Opornosc HIV na leki - metody, interpretacja wynikow

Oporność HIV na leki - metody, interpretacja wyników,
wskazania do diagnozowania
Zespół PDM +Janusz J. Stańczak
Pracownia Diagnostyki Molekularnej
Wojewódzki Szpital Zakaźny
Warszawa
Wirusowy mechanizm powstawania
lekooporności
Wysoka wydajność replikacji
HIV: 1010–1011 wirionów na
dobę syntezowanych de novo
Niska wierność RT HIV –
- niemożliwa korekta błędnego
wbudowania nukleotydów
Dziennie powstaje ok. 1-2x109
wirionów zmutowanych w
regionach RT lub Pr
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
18
14
13
13
12
11
10
lsk
Po
H
isz
pa
ni
a
cja
Fr
an
gl
ia
An
ro
pa
Eu
st
ra
lia
Au
sy
k
M
ek
a
na
d
Ka
U
a
9,5
8,5
SA
odsetek nowych zakażeń
Częstość zakażeń mutantami
o obniżonej wrażliwości
Rozbieżności w definicji oporności, stosowanych algorytmach,
analizowanych mutacjach, itp. utrudniają miarodajne porównania
Phenotypic resistance (% patients)
Drug-resistant HIV in patients with
primary HIV infection
IC50 >10-fold increase via PhenoSense HIV (ViroLogic)
15
NNRTI
10
PI
5
NRTI
0
1995
1996
1997
1998
1999
2000
(n=11)
(n=56)
(n=101)
(n=97)
(n=90)
(n=23)
Little SJ, et al. N Engl J Med 2002;347:385–94
HIV DR- problemy nowe
Oporność na inhibitory fuzji/wejścia
• Mutacje gównie w regionie Env gp41
• Substytucje aa w końcu N regionu HR-1, w sekwencji GIVQQQ
niezbędnej do fuzji
• Zmiana konformacji gp41, powodująca nieprzyłączanie T-20
Fuzja HIV-komórka, faza I
Michał Majchrzak za- Trimeris & Roche, 2002
Fuzja HIV-komórka, zablokowanie
Michał Majchrzak za- Trimeris & Roche, 2002
HIV DR- problemy nowe (cd)
Oporność na inhibitory dojrzewania (maturacji)
• Kwas betulinowy -first-in-class maturation inhibitor
- (DSB)- PA-457
• punkt docelowy- późna faza dojrzewania proteiny Gag
– cięcie prekursora kapsydu (CA-SP1)
• skutek – hamowanie obróbki białek kapsydu, dalej
– zaburzenie kondensacji rdzenia wirusa
HIV DR- problemy nowe (cd)
Oporność na inhibitory dojrzewania (maturacji)
•
3 prace - The Cold Spring Harbor Laboratory's 30th
Annual Meeting on Retroviruses, Cold Spring Harbor, NY,
May 24-29, 2005
•
Pasaże przez środowisko zawierające suboptymalne stężenia
PA-457- aa changes which conferred PA-457-resistance were
limited to the CA-SP1 cleavage site
Wpływ mutacji na wydolność replikacyjną HIV
Mutacje powodujące lekooporność najczęściej upośledzają
funkcjonowanie proteazy i odwrotnej transkryptazy
Szczepy lekooporne replikują gorzej w stosunku do szczepów
dzikich – mają mniejszą zdolność replikacyjną
Możliwy