Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku

Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Opublikowane na LABportal.pl - laboratoria (http://www.labportal.pl)
Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Dorota Kręgiel
Obecnie szacuje się, że klasyczne metody płytkowe pozwalają na oznaczenie zaledwie
1-10% składu populacji stanowiącej określony ekosystem [1]. Rozbieżności między
wynikami badań mikroskopowych a hodowlanych wynikają głównie z niemożności
symulowania warunków środowiskowych zapewniających wzrost większości
mikroorganizmów w warunkach laboratoryjnych. Znaczna część mikroorganizmów
środowisk naturalnych, aktywna metabolicznie, jest niezdolna do wzrostu w postaci
kolonii na dostępnych pożywkach agarowych [16]. Wprowadzenie pojęcia “żywe lecz nie
dające się hodować” (VBNC – ang. viable but nonculturable) przez Byrda i Colwella w
latach 80 ubiegłego stulecia dało początek niezwykle ważnym badaniom dotyczącym
wykrywania tego rodzaju komórek w różnych środowiskach.
Występowanie bakterii VBNC w wodzie
Naturalne ekosystemy, np. woda, gleba, osady i muły stanowią środowisko bytowania dla
zróżnicowanej populacji mikroorganizmów, w której występują komórki VBNC [1, 2]. Liczba
rodzajów/gatunków bakterii tego stanu wykrywanych w środowisku wodnym stale wzrasta,
szczególnie w ostatnim dwudziestoleciu. Większość badań dotyczących występowania stanu VBNC u
mikroorganizmów dotyczy bakterii gramujemnych. Należą do nich populacje szczepów
chorobotwórczych i oportunistycznych: Escherichia coli, Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes,
Legionella pneumophila, Salmonella enteritidis (serovar Typhimurium), Salmonella enterica,
Citrobacter freundii, Campylobacter jejuni, Pseudomonas putida, Shigella dysenteriae (typ1),
Enterobacter agglomerans. Jednak niezdolność wzrostu na pożywkach agarowych odnotowano także
dla bakterii gramdodatnich: Micrococcus flavus, Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Listeria
monocytogenes [4, 8].
Przejście komórek do fazy VBNC zachodzi głównie w warunkach stresogennych. Wiele czynników,
m.in. temperatura, stężenie soli, tlen, dostępność składników pokarmowych, światło, wpływa na
zdolność bakterii do podziału komórkowego.
W populacjach Salmonella Typhimurium wykazano heterogenność i sukcesję poszczególnych stanów
fizjologicznych komórek wraz z podwyższeniem stopnia uszkodzeń komórkowych w tych populacjach
[5]. Wyniki badań eksperymentalnych dowiodły, że możliwe jest indukowanie stanu VBNC w
komórkach bakterii chorobotwórczych, należących do Salmonella sp., Campylobacter jejuni, Vibrio
vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica oraz Escherichia coli [2].
Należy pamiętać, że komórki drobnoustrojów patogennych w stanie VBNC pozostają metabolicznie
aktywne. Osiąganie przez szczepy patogenne lub oportunistyczne stanu VBNC stanowi poważny
problem zdrowotny, zwłaszcza, że komórki takie charakteryzują się zwykle większą wirulencją niż
komórki nie poddane warunkom stresogennym [4]. Przykład stanowić może Campylobacter jejuni,
który występuje w dwóch różnych formach morfologicznych, typowej pałeczki i atypowej formie
ziarniaka w stanie VBNC. Podobne zjawisko zmian morfologicznych i minituryzację komórek
Strona 1 z 6
Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Opublikowane na LABportal.pl - laboratoria (http://www.labportal.pl)
zaobserwowano u szczepów Escherichia coli i Helicobacter pylori w procesie osiagania stadium
VBNC. Obydwie formy były zdolne do wywołania infekcji. Analizy chromatograficzne wykazały
również modyfikacje w składzie chemicznym ściany komórkowej oraz wzrost właściwości
autolitycznych komórek VBNC [14].
Detekcja komórek VBNC
Obecność w środowisku drobnoustrojów w stanie VBNC można wykazać wykorzystując metody
oznaczania żywotności komórek, z wyłączeniem klasycznych metod hodowlanych. Do takich metod
należy zaliczyć: pomiary potencjału membranowego, poziomu pH wewnątrz komórek, znakowanie
komórek barwnikami fluorescencyjnymi, oznaczenia aktywności specyficznych enzymów, pomiar ATP
oraz techniki DNA i RNA [2].
W celu rozróżniania żywych komórek i komórek VBNC w wodach naturalnych stosowana jest metoda
bezpośrednia DVC (DVC- ang. direct-viable-count). Po kilkugodzinnej inkubacji w wodzie, bakterie są
przenoszone do pożywki minimalnej zawierającej niewielkie ilości substancji odżywczych oraz
inhibitor replikacji DNA: kwas nalidyksowy dla bakterii gramujemnych i enrofloksacynę lub
ciprofloksacynę dla bakterii gramdodatnich. W tych warunkach metabolicznie aktywne komórki
wykorzystują substancje pokarmowe i ulegają znacznemu wydłużeniu – elongacji [6] (fot. 1).
