 88C kodowane są przez sekwencje polinukleotydowe, które odpowiadały Identyfikatorowi
Sekw. Nr 1 w nukleotydach 55-150, 319-390, 550-627 i 829-894. Domeny wewnątrzkomórkowe 88-2B
obejmują reszty aminokwasowe 60-71, 131-151, 219-240 i 306-355 Identyfikatora Sekw. Nr 3 i Identyfikatora Sekw. Nr 4. Domeny te kodowane są przez sekwencje polinukleotydowe, które odpowiadały
Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach 539-574, 752-814, 1016-1081 i 1277-1426. Domeny wewnątrzkomórkowe 88C obejmują reszty aminokwasowe 56-67, 125-145, 213-235 i 301-352 Identyfikatora Sekw. Nr 1 i Identyfikatora Sekw. Nr 2. Domeny te kodowane są przez sekwencje polinukleotydowe, które odpowiadały Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 220-255, 427-489, 691-759
i 955-1110.
Oprócz tego amplifikowano przez PCR DNA 88C makaka z genomowego DNA makaka stosując starter odpowiadający regionom flankującym 5' i 3' ludzkiego cDNA 88C. Starter 5' odpowiadał
regionowi bezpośrednio powyżej i obejmującemu początkowy kodon Met. Starter 3' był komplementarny do regionu bezpośrednio poniżej kodonu stop. Startery obejmowały miejsce restrykcyjne do
klonowania do wektora ekspresyjnego. Sekwencja startera 5': GACAAGCTTCACAGGGTGGAACAAGATG (z podkreślonym miejscem Hindlll) (Identyfikator Sekw. Nr 17) zaś sekwencja startera 3':
GTCTCTAGACCACTTGAGTCCGTGTCA (z miejscem Xbal podkreślonym (Identyfikator Sekw.
Nr 18). Warunki PCR: 94°C przez 8 minut. 40 cykli denaturacji w 94°C przez minutę, przyłączania
w 55°C przez 45 sekund i wydłużania w 72°C przez minutę. Amplifikowany produkt klonowano do
Hindlll i Xbal pcDNA3 po czym otrzymano klony, które sekwencjonowano. cDNA makaka pełnej długości oraz wywnioskowaną sekwencję aminokwasową pokazano jako, odpowiednio, Identyfikator
Sekw. Nr 19 i 20. Sekwencja nukleotydowa 88C makaka jest w 98% identyczna z ludzką 88C. Wywnioskowana sekwencja aminokwasowa jest w 97% identyczna.
Przykład 3
Wzorzec ekspresji mRNA 88-2B i 88C określono w analizie metodą Northern blot.
Membrany do Northern blot zawierające unieruchomione poli A+ RNA z różnych tkanek ludzkich zakupiono w Clontech Laboratories Inc. Konkretnie, badano następujące tkanki: serce, mózg,
łożysko, płuco, wątrobę, mięśnie szkieletowe, nerkę, trzustkę, śledzionę, grasicę, stercz, jądro, jajnik,
jelito cienkie, okrężnicę i leukocyty krwi obwodowej.
Sondę swoistą wobec sekwencji nukleotydowych 88-2B wytworzono z klonu cDNA 478. Wstawka klonu cDNA 478 zawierała sekwencję odpowiadającą Identyfikatorowi Sekw. Nr 3 w nukleotydach
641-1915. W celu wytworzenia sondy, klon 478 trawiono i po elektroforezie na żelu izolowano DNA
wstawki klonu. Izolowany fragment wstawki znakowano radioaktywnie nukleotydami znakowanymi 32P,
stosując techniki znane w dziedzinie.
Sondę swoistą wobec sekwencji nukleotydowej 88C wytworzono przez izolowanie i znakowanie
radioaktywne fragmentu wstawki DNA klonu 493. Fragment wstawki klonu 493 zawierał sekwencję
odpowiadającą Identyfikatorowi Sekw. Nr 1 w nukleotydach 421-1359. Ponownie, izolowany fragment
wstawki znakowano radioaktywnie nukleotydami znakowanymi 32P, stosując techniki znane w dziedzinie.
Analiza metodą Northern blot z wyznakowanym 88-2B wykazała około 1,8 kb mRNA w leukocytach krwi obwodowej. Analizy Northern dla 88C wykazały około 4 kb mRNA w kilku ludzkich tkankach,
w tym silny sygnał stwierdzono w tkance śledziony i grasicy i mniej silny w mRNA leukocytów krwi
obwodowej i jelita cienkiego. Względnie słaby sygnał 88C stwierdzono w tkance płuc i jajnika.
Ekspresja 88C w ludzkich limfocytach T oraz liniach krwiotwórczych również została określona
metodą Northern blot. Poziomy 88C w limfocytach T CD4+ i CD8+ były bardzo wysokie. Transkrypt był
obecny we względnie dużych ilościach w liniach szpikowych THP1 i HL-60 jak również stwierdzono go
w linii limfocytów B Jijoye. Oprócz tego, cDNA był względnie częsty w bibliotece cDNA makrofagów
ludzkich co stwierdzono na podstawie amplifikacji PCR podfrakcji biblioteki.
Przykład 4
CDNA 88-2B i 88C wyrażano metodami rekombinacyjnymi w komórkach ssaków.
Do doświadczeń nad przejściową ekspresją, 88C klonowano do wektora ekspresyjnego ssaków
pBJl (Ishi i in., J. Biol. Chem., 270:16435-16440 (1995)). Konstrukt obejmował sekwencje kodujące
sekwencję sygnałową prolaktyny w celu efektywnej ekspresji powierzchniowej oraz epitop FLAG na
końcu aminowym 88C w celu ułatwienia wykrywania wyrażanego białka. Epitop FLAG obejmował
sekwencję „DYKDDDD”. Komórki COS-7 przejściowo transfekowano plazmidem ekspresyjnym 88C
stosując Lipofectamine (Life Technology, Inc.) według instrukcji producenta. Pokrótce, komórki wysia-
12
PL 192 294 B1
no w płytkach 24-studzienkowych w gęstości 4x104 komórek na studzienkę i hodowano przez noc.
Następnie komórki przemyto PBS po czym do studzienek dodano po 0,3 mg DNA zmieszanego z 1,5 µl
Lipofectamine w 0,25 ml Opti-MEM. Po 5 godzinach w 37°C pożywkę zastąpiono pożywką zawierającą 10% FCS. ELISA potwierdził, że 88C ulegał przejściowej ekspresji na powierzchni transfekowanych
komórek COS-7, przy użyciu przeciwciała M1 swoistego wobec epitopu FLAG (Eastman Co).
Znakowany FLAG receptor 88C był również stabilnie transfekowany do komórek HEK-293, linii
komórkowej ludzkiej nerki zarodkowej, stosując odczynnik do transfekcji DOTAP (N-[1-{(2,3-dioleoiloksy)propylo}-N,N,N-trimetyloamonometylo siarczan, Boehringer Mannheim, Inc.) według
zaleceń producenta. Stabilne linie wyselekcjonowano w obecności G418. Transfekowane komórki
HEK-293 badano pod kątem ekspresji 88C na powierzchni przez ELISA, przy użyciu przeciwciała M1
swoistego wobec epitopu FLAG. ELISA wykazał, że 88C znakowany FLAG ulegał ekspresji na powierzchni stabilnie transfekowanych komórek HEK-293.
cDNA 88-2B i 88C zastosowano do wytworzenia stabilnych transfektantów HEK-293. cDNA receptora 88-2B wklonowano poniżej promotora wirusa cytomegalii w pRc/CMV (Invitrogen Corp.) stosując strategię opartą na PCR. Matrycą do PCR była wstawka cDNA klonu 777. Starterami PCR były
88-2B-3 (zawierający wewnętrzne miejsce Xbal) i 88-2B-5 (zawierający wewnętrzne miejsce Hindlll).