Strona 2 z 6
Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Opublikowane na LABportal.pl - laboratoria (http://www.labportal.pl)
Fot. 1.
Obserwacje mikroskopowe komórek poddanych działaniu inhibitora replikacji DNA pozwalają na
dokładne oszacowanie udziału w populacji komórek metabolicznie aktywnych (kilkakrotnie
wydłużonych) i komórek niezdolnych do namnażania.
Szybkie oznaczenia żywotności i/lub aktywności metabolicznej komórek bakteryjnych wchodzących
w skład zróżnicowanych populacji można osiągnąć stosując metody znakowania izotopowego,
metody cytochemiczne, pomiar aktywności określonych dehydrogenaz lub metodę mikrokolonii.
W metodzie znakowania izotopami promieniotwórczymi komórki bakteryjne zawieszane są w
Strona 3 z 6
Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Opublikowane na LABportal.pl - laboratoria (http://www.labportal.pl)
medium zawierającym znakowany substrat zawierający 14C lub 3H. Metabolicznie aktywne komórki,
zdolne do wykorzystania substratu, po włączeniu do przemian komórkowych 14C-znakowanej
glukozy, wydzielają 14CO2 .
Do oznaczania komórek VBNC w populacjach bakteryjnych można zastosować również metodę
barwienia z solami terazolowymi, np. INT [chlorek (2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-fenylo
tetrazoliowy] lub CTC [chlorek 5-cyjano-2,3-ditolylo tetrazoliowy]. Związki tetrazolowe redukowane
są przez dehydrogenazy do odpowiednich formazanów: niebieskiego INT-formazanu lub czerwonego
CTC-formazanu o właściwościach fluorescencyjnych (rys. 1).
.
Rys. 1.
Dodatkowe barwienie komórek barwnikiem DAPI [4’,6-diamidino-2-fenyloindol], fluoryzującym na
niebiesko, pozwala na lepszy kontrast i dokładniejsze liczenie żywych bakterii z zastosowaniem
mikroskopii fluorescencyjnej [12, 13].
Aktywność dehydrogenaz związana jest z energetycznym metabolizmem komórek, stąd zdolność
komórek do redukcji związków terazolowych może stanowić indykator żywotności komórek bakterii,
w tym bakterii beztlenowych [3].
Wzajemne relacje między wynikami tradycyjnych metod płytkowych, bezpośrednich metod
mikroskopowych z oranżem akrydyny oraz metod cytochemicznych z solami tetrazolowymi zostały
opisane m.in. dla komórek Pseudomonas sp. Subpopulacja wykazująca aktywność oddechową w
teście z INT była pod względem liczebności 10-krotnie większa niż inna subpopulacja komórek
zdolnych do wzrostu w postaci kolonii [7].
Metoda mikrokolonii jest zbliżona do konwencjonalnych metod hodowlanych. Zdolność
inkubowanych komórek do tworzenia mikrokolonii jest oceniana mikroskopowo. Jako niedoskonałość
tej metody należy wymienić nie tylko krótki czas inkubacji ze względu na limitację tlenem i
składnikami pokarmowymi, ale także akumulację szkodliwych metabolitów i tzw. „przerastanie”
mikrokolonii. Metoda ta jest mało dokładna, gdyż pozwala na określenie żywotności populacji
zawierającej co najmniej 106 komórek/ml. W ostatnich latach wprowadzono do omawianej metody
szereg modyfikacji, np. mikrokolonie mogą być tworzone na filtrach membranowych umieszczonych
na powierzchni stałych lub ciekłych pożywek, co pozwala na hodowle komórek bez limitacji tlenu i
składników pokarmowych. Zwiększa to również szanse tworzenia mikrokolonii przez osłabione lub
Strona 4 z 6
Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Opublikowane na LABportal.pl - laboratoria (http://www.labportal.pl)
wolno rosnące komórki bakteryjne. Zastosowanie pożywek rozcieńczonych pozwala na uniknięcie
przerastania mikrokolonii, a zastosowanie anaerostatów umożliwia wzrost beztlenowców.
Wizualizacja formowanych mikrokolonii może być udoskonalona przy zastosowaniu mikroskopii
flurescencyjnej i barwienia komórek, np. oranżem akrydyny. Opisane modyfikacje pozwalają na
obniżenie poziomu detekcji do 104 komórek/ml. Obecnie coraz częściej łączy się technikę
mikrokolonii z zastosowaniem fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał, specyficznych dla
szczepów z rodzajów Salmonella lub Pseudomonas [3].
W technikach genetycznych ekspresja genu z zastosowaniem indukcyjnych markerów genetycznych
może służyć jako jedna z metod oznaczania żywotności komórek [4]. Zasada oznaczeń komórek
VBNC oparta jest na ekstrakcji DNA/RNA oraz amplifikacji, klonowania i sekwencjonowania z
wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną
transkrypcją (RT-PCR, ang. reverse transcription polimerase chain reaction) i techniki NASBA (ang.
nucleic acid sequence-based amplification) [9, 11, 14]. Porównanie wyników sekwencjonowania z
bazą danych pozwala na identyfikację rodzajową lub nawet gatunkową badanych mikroorganizmów.