Sekwencję nukleotydową startera 88-2B-3 pokazano jako Identyfikator Sekw. Nr 9, zaś sekwencję
nukleotydową startera 88-2B-5 pokazano jak Identyfikator Sekw. Nr 10. Amplifikowano region cDNA
wielkości 1104 bp. Po amplifikacji, DNA trawiono Xbal i Hindlll i klonowano do podobnie trawionego
pRC/CMV. Powstały plazmid nazwano 777XP2 i zawierał on 18 bp nie ulegającej translacji sekwencji 5',
cały region kodujący 88-2B i 3 bp nie ulegającej translacji sekwencji 3'. Dla sekwencji 88C, wstawka
cDNA pełnej długości klonu 134 nie była dalej modyfikowana przed transfekowaniem komórek HEK-293.
W celu wytworzenia stabilnie transfekowanych linii, rekombinowane klony pRc/CMV transfekowano stosując odczynnik do transfekcji DOTAP (N-[1-{(2,3-dioleiloksy)propylo}-N,N,Ntrimetyloamonometylo siarczan, Boehringer Mannheim, Inc.) według zaleceń producenta do komórek
ludzkiej nerki zarodkowej HEK-293. Stabilne linie wyselekcjonowano w obecności G418. W celu identyfikacji stabilnych linii komórkowych wyrażających najwyższe poziomy mRNA 88-2B i 88C zastosowano standardowe procedury przesiewania (tj. analizę Northern blot).
A. Testy napływu Ca++
W celu analizy ekspresji polipeptydu zastosowano test czynnościowy aktywności receptora
chemokin. Wspólną cechą sygnalizacji przez znane receptory chemokin jest to, że przekazanie sygnału jest związane z uwolnieniem wewnątrzkomórkowych kationów wapnia. Stąd, badano wewnątrzkomórkowe stężenie Ca++ w transfekowanych komórkach HEK-293 w celu określenia czy receptory
88-2B i 88C reagowały na którąkolwiek ze znanych chemokin.
Komórki HEK-293 stabilnie transfekowane 88-2B, 88C (bez sekwencji epitopu FLAG) albo kontrolnym regionem kodującym (kodującym IL8R albo CCCKR2, patrz niżej) jak to opisano wyżej, hodowano w butelkach T75 do około 90% zlewności w MEM+10% surowicą. Następnie komórki płukano,
zbierano wersenianem (0,6 mM EDTA, 10 mM Na2HPO4, 0,14 M NaCl, 3 mM KCl i 1 mM glukoza)
i inkubowano w MEM+10% surowica+1 1M Fura-2 AM (Molecular Probes, Inc.) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Fura-2 AM jest barwnikiem reagującym na Ca++. Komórki zawieszono w roztworze soli buforowanym fosforanem, zawierającym 0,9 mM CaCl2 i 0,5 M MgCl2 (D-PBS) w gęstości
około 107 komórek na ml i śledzono zmiany fluorescencji stosując spektrofotometr fluorescencyjny
(Hitachi Model F-4010). Około 106 komórek zawieszono w 1,8 ml D-PBS w kuwecie w 37°C. Długość
fali pobudzającej zmieniano w zakresie 340-380 nm w odstępach 4-sekundowych. Długość fali emisji
wynosiła 510 nm. Kompozycje badane dodawano do kuwety przez zawór doprowadzający, maksymalny napływ Ca++ zarejestrowano po dodaniu jonomycyny.
Odpowiedzi dodatnie obserwowano w komórkach wyrażających IL-SRA, po pobudzeniu IL-8 jak
również, gdy CCCKR2 był pobudzany MCP-1 albo MCP-3. Jednakże, komórki HEK-293 wyrażające
88-2B albo 88C nie wykazywały wewnątrzkomórkowego napływu Ca++ po ekspozycji na którąkolwiek
z poniższych chemokin: MCP-1, MCP-2, MCP-3, MlP-1α, MIP-1β, IL-8, NAP-2, gro/MGSA, IP-10,
ENA-78 albo PF-4 (Peprotech Inc.).
W bardziej czułym teście, obserwowano mikroskopowo napływ Ca++ do nasyconych Fura-2 AM
komórek wyrażających 88-2B, w odpowiedzi na RANTES. W teście zastosowano komórki i odczynniki
wytworzone jak to opisano wyżej. RANTES (z ang. Regulated on Activation, Normal T Expressed and
Secreted) jest chemokiną CC, która jak stwierdzono jest chemoatraktantem i aktywatorem eozynofilów. (Patrz, Neote i in., wyżej). Chemokina ta uczestniczy również w uwalnianiu histaminy przez ba-
PL 192 294 B1
13
zofile i działa również jako chemoatraktant na limfocyty T pamięci in vitro. Modulacja aktywności receptora 88-2B jest więc rozważana jako przydatna w modulowaniu aktywności leukocytów.
Receptor 88C znakowany FLAG poddano ekspresji w komórkach HEK-293 i badano oddziaływanie chemokin w teście napływu Ca++. Ekspresję powierzchniową 88C potwierdzono przez ELISA
i analizę FACScan stosując przeciwciało M1. Chemokiny RANTES, MIP-1α I MIP-1β wywoływały napływ Ca++ do komórek transfekowanych 88C, po dodaniu w stężeniu 100 nM.
Test napływu Ca++ może być również zaprojektowany w celu identyfikacji modulatorów wiązania
receptora chemokin. Poprzedzające testy fluorymetryczne i mikroskopowe przeprowadzane są
w obecności związków badanych. Jeżeli napływ Ca++ jest zwiększony w obecności związku badanego,
związek ten jest aktywatorem wiązania receptora chemokin. W przeciwieństwie, zmniejszony napływ
Ca++ identyfikuje związki badane jako inhibitory wiązania receptora chemokin.
B. Hydroliza fosfoinozytolu
Inny test na ligandy albo modulatory obejmuje śledzenie aktywności fosfolipazy C, jak to opisano w Hung i in., J. Biol. Chem. 116: 827-832 (1992). Początkowo, komórki gospodarza wyrażające
receptor chemokiny nasycane są 3H-inozytolem przez 24 godziny. Związki badane (tj. potencjalne
ligandy) są dodawane do komórek i inkubowane w 37°C przez 15 minut. Następnie komórki są eksponowane na 20 mM kwas mrówkowy w celu solubilizacji i ekstrahowania hydrolizowanych metabolitów przemiany fosfoinozytolu (tj. produktów hydrolizy wywołanej fosfolipazą C). Ekstrakt poddawany
jest chromatografii jonowymiennej przy użyciu kolumny anionowej AG1X8 (w postaci mrówczanu).
Fosforany inozytolu są eluowane 2 M mrówczanem amonu/0,1 M kwasem mrówkowym, zaś 3H związany ze związkiem jest określany spektrofotometrią w fazie ciekłej. Test fosfolipazy C może być również wykorzystany do identyfikacji modulatorów aktywności receptora chemokin. Wspomniane wyżej
testy są wykonywane jak tu opisano, ale z dodatkiem potencjalnego modulatora. Podwyższony poziom wykrywalnego znacznika wskazuje że modulator działa jako aktywator, obniżony poziom znacznika wskazuje, że modulator jest inhibitorem aktywności receptora chemokin.
Test fosfolipazy C był wykonywany w celu identyfikacji ligandów chemokinowych receptora 88C
znakowanego FLAG. Około 24 godziny po transfekcji, komórki COS-7 wyrażające 88C znakowano
przez 20-24 godziny myo-[2-3H]-inozytolem (1 µCi/ml) w pożywce bez inozytolu, zawierającej 10%
dializowaną FCS. Znakowane komórki płukano w pozbawionej inozytolu DMEM zawierającej 10 mM
LiCl i inkubowano w 37°C przez godzinę w DMEM bez inozytolu zawierającej 10 mM LiCl i jedną
z poniższych chemokin: RANTES, MIP-1β, MIP-1, IL-8 albo mysi homolog MCP-1, JE. Tworzenie
fosforanu inozytolu (IP) badano jak to opisano w poprzednim akapicie. Po inkubacji z chemokinami,
pożywkę aspirowano i poddawano komórki lizie przez dodanie 0,75 ml lodowatego 20 mM kwasu
mrówkowego (30 minut). Frakcje nadsączy umieszczano w kolumnach Dowex AG1-X8 (Biorad),
a następnie dodawano natychmiast 3 ml 50 mM NH4OH. Kolumny płukano 4 ml 40 mM mrówczanu
amonu i eluowano 2 M mrówczanem amonu. Całkowitą ilość fosforanu inozytolu badano oznaczając
beta-emisję.
Ponieważ wykazano, że niektóre receptory chemokin takie jak IL8RA i IL8RB, wymagają równoczesnej transfekcji egzogennym białkiem G, aby umożliwić wykrycie sygnalizacji w komórkach
COS-7, receptor 88C współwyrażano z chimerycznym białkiem G Gqi5 (Conkli in., Nature 363:274276 (1993)). Gqi5 jest białkiem G, które posiada pięć aminokwasów końca karboksylowego z Gi (które
wiąże się z receptorem) złożone z Gαq. Równoczesna transfekcja Gqi5 znacznie wzmaga sygnalizację przez CCCKR1 i CCCKR2B. Współ-transfekcja Gqi5 wykazała, że 88C dobrze sygnalizował
w odpowiedzi na RANTES, MIP-1β i MIP-1α, ale nie w odpowiedzi na MCP-1, IL-8 albo mysi homolog
MCP-1, JE. Krzywe odpowiedzi na dawkę wykazały wartości ED50 rzędu 1 nM dla RANTES, 6 mM dla
MIP-1β i 22nM dla MlP-1α.
88C jest pierwszym sklonowanym ludzkim receptorem o odpowiedzi na sygnalizację MIP-1β.
W porównaniu z innymi chemokinami CC, MIP-1β wykazuje unikalny wzorzec aktywacji komórek.
Wydaje się aktywować limfocyty T, ale nie monocyty (Baggiolini i in., wyżej) co jest zgodne
z badaniami nad pobudzaniem receptorów. Przykładowo, podczas gdy MIP-1β wiąże się z CCCKR1,
nie wywołuje napływu wapnia (Neote i in., wyżej). W przeciwieństwie, MlP-1α i RANTES wiążą się
i wywołują sygnalizację przez CCCKR1 i CCCKLR5 (RANTES wywołuje również aktywację CCCKR3).
MIP-1β wydaje się również być bardziej wybiórcza niż inne chemokiny rodziny CC. Taka wybiórczość
ma znaczenie terapeutyczne, ponieważ może być wywołane dobroczynne działanie (takie jak zahamowanie zakażenia HIV) bez pobudzania licznych populacji leukocytów, co powoduje uogólniony stan
zapalny.
14
PL 192 294 B1
C. Testy wiązania
Inne testy na oddziaływane receptora z chemokinami były modyfikacjami testów wiązania opisanych przez Ernsta i in., J. Immunol., 152:3541-3549 (1994). MIP-1β znakowano stosując odczynnik
Boltona-Huntera (di-jodek, NEN), według zaleceń producenta. Nie sprzęgnięty jodek oddzielono od
znakowanego białka przez elucję na kolumnie PD-10 (Pharmacia) zrównoważonej PBS i BSA (1%).
Aktywność właściwa wynosiła zwykle 2200 Ci/mmol. Równowagę wiązania osiągnięto przez dodanie
liganda znakowanego 125I z lub bez 100-krotnego nadmiaru nieznakowanego liganda, do 5x105 komórek HEK-293 transfekowanych 88C znakowanym epitopem FLAG w polipropylenowych probówkach
w objętości końcowej 300 µl (50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM CaCl2 i MgCl2 0,5% BSA) i inkubowanie
przez 90 minut w 27°C wytrząsając w 150 rpm. Komórki zebrano stosując urządzenie Skatron cell
harvester (Skatron Instruments Inc.) na filtry z papieru szklanego nasączonego 0,3% polietylenoiminą
i 0,2% BSA. Po płukaniu, filtry pobrano i oznaczano związany ligand przez pomiar emisji γ. Wiązanie
liganda przez współzawodnictwo z ligandem nieznakowanym określano przez inkubację 5x105 transfekowanych komórek (jak wyżej) z 1,5 nM ligandem znakowanym radioaktywnie i wskazanym stężeniem liganda nie znakowanego. Próbki pobrano, płukano i zliczano jak wyżej. Dane analizowano stosując oprogramowane dopasowujące krzywą Prism (GraphPad Inc.) oraz iteracyjny program regresji
nieliniowej LIGAND (PM220).
W testach wiązania równowagi, receptor 88C wiązał znakowaną radioaktywnie MIP-1β
w sposób swoisty i nasycalny. Analiza tych danych metodą Scatcharda wykazała stałą dysocjacji (Kd)
równą 1,6 nM. Kompetycyjne testy wiązania z użyciem znakowanej radioaktywności MIP-1β wykazały,
że wiązanie o wysokim powinowactwie MlP-1β (IC50=7,4 nM), RANTES (IC50=6,9 nM) i MIP-1α
(IC50=7,4 nM), zgodnie z danymi dotyczącymi sygnalizacji uzyskanymi z przejściowo transfekowanych
komórek COS-7 jak to dyskutowano w sekcji B, wyżej.
P r z y k ł a d 6.
Wykazano, że chemokiny MIP-1α, MlP-1β i RANTES hamują replikację HIV-1 i HIV-2 w ludzkich jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej i komórkach PM1 (Cocchi i in., wyżej). W świetle
tego odkrycia oraz wyników uzyskanych w przykładzie 5 niniejszy wynalazek rozważa, że aktywacja
albo wiązanie liganda przez receptor 88C może zapewnić ochronę w zakażeniu HIV.
Ostatnio opisano, że sierocy receptor związany z białkiem G, fusyna, może działać jako współreceptor dla wniknięcia HIV. Fusyna/CXCR4 w kombinacji z CD4, podstawowym receptorem HIV wyraźnie ułatwia zakażenie HIV hodowanych limfocytów T (Feng i in., Science 272:872-877 (1996)).
W oparciu o homologię fusyny z receptorami chemokin oraz profil wiązania 88C oraz ponieważ 88C
jest konstytutywnie wyrażany na limfocytach T i powszechnie wyrażany na makrofagach, 88C może
być związany z zakażeniami wirusowymi i HIV.
Działanie 88C i 88-2B jako współreceptorów dla HIV określono przez transfekowanie komórek,
które wyrażają CD4, 88C albo 88-2B i eksponowanie równocześnie transfekowanych komórek na HIV.
Zakażeniu uległy jedynie komórki równocześnie wyrażające CD4 i funkcjonalny współreceptor dla HIV.
Zakażenie HIV można stwierdzić kilkoma sposobami. ELISA, które badają ekspresję antygenów HIV
są dostępne w handlu, przykładowo test Coulter HIV-1 na antygen p24 (Patent USA 4,886,742), Coulter Corp. Alternatywnie, komórki mogą być zaprojektowane w celu wyrażania genu reporterowego
takiego jak LACZ połączonego z promotorem HIV LTR (Kimpton i in., J. Virol. 66:2232-2239 (1992)).
W tej metodzie, komórki które ulegną zakażeniu HIV są wykrywalne testem kolorymetrycznym.