Poprzez kombinację tych metod z techniką elektroforetycznego rozdzielania zamplifikowanych
fragmentów DNA, możliwe jest nawet wyznaczenie profili zmian ilościowych w składzie danego
ekosystemu [2].
Detekcję komórek VBNC w środowisku można prowadzić również metodą „gfp-tagging” poprzez
wprowadzenie do materiału genetycznego bakterii genu gfp pobranego z bakterii E. coli [10]. Zielone
białko florescencyjne GFP (ang. green fluorescent protein) kodowane przez gen gfp jest powszechnie
stosowanym białkiem reporterowym, umożliwiającym monitorowanie ekspresji genu, a także
lokalizację białka GFP w komórkach. Po ekspresji genu komórki transformowane produkują białko
GFP, które można oznaczać ilościowo metodą fluorometryczną lub prowadzić obserwacje z
zastosowaniem mikroskopu fluorescencyjnego.
Poznanie natury zjawiska VBNC oraz wykrycie i ilościowe oznaczenie szczepów w tym stanie
fizjologicznym, stymuluje prace dotyczące doskonalenia procedur analitycznych z zastosowaniem
szybkich metod detekcji i oceny żywotności poszczególnych komórek i całych populacji
mikroorganizmów. Rozwój metod pozwalających precyzyjnie wykryć bakterie w stanie VBNC
przyczyniłby się do znacznej poprawy kontroli bezpieczeństwa zdrowotnego wody w codziennej
konsumpcji i użytkowaniu.
Piśmiennictwo
1. Exner M., Vacata V., Gebel J. Public health aspects of the role of HPC – an introduction. In:
Heterotrophic Plate Counts and Drinking Water. Ed. J. Bartram, J.Cotruvo, M.Exner, C. Fricker, A.
Glasmacher. WHO, 2003, Publishing by IWA Publishing, London, UK.
2. Fleet G.H. Microorganisms in food ecosystems. Int. J. Food Microbiol., 1999, 50, 101-117
3. Nybroe O. Assessment of metabolic activity of single bacterial cells – new developments in
microcolony and dehydrogenase assays. FEMS Microbiol. Ecol. 1995, 17, 77-84
4. Rowan N.J. Viable but non-culturable forms of food and waterborne bacteria: Quo vadis? Trends
Food Sci. Technol. 2004, 15, 462-467.
5. Weichart D.H. Stability and survival of VBNC cells – conceptual and practical implications.
Microbial Biosystems: New Frontiers. Proceedings of the 8th International Symposium on Microbial
Ecology, Halifax, Canada, 1999.
6.Chae M.S., Schraft H. Cell viability of Listeria monocytogenes biofilms. Food Microbiol., 2001, 18,
Strona 5 z 6
Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym
Opublikowane na LABportal.pl - laboratoria (http://www.labportal.pl)
103-112.
7.Leclerc H., Moreau A. Microbiological safety of natural mineral water. FEMS Microbiol. Rev. 2002,
26, 207-222.
8.Winfield M.D., Groisman E. A. Role of nonhost environments in the lifestyles of Salmonella and
Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69, 3687-3694.
9. Heim S., Del Mar Lleo M., Bonato B., Guzman. C.A., Canepari P. The viable but nonculturable state
and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome
analysis. J. Bacteriol. 2002, 184, 6739-6745.
10. Cho J-Ch., Kim S-J. Green fluorescent protein-based direct viable count to verify a viable but
non-culturable state of Salmonella typhi in environmental samples. J. Microbiol. Methods. 1999, 36,
227-235.
11. Coleman S.S., Oliver J.D. Optimization of conditions for the polymerase chain reaction
amplification of DNA from culturable and nonculturable cells of Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol.
Ecol. 1996, 19, 127-132.
12. Cappelier J.M., Lazaro B., Rossero A., Fernandez-Astorga A., Federighi M. Double staining
(CTC-DAPI) for detection and enumeration of viable but non-culturable Campylobacter jejuni cells.
Vet. Res. 1997, 28, 547-555.
13. Chaveerach P., ter Huurne A. A. H. M., Lipman L. J. A., van Knapen F. Survival and resuscitation of
ten strains of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli under acid conditions. Appl. Environ.
Microbiol. 2003, 69, 711-714.
14. Dahm H., Strzelczyk E. Żywe lecz nie dające się hodować bakterie. Post. Mikrobiol. 2004, 43,
251-265.
15. Ishiyama M. Why is the water-soluble formazan necessary? Dojindo Newsletter, 2
(http://www.dojindo.com/newsletter.html)
16. Kozdrój J. Różnorodność mikroorganizmów glebowych w świetle badań molekularnych. Post.
Mikrobiol. 2004, 43, 375-398.
Adres URL źródła (wygenerowano 19/07/2017 - 01:08):
http://www.labportal.pl/article/wykrywanie-komorek-bakterii-vbnc-w-srodowisku-wodnym
Strona 6 z 6