88C przejściowo transfekowano do kociej linii komórkowej, CCC (Clapham i in., 181:703-715
(1991), którą stabilnie transformowano w celu ekspresji ludzkiego CD4 (CCC-CD4). Komórki są normalnie odporne na zakażenie którymkolwiek szczepem HIV-1, ponieważ nie wytwarzają one endogennie 88C. W tym doświadczeniu CCC/CD4 przejściowo transfekowano 88C klonowanym do wektora ekspresyjnego pCDNA3.1 (Invitrogen Corp.) stosując Lipofectamine (Gibco BRL). Dwa dni po transfekcji, komórki eksponowano na HIV. Po czterech dniach inkubacji, komórki utrwalono i barwiono na
antygen p24 jako miara zakażenia HIV. Ekspresja 88C te komórki czyniła je podatnymi na zakażenie
niektórymi szczepami HIV-1. Szczepy te obejmowały cztery pierwotne, nie tworzące syncytium izolaty
HIV-1 (M23, E80, SL-2 i SF-162), które jak wykazano, korzystają wyłącznie z 88C jako współreceptora
a nie z fusyny. Niektóre pierwotne szczepy HIV-1, tworzące syncytium w tym szczepu HIV-1
(2006,M13, 2028 i 2076) wykorzystywały 88C albo fusynę jako współreceptor. Również dwa ustalone
klonalnie wirusy HIV-1 (GUN-1 i 89.6) korzystały z 88C albo fusyny, jako współreceptora.
Opisywano, że niektóre szczepy HIV-2 mogą zakażać pewne linie komórkowe CD4-ujemne,
wykorzystując bezpośrednie oddziaływanie HIV-2 z receptorem innym niż CD4 (Clapham i in., wyżej).
PL 192 294 B1
15
Dla niektórych szczepów HIV-2, to zakażenie jest ułatwiane przez obecność rozpuszczalnego CD4
(sCD4). Ponieważ 88-2B wykazuje duże podobieństwo sekwencji z innymi receptorami chemokin,
które działają jako współreceptory HIV (konkretnie 88C i fusyna), rozważano 88-2B jako prawdopodobny współreceptor HIV-2. rola 88-2B jako współreceptora dla HIV-2 została pokazana przy użyciu
HIV-2 ROD/B. Komórki kota CCC, które endogennie nie wyrażają CD4 transfekowano 88-2B. W tym
doświadczeniu, komórki transfekowano pcDNA3.1 zawierającym 88-2B przy użyciu Lipofectaminy
i zakażano HIV-2 w 48 godzin później. Trzy po zakażeniu, komórki znakowano immunologicznie na
obecność glikoproteiny otoczkowej HIV-2. Obecność sCD4 podczas ekspozycji na HIV-2 ROD/B
zwiększała zakażenie tych komórek 10-krotnie. Wnikanie HIV-2 do komórek transfekowanych 88-2B
mogło być zablokowane przez obecność 400-800 ng/ml eotaksyny jednego z ligandów 88-2B. Poziom
aktywności podstawowej CCC/88-2B (bez rozpuszczalnego CD4) stanowił równoważnik aktywności
komórek CCC nie transfekowanych 88-2B.
Rolę 88-2B i 88C jako współreceptorów dla HIV potwierdzono przez wytworzenie i eksponowanie linii komórkowych stabilnie transformowanych 88C i 88-2B przy użyciu różnych szczepów HIV
i SIV. Wyniki te opisano w przykładzie 7.
Alternatywnie, rolę 88C i 88-2B jako współreceptorów można wykazać sposobem nie wymagającym zastosowania żywego wirusa. W tej metodzie, linie komórkowe równocześnie wyrażające 88C
albo 88-2B, CD4 i gen reporterowy LACZ mieszane są z linią komórkową współwyrażającą glikoproteinę otoczkowa HIV (ENV) i czynnik transkrypcyjny dla konstruktu genu reporterowego (Nussbaum i in.,
J. Virol, 68:5411, 1994). Komórki wyrażające funkcjonalny współreceptor dla HIV będą wchodzić
w fuzję z komórkami wyrażającymi ENV, umożliwiając w ten sposób ekspresję genu reporterowego.
W tej metodzie, wykrywanie produktu genu reporterowego testem kolorometrycznym wskazuje, aż
88C albo 88-2B działa jako współreceptor dla HIV.
Mechanizm, dzięki któremu chemokiny hamują zakażenie wirusowe nie został jeszcze wyjaśniony. Jeden z możliwych mechanizmów obejmuje aktywację receptora przez związanie chemokiny.
Wiązanie chemokiny prowadzi do zjawiska przekazania sygnału w komórce, co czyni komórkę odporną na zakażenie wirusowe i/lub zapobiega replikacji wirusa w komórce. Podobnie do indukcji przez
interferon, komórka może się różnicować do osiągnięcia stanu oporności na zakażenie wirusowe albo
do stanu przeciwwirusowego. Alternatywnie, drugi mechanizm obejmuje bezpośrednie zakłócenia
wnikania wirusa do komórki przez blokowanie dostępu glikoprotein otoczki wirusowej do współreceptora przez związanie chemokiny. W tym mechanizmie, do zahamowania zakażenia HIV przez
chemokinę nie jest wymagana sygnalizacja przez białko G.
W celu rozróżnienia pomiędzy dwoma mechanizmami dzięki którym 88C albo 88-2B mogą działać jako współreceptory dla zakażenia wirusowego albo HIV, wiązanie chemokiny z receptorem rozprzęgnięto z przekazywaniem sygnału i określano efekt chemokiny na zahamowanie zakażenia wirusowego.
Wiązanie ligandu może być rozprzęgnięte z przekazywaniem sygnału przez dodanie związków
hamujących sygnalizację przez białko G. Związki te obejmują przykładowo toksynę krztuścową i toksynę cholery. Oprócz tego, polipeptydy efektorowe znajdujące się poniżej mogą być zahamowanie
przez inne związki takie jak wortmannina. Jeżeli sygnalizacja przez białko G jest związana z zahamowaniem zakażenia wirusowego, dodanie takiego związku spowoduje brak zahamowania zakażenia
wirusowego przez chemokinę. Alternatywnie, jeżeli kluczowe reszty albo domeny receptora 88C albo
88-2B wymagane do wiązania białka G mogą być zmienione albo usunięte tak, że wiązanie białka G
jest zmienione albo uszkodzone, ale wiązanie chemokin nie jest zaburzone.
W tych warunkach, jeżeli chemokina jest niezdolna do zahamowania zakażenia wirusowego albo HIV, oznacza to, że sygnalizacja przez białko G jest niezbędna do zahamowania zakażenia wirusowego albo HIV. Jeżeli jednak, chemokiny są zdolne do zahamowania zakażenia wirusowego, wtedy
białko G nie jest niezbędne do zahamowania zakażenia wirusowego albo HIV przez chemokinę i może być spowodowane zablokowaniem przez chemokinę dostępności receptora dla wirusa.
Inne podejście obejmuje zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko 88C albo 88-2B.
Przeciwciała, które wiążą 88C albo 88-2B i które, jak wykazano nie wywołują sygnalizacji przez białko
G mogą blokować dostęp do miejsca wiązania chemokiny albo wirusa na receptorze. Jeżeli w obecności przeciwciał przeciwko 88C albo 88-2B zakażenie wirusowe jest zahamowane, wtedy mechanizm
ochronny chemokin polega na blokowaniu dostępu wirusa do jego receptora. Feng i in., opisują, że
przeciwciała przeciwko końcowi aminowemu receptora fusyny hamują zakażenie HIV.
16
PL 192 294 B1
Przykład 7
Linie komórkowe stabilnie transformowano 88C albo 88-2B w celu dalszego określenia ich roli
w zakażeniu HIV. Kimpton i Emerman, „Detection of Replication-Competent and Pseudotyped Human
Immunodeficiency Virus with a Sesitive Cell Line on the Basis of Activation of an Integrated BetGalctosidase Gene J.Virol., 66 (5): 3026-3031 (1992), opisali wcześniej wskaźnikową linię
komórkową, określaną tu jako komórki HeLa-MAGI. Komórki HeLa-MAGI są komórkami HeLa, które
stabilnie transformowano tak by wyrażały CD4 jak również zintegrowany LTR HIV-1, który napędza
ekspresję genu β-galaktozydazy, położnego w jądrze. Integracja prowirusa HIV do komórki prowadzi
do wytwarzania transaktywatora wirusowego Tat, który z kolei włącza ekspresję genu β-galaktozydazy. Liczba komórek, które barwią się na niebiesko X-gal in situ, jest bezpośrednio zależna od
liczby zakażonych komórek.
Te komórki HeLa-MAGI mogą wykryć zaadaptowane do warunków laboratoryjnych izolaty HIV1, ale wyłącznie niektóre izolaty pierwotne (Kimpton i Emerman, wyżej) i nie potrafią wykrywać większości izolatów SIV (Chackerian i in., Virology 213 (2): 6499-6505 (1995)).
Oprócz tego, Harrington i Geballe, J.Virol. 67:5939-5947 (1993), opisują linię komórkową opartą
na komórkach U373, którą zaprojektowano w celu ekspresji CD4 i tego samego konstruktu LTR-βgalaktozydazy. Wykazano uprzednio, że ta linia, określana tu jako U373-MAGI, nie może ulec zakażeniu jakimkolwiek ze szczepów HIV (M- albo T-tropowym), ale można ją uczynić wrażliwą na zakażenie przez fuzję z komórkami HeLa (Harrington i Geballe, wyżej).
W celu skonstruowania wskaźnikowej linii komórkowej, która mogłaby wykrywać wirusy makrofago- albo limfocytotropowe, DNA 88C albo 88-2B znakowanych epitopem transfekowane do komórek
HeLa-MAGI albo U373-MAGI, przez zakażenie wektorem retrowirusowym, tworząc linie komórkowe
odpowiednio He-La-MAGI-88C albo U373-MAGI-88C. Ekspresję współreceptora na powierzchni wykazano przez znakowanie immunologiczne z użyciem przeciwciała M1 albo przez RT-PCR.
Geny 88C i 88-2B wykorzystywały w konstruktach HeLa-MAGI-88C albo U373-MAGI-88C sekwencje kodujące peptyd sygnałowy prolaktyny i epitop FLAG jak to opisano w przykładzie 4. Gen ten
został wprowadzony do wektora retrowirusowego pBabe-Puro (Morgenstern i Land, Nucl. Acids Res.,
18(2): 3587-3596 (1990)). Wysokie miana wektora retrowirusowego pseudotypowanego białkiem
VSV-G wykonano przez przejściowe zakażenie, jak to opisano w Bartx i in., J.Virol., 70:2324-2331
(1996) i zastosowano do zakażenia komórek HeLa-MAGI i U373-MAGI. Zebrano komórki oporne na
0,6 µg/ml puromycyny (HeLa) i 1 µg/ml puromycyny (U373). Każda pula zawierała co najmniej 1000
niezależnych zjawisk transdukcji. We wczesnych pasażach (pasaż 2) roztwór oryginalnych komórek
HeLa-MAGI (Kimpton i Emerman, wyżej) zastosowano do wytworzenia linii komórkowej HeLa-MAGI-88C.
Zakażenie linii komórek wskaźnikowych HIV wykonano z 12-studzienkowych płytkach
z 10-krotnymi kolejnymi rozcieńczeniami 300 µl roztworu wirusa w obecności 30 µg/ml DEAEdekstranu jak to opisano (Kimpton i Emerman).
Wszystkie szczepy HIY-1 i SIVmac239 uzyskano z NIH AIDS Reference and Reagent Program.
Klony molekularne pierwotnego HIV-27312A (Gao i in., J.Virol., 68) 11): 7433-7447 (1992)) i SIVsmPbj1.9 (Dewhurst i in., Nature 345:636-640 (1990)) otrzymano od B.Hahn (UAB). Wszystkie pozostałe
izolaty SIVmne otrzymano od Julie Overbaugh (U.Washington, Seattle). Roztwory klonowanych prowirusów wykonano przez przejściową transfekcję komórek 293. Inne roztwory wirusa wykonano przez
pasażowanie wirusa na jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej albo na komórkach CEMx174
(dla roztworów SIV). Roztwory wirusa normalizowano przez ELISA albo p24gag (Coulter Immunology)
albo p27gag (Coulter Immunology) na, odpowiednio, HIV-1 i HIV-2/SIV, stosując standardy dostarczone
przez producenta.
Komórki U373-MAGI-88C oraz U373-MAGI (kontrole) zakażano rozcieńczeniami granicznymi
szczepem T-tropowym HIV-1 (HIV-LA1), szczepem M-tropowym (HIV-YU-2) oraz izolatem SIV, SIVmac239. Zakaźność mierzono przez policzenie liczby niebieskich komórek na studzienkę na objętość
wirusa (tabela 2).
17
PL 192 294 B1
Tabela 2
Szczep wirusaa
Miano na linii komórkowej (IU/ml)b
U373-MAGI
U373-MAGI-88C
HIV-1LA1
< 100
< 100
HIV-1Yu-2
< 100
2,2 x 106
SivMAC239
1,2 x 103
4 x 105
a wirus otrzymany przez transfekcję klonów molekularnych do komórek 293
b Jednostki infekcyjne (IU) na ml oznaczają liczbę niebieskich komórek na studzienkę pomnożoną przez
rozcieńczenie nadsączu wirusa i normalizowane na 1 ml objętości końcowej.
Dwa dni po zakażeniu, komórki utrwalano i znakowano na aktywność β-galaktozydazy przy użyciu X-gal. Komórki MAGI otrzymane z komórek U373 znakowano przez 120 minut w 37°C zaś komórki
MAGI otrzymane z komórek HeLa barwiono przez 50 minut w 37°C. Barwienie tła komórek nie zakażonych nigdy nie przekraczało około trzech komórek na studzienkę. Liczono jedynie ciemno niebieskie
komórki, zaś syncytium o licznych jądrach liczono jako jedną komórkę. Miano zakażenia stanowiło
liczbę niebieskich komórek na studzienkę pomnożoną przez rozcieńczenie wirusa i normalizowane na
1 ml. Miano HIV-lYu-2 na komórkach U373-MAGI-88C wynosiło 2x106. W przeciwieństwie, miano
HIV-1Yu-2 wynosiło poniżej 100 na komórkach U373-MAGI-88C. Tak więc, swoistość poszczególnych
szczepów HIV wobec 88C różniła się o cztery rzędy wielkości.
Jakkolwiek zakażenie SIVMAC239 było zwiększone do 4x105 w komórkach U373-MAGI-88C zakażały one również komórki U373-MAGI (tabela 2).
Następnie analizowano serię pierwotnych nie klonowanych szczepów HIV i klonowanych
szczepów HIV-1 M-tropowych, na ich zdolność do zakażania komórek wskaźnikowych wyrażających 88C.
Jak to opisano powyżej, Komórki HeLa-MAGI i HeLa-MAGI-88C zakażono granicznymi rozcieńczeniami różnych szczepów HIV. Dwa klonowane szczepy M-tropowe, HIVJR-CSF i HIVYU-2 zakażały
HeLe-MAGI-88C ale nie HeLa-MAGI, wykazując, że obydwa szczepy wykorzystują 88C jako współreceptor (tabela 3, patrz notatka c). Jednakże, obserwowano znaczną rozbieżność w zdolności obu
szczepów do zakażenia komórek HeLa-MAGI-88C, 6,2x105 lU/ml dla HIVYu-2 i 1,2x104 dla HIVJR-CSF.
Zakaźność roztworu wirusa (tabela 3) jest liczbą jednostek zakaźności na cząsteczkę fizyczną (stanowiącą tu ilość białka rdzenia wirusa). Oprócz tego obserwowano, że zakaźność tych dwóch klonowanych szczepów wirusowych różni się ponad 50-krotnie w roztworach wirusów które przygotowano
niezależnie.
Zmienność zakaźności pierwotnych izolatów wirusa była dalej badana przez analizę kolekcji
dwunastu nie klonowanych roztworów wirusa z trzech różnych regionów (tabela 3). Zastosowano trzy
pierwotne izolaty z regionu A, trzy z regionu E i trzy dodatkowe z regionu B pochodzące z trzech różnych regionów geograficznych. Wszystkie spośród 9 szczepów można było wykryć w komórkach HeLa-MAGI-88C, ale nie w komórkach HeLa-MAGI (tabela 3). Jednakże skuteczność zakażenia różniła
się znacznie od 5 jednostek na ng p24gag do ponad 100 jednostek zakaźności na ng p24gag (tabela 3).
Wyniki te wskazują, że zakaźność szczepów M-tropowych różni się istotnie i nie zależy od pochodzenia. Hipoteza, która może wyjaśnić tą niespójność może obejmować powinowactwo pętli V3 każdego
ze szczepów wirusowych do 88C po związaniu z CD4 (Trkola i in., Nature 384 (6605):184-187 (1996);
Wu i in., Nature 384 (6605): 179-183 (1996)).
18
PL 192 294 B1
Tabela 3
szczep wirusaa
pod typ wirusa
miano (lU/ml) na
(kraj pochodzenia)b
HeLa-MAGI-88Cc
p24gag ng/ml
Zakaźnośćd
281
HIV-1YU-2
B (USA)
6,2 x 105
2200
HIV-1JR-CSF
B (USA)
12000
2800
HIV-1THO20
E (Tajlandia)
4133
93
44
HIV-1THO21
E (Tajlandia)
4967
52
96
HIV-1HO22
E (Tajlandia)
200
15
13
HIV-1US660
B (USA)
2367
127
19
HIV-lUGO31
A (Uganda)
1633
71
23
HIV-1RWO09
A (Rwanda)
3333
158
21
HIV-1RWO26
A (Rwanda)
739
143
HTV-1US727
B (USA)
14,067
289
49
HIV-1US056
B (USA)
5833
284
21
HIV-1LA1
B (Francja)
2,8 x 105
167
1600
4,2
5,2
a HIV-lYU-2 I HIV-lJR-CSF otrzymano przez transfekcję klonów molekularnych. Wszystkie pozostałe badano
jako surowe nadsącza nie klonowanych roztworów wirusa otrzymanych z zakażenia heterologicznych komórek
krwi obwodowej
b Oznaczenie regionu według Myers i in., 1995, dla genu env: kraj pochodzenia oznacza kraj występowania osobnika HIV-pozytywnego od którego uzyskano krew w celu izolacji wirusa (WHO Viral Isolate Program)
c Jednostki infekcyjne (IU) na ml oznaczają liczbę niebieskich komórek na studzienkę pomnożoną przez
rozcieńczenie nadsączu wirusa i normalizowane na 1 ml objętości końcowej. Wszystkie wirusy z wyjątkiem HIV1LAI miały poniżej 10 lU/ml w badaniu na HeLa-MAGI bez 88C. HIV-1LAI, szczep T-tropowy miał miano 2,8x105 na
komórkach HeLa-MAGI bez 88C.
d zakaźność oznacza jednostki zakaźności na ng p24gag (kolumna czwarta podzielona przez kolumnę piątą).
Zdolność Komórek HeLa-MAGI-88C do wykrywania HIV-2 i innych szczepów SIV była również
określana. Opisywano, że HIV-2Rod również korzysta z receptora fusyny nawet pod nieobecność CD4
(Enders i in., Cell 87 (4): 745-756 (1996)). HIV-2Rod potrafi zakazić komórki HeLa-MAGI, jednakże jego
zakaźność jest zwiększona co najmniej 10-krotnie w komórkach HeLa-MAGI-88C (tabela 4). Komórki
HeLa wyrażają naturalnie fusynę. Tak więc klon molekularny HIV-2Rod jest podwójnie tropowy, może
korzystać z 88C jako z współreceptora oprócz CXCR4. Podobnie, pierwotny szczep HIV-27312A zakaża HeLa-MAGI-88C, ale nie komórki HeLa-MAGI, co wskazuje, że podobnie jak pierwotny szczep
HIV-1, korzysta z 88C jako receptora.
Tabela 4
Szczep wirusaa
odnośnik
miano (IU/ml)
b
na HeLa-MAGI
miano (IU/ml)
na HeLa-MAGI-88C
Zakaźność na
c
HeLa-MAGI-88C
HIV-2ROD9
Guyader i in.,1987
967
5900
13
HIV-27312A
Gao i in., 1994
<30
6500
17
SIVMAC239
Naidu i in., 1988
<30
20900
90
SIVMNEC18
Overbaugh i in., 1991
<30
15700
19
SIVMNE170
Rudensey i in., 1995
<30
10700
27
SIVSMPbj1.9
Dewhurst i in., 1990
<30
776
NDd
SiVAGM9063
Hirsh i in., 1995
<30
50
<1
PL 192 294 B1
19
a. Roztwory HIV-2 SIVSMPbj1.9 I SIVAGM9063 badano bezpośrednio po transfekcji klonami molekularnymi
w komórkach 293. Wszystkie pozostałe uzyskano z transfekcji klonów molekularnych i amplifikowano w komórkach CEMx174.
b Jednostki infekcyjne (IU) na ml oznaczają liczbę niebieskich komórek na studzienkę pomnożoną przez
rozcieńczenie nadsączu wirusa i normalizowane na 1 ml objętości końcowej. Wszystkie wirusy w panelu były
negatywne na komórkach HeLa-MAGI-88-2B.
c Zakaźność oznacza jednostki zakaźności (na komórkach wyrażających 88C) na ng p27gag jak oznaczono
przez ELISA.
d
ND, nie stwierdzono
Żaden z badanych szczepów SIV nie zakażał komórek HeLa-MAGI (tabela 4) i żaden nie zakażał komórek HeLa-MAGI wyrażających 88-2B. Wskazuje to, że alternatywny receptor stosowany przez
SIV w komórkach U373 nie ulega ekspresji w komórkach HeLa i nie jest 88-2B. Wszystkie badane
szczepy SIV zakazały komórki HeLa-MAGI-88C w pewnym stopniu (tabela 3) wskazując, że wszystkie
badane szczepy SIV korzystają z 88C jako współreceptora.
Klasyfikacja szczepów M- i T-tropowych HIV często korelowała z innym oznaczeniem „tworzące
syncytium” (SI) i „nie tworzące syncytium” (NSI). Testy oparte na liniach komórkowych opisane tu są
wrażliwe na tworzenie syncytiów. Zakażone komórki mogą tworzyć duże i małe ogniska zakażenia
zawierające liczne jądra (Kimpton i Emerman, wyżej).
Doświadczenia wykorzystujące różne liczne szczepy wirusa i U373-MAGI-88C i HeLa-MAGI88C pokazują, że oznaczenia SI/NSI nie są przydatne, ponieważ wszystkie szczepy wirusowe tworzą
syncytia jeżeli obecny jest odpowiedni współreceptor. Doświadczenia te pokazują, że tworzenie syncytiów jest raczej znacznikiem obecności odpowiedniego współreceptora na zakażonej komórce, niż
wskaźnikiem tropizmu. Zakażenie komórek He-La-MAGI-88C przez szczepy SIV opisywane w literaturze jako nie tworzące syncytiów, konkretnie SIVMAC239, SIVMNEc18 i SIVMNE170 było znaczące, ponieważ wielkość syncytiów wywołanych w jednowarstwie była znacznie większa niż indukowane przez
inne szczepy HIV.
Przykład 8
Wytworzono przeciwciała monoklonalne, które swoiście rozpoznawały 88C. Przeciwciała wytworzono przez immunizację myszy peptydem odpowiadającym 20 aminokwasom końca aminowego
88C. Peptyd sprzęgnięto z hemocyjaniną mięczaka Keyhole limpet (KLH) według protokołu producenta (Pierce, Imject KLH aktywowana maleimidem), emulgowano w kompletnym adiuwancie Freunda
i wstrzyknięto pięciu myszom. Dwa dodatkowe wstrzyknięcia koniugowanego peptydu w niekompletnym adiuwancie Freunda powtórzono w odstępie trzech tygodni. Dziesięć dni po ostatnim wstrzyknięciu, surowice od myszy badano na aktywność z peptydem w teście ELISA. Oprócz tego, aktywność
immunologiczną surowic badano wobec kompletnego receptora 88C wyrażanego na powierzchni komórek 293 przez sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Mysz o najlepszej aktywności wobec 88C została wybrana do fuzji splenocytów i wytwarzania przeciwciał monoklonalnych
standardowymi sposobami laboratoryjnymi. Ustalono pięć linii monoklonalnych (227K, 227M, 227N,
227P, 227R), które wytwarzały przeciwciała rozpoznające peptyd w teście ELISA i białko 88C na komórkach 293 w analizie FACS. Wykazano, że każde przeciwciało reaguje wyłącznie z komórkami 293
wyrażającymi 88C, ale nie z komórkami 293 wyrażającymi blisko spokrewniony receptor MCP
(CCCKR-2). Wykazano również, że każde z przeciwciał rozpoznaje 88C przejściowo wyrażany na
komórkach COS.
Wytworzono również królicze surowice poliklonalne przeciwko 88C. Dwóm królikom wstrzyknięto koniugowany peptyd aminokońcowy jak to opisano wyżej. Króliki dalej immunizowano, przez dodatkowe cztery wstrzyknięcia peptydu. Surowicę od każdego z królików (2337J i 2470J) badano przez
FACS na komórkach 293 wyrażających 88C. Surowice rozpoznawały swoiście 88C na powierzchni
komórek 293.
Pięć przeciwciał monoklonalnych badano pod względem ich zdolności do blokowania zakażenia
komórek przez SIV, małpi wirus niedoboru odporności, blisko spokrewniony z wirusem HIV (Lehner
i in., Nature Medicine 2:767 (1996)). Małpie limfocyty TCD4+, które są normalnie podatne na zakażenie SIV, inkubowano z klonem SIVmac32HJ5 w obecności nadsączy przeciwciał monoklonalnych przeciwko 88C rozcieńczonych 1:5. Zakażenie SIV mierzono przez określenia aktywności odwrotnej transkryptazy (RT) dnia 9 przy pomocy metod wykrywania RT i oznaczania ilościowego (Quan-T-RT,
20
PL 192 294 B1
Amersham). Cztery z przeciwciał blokowały zakażenie SIV: przeciwciała 227K w 53%, 227M w 59%,
227H w 47% i 227P w 81%. Przeciwciało 227R nie blokowało zakażenia SIV.
Pięć przeciwciał monoklonalnych wywołanych przeciwko ludzkiej 88C zastosowano do zbadania aktywności przeciwko 88C makaka (który wykazywał pewne różnice w końcu aminowym w regionie amino-końcowym). Sekwencja kodująca ludzkiego 88C i 88C makaka zostały wklonowane do
wektora ekspresyjnego pcDNAS (Invitrogen). Te plazmidy ekspresyjne zastosowano do transfekowania komórek COS stosując DEAE. Pusty wektor zastosowano jak kontrolę negatywną. Trzy dni
po transfekcji, komórki zebrano i inkubowano z pięcioma przeciwciałami monoklonalnymi i przygotowano do badania FACS. Wyniki pokazują, że pięć przeciwciał (227K, 227M, 227N i 227P) rozpoznają
88C makaka zaś jedno (227R) nie rozpoznaje. Wszystkie pięć przeciwciała rozpoznaje transfekowany
ludzki 88C i nie reaguje krzyżowo z komórkami transfekowanymi samym wektorem.
Przykład 9
Dodatkowe sposoby mogą być zastosowane w celu identyfikacji ligandów i modulatorów receptorów chemokin.
W jednym wykonaniu, wynalazek obejmuje bezpośrednie badanie na ligandy. Związki badane
znakowane w sposób umożliwiający wykrycie eksponuje się na preparaty błon zawierające receptory
chemokin w konformacji funkcjonalnej. Przykładowo, komórki HEK-293 albo komórki hodowlane transfekuje się nośnikiem ekspresyjnym kodującym receptor chemokin. Następnie wytwarza się preparat
błon z transfektowanych komórek. Preparat błon jest eksponowany na związki badane znakowane 125I
(np. chemokiny) i inkubuje się w odpowiednich warunkach (np. 10 minut w 37°C). Membrany, ze związanym związkiem badanym, są następnie zbierane na filtrze pod wpływem filtracji próżniowej i płukane w celu usunięcia nie związanego zawiązku badanego. Radioaktywność związana ze związanym
związkiem badanym jest oznaczana przez spektrofotometrię scyntylacyjną w fazie płynnej. Swoistość
wiązania związku badanego może być potwierdzona przez powtórzenie testu w obecności rosnących
stężeń nie znakowanego związku badanego i rejestrowanie poziomu współzawodnictwa o wiązanie
z receptorem. Te testy wiązania mogą również identyfikować modulatory wiązania receptora chemokin. Uprzednio opisany test wiązania może być wykonywany z następującymi odmianami. Oprócz
znakowanego związku badanego, również potencjalny modulator eksponuje się na preparat błon.
Zwiększony poziom znacznika związanego z błonami wskazuje, że potencjalny modulator jest aktywatorem, obniżony poziom znacznika związanego z membranami oznacza, że potencjalny modulator jest
inhibitorem wiązania receptora chemokin.
W innym wykonaniu, wynalazek obejmuje pośredni test identyfikujący ligandy, który wykorzystuje wiązanie receptorów chemokin z białkami G. Jak to opisuje Lindner i in., Sci. Am., 267:56-65 (1992)
podczas przekazywania sygnału aktywowany receptor oddziaływuje z białkiem G, aktywując je. Białko G
jest aktywowane przez wymianę GDP na GTP. Następująca potem hydroliza GTP związanego z białkiem G dezaktywuje białko G.
Jeden z testów na aktywność białka G śledzi uwalnianie 32P z [γ-32P]-GTP. Przykładowo, około
7
5x10 komórek HEK-293 niosących plazmidy według wynalazku hoduje się na pożywce MEM+10%
FCS. Pożywka hodowlana zawiera dodatek 5 mCi/ml [32P]-fosforanu sodu przez 2 godziny w celu
jednorodnego znakowania pul nukleotydowych. Komórki są płukane w izotonicznym buforze o niskiej
zawartości fosforanów. Jedna porcja komórek jest następnie eksponowana na związek badany podczas gdy druga porcja jest traktowana podobnie, ale bez ekspozycji na badany związek. Po okresie
inkubacji (np. 10 minut) komórki są odwirowywane, poddawane lizie i frakcjonowane pod kątem nukleotydu przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej, wywoływanej w 1M LiCl. Znakowane GTP
i GDP są identyfikowane przez znane standardy. Znakowane GTP i GDP są następnie badane ilościowo standardowymi technikami autoradiograficznymi. Względnie wysoki poziom GDP znakowanego 32P identyfikuje badany związek jako ligand. Ten rodzaj testu hydrolizy GTP może być również
przydatny do identyfikacji modulatorów wiązania receptora chemokin. Powyższy test jest wykonywany
w obecności potencjalnego modulatora. Wzmocniony sygnał spowodowany względnym wzrostem
hydrolizy GTP, wytwarzanie znakowanego 32PGDP wskazuje na względne pobudzenie aktywności
receptora. Wzmocniony sygnał identyfikuje więc potencjalny modulator jako aktywator. I przeciwnie,
obniżony względny poziom GDP znakowanego 32P, świadczy o tym, że potencjalny modulator jest
inhibitorem wiązania z receptorem chemokin.
Aktywności cząsteczek efektorowych białka G (np. cyklazy adenylowej, fosfolipazy C, kanałów
jonowych i fosfodiesteraz) są również przydatne do badania. Testy aktywności tych cząsteczek efektorowych opisano uprzednio. Przykładowo, cyklaza adenylowa, która katalizuje syntezę cyklicznego
PL 192 294 B1
21
monofosforanu adenozyny (cAMP) jest aktywowana przez białka G. Stąd, wiązanie ligandu z receptorem chemokin, które aktywuje białko G, które z kolei aktywuje cyklazę adenylową, może być stwierdzone przez śledzenie poziomów cAMP w rekombinowanej komórce gospodarza według wynalazku.
Stosując odpowiednie kontrole znane w dziedzinie wiedzy, podwyższony poziom wewnątrzkomórkowego cAMP może być przypisany zwiększonej aktywności receptora na skutek związania liganda,
identyfikując go w ten sposób. Ponownie stosując kontrole znane w stanie techniki względne zmniejszenie stężenia cAMP może pośrednio identyfikować inhibitor aktywności receptora. Stężenie cAMP
może być mierzone dostępnymi w handlu enzymatycznymi testami immunologicznymi. Przykładowo
zestaw BioTrak dostarcza odczynników do kompetycyjnego testu immunologicznego (Amersham,
Inc.). Stosując ten zestaw według zaleceń producenta, reakcja jest zaprojektowana tak, aby obejmowała współzawodniczący nie znakowany cAMP z cAMP sprzęgniętym z peroksydazą chrzanową. Nie
znakowany cAMP może być uzyskany, przykładowo, z aktywowanych komórek wyrażających receptor
chemokin według wynalazku. Dwa związki współzawodniczą o wiązanie z unieruchomionym przeciwciałem przeciwko cAMP. Po reakcji współzawodnictwa, unieruchomiony koniugat peroksydazy chrzanowej/cAMP jest oznaczany testem enzymatycznym z użyciem substratu tetrametylobenzydyny/H2O2
z wykrywaniem produktów reakcji kolorowej przy długości fali 450 nm. Wyniki dostarczają podstaw do
obliczania poziomu nie znakowanego cAMP, przy użyciu technik standardowych. Oprócz identyfikacji
ligandów wiążących receptor chemokin, test cAMP może być również zastosowany do identyfikacji
modulatorów wiązania receptora chemokin. Stosując rekombinowaną komórkę gospodarza według
wynalazku, test wykonywany jest jak to opisano wcześniej. Stosując odpowiednie kontrole znane
w dziedzinie wiedzy, podwyższony albo obniżony poziom wewnątrzkomórkowego cAMP może być
przypisany zwiększonej albo obniżonej aktywności cyklazy adenylowej. Poziom aktywności cyklazy
adenylowej z kolei odzwierciedla aktywację albo zahamowanie interesującego receptora chemokin.
Względne zwiększenie stężenia cAMP może pośrednio identyfikować aktywator aktywności receptora;
względne obniżenie poziomu aktywności receptora identyfikuje inhibitor.
O ile niniejszy wynalazek opisany został konkretnymi wykonaniami, należy rozumieć, że możliwe są jego odmiany i modyfikacje. W związku z powyższym jedyne ograniczenia nałożone na wynalazek zostały przedstawione w dołączonych zastrzeżeniach patentowych.
22
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
23
24
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
25
26
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
27
28
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
29
30
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
31
32
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
33
34
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
35
36
PL 192 294 B1
PL 192 294 B1
37
38
PL 192 294 B1
Zastrzeżenia patentowe
1. Oczyszczony i izolowany polinukleotyd kodujący sekwencję aminokwasową receptora chemokin 88-2B podaną na Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
2. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest DNA.
3. Polinukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że jest genomowym DNA.
4. Polinukleotyd według zastrz. 2, znamienny tym, że jest cDNA.
5. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest całkowicie albo częściowo chemicznie syntetyzowanym DNA.
6. Transkrypt RNA polinukleotydu określonego w zastrz. 2.
7. cDNA według zastrz. 4, znamienny tym, że obejmuje DNA o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.
8. Biologicznie czynny wektor, znamienny tym, że obejmuje DNA określony w zastrz. 2.
9. Wektor według zastrz. 8, znamienny tym, że DNA jest połączony funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję DNA.
10. Komórka gospodarza stabilnie transformowana albo transfekowana DNA określonym w zastrz. 1, w sposób umożliwiający ekspresję tego DNA.
11. Sposób wytwarzania polipeptydu 88-2B, znamienny tym, że obejmuje etapy hodowania
komórek gospodarza określonych w zastrz. 10 w odpowiedniej pożywce i izolowania polipeptydu z komórki albo z pożywki.
12. Polinukleotyd kodujący polipeptyd 88-2B, znamienny tym, że hybrydyzuje w surowych warunkach hybrydyzacji z polinukleotydem o Identyfikatorze Sekw. Nr 3.
13. Oczyszczony i izolowany polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową receptora chemokin 88-2B podaną w Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
14. Produkt typu przeciwciała, znamienny tym, że swoiście wiąże polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową receptora chemokin 88-2B podaną w Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
15. Hybrydoma wytwarzająca produkt typu przeciwciała określony w zastrz. 14.
16. Sposób przesiewowego wykrywania modulatora infekcji HIV in vitro, znamienny tym, że
obejmuje następujące etapy:
a) doprowadzenie do kontaktu pierwszej kompozycji obejmującej receptor 88-2B człowieka
o Identyfikatorze Sekw. Nr 4 lub kodowany przez polinukleotyd określony w zastrz. 1 albo 12, z drugą
kompozycją obejmującą białko otoczki ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) w obecności lub
nieobecności wykrywanego związku,
b) pomiar oddziaływań receptora 88-2B człowieka określonego w pkt. a) z białkiem otoczki HIV
w obecności lub nieobecności wykrywanego związku, oraz
c) przesiewowe wykrywanie modulatora infekcji HIV, w którym zmniejszony albo zwiększony
poziom oddziaływania receptora 88-2B człowieka określonego w pkt. a) z HIV w obecności związku
w porównaniu z poziomem oddziaływania w jego nieobecności wskazuje, czy związek jest modulatorem infekcji HIV.
PL 192 294 B1
39
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że receptor 88-2B człowieka jest ludzkim receptorem 88-2B o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w Identyfikatorze Sekw. Nr 4.
18. Sposób według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że pierwsza kompozycja obejmuje rekombinowaną komórkę modyfikowaną tak, że wyraża receptor 88-2B człowieka na swojej powierzchni.
19. Sposób według zastrz. 16 albo 17, albo 18, znamienny tym, że druga kompozycja obejmuje ludzki wirus niedoboru odporności.
20. Sposób według zastrz. 18 albo 19, znamienny tym, że etap pomiarowy obejmuje pomiar infekcji komórki wirusem HIV.
21. Sposób wykrywania infekcji komórek wirusem HIV, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) doprowadzenia do kontaktu rekombinowanej komórki modyfikowanej tak, że wyraża przynajmniej jeden ludzki 88-2B o Identyfikatorze Sekw. Nr. 4 lub kodowany przez polinukleotyd określony
w zastrz. 1 albo 12, z wirusem HIV, oraz
b) wykrywania infekcji komórek wirusem HIV.
22. Produkt typu przeciwciało określony w zastrz. 14, do zastosowania w terapii.
23. Produkt typu przeciwciało określony w zastrz. 14, do leczenia infekcji HIV i chorób związanych z HIV i chorób związanych z HIV.
24. Zastosowanie produktu typu przeciwciała określonego w zastrz. 14, do wytwarzania leku do
leczenia infekcji HIV i chorób związanych z HIV.
40
PL 192 294 B1
Departament Wydawnictw UP RP
Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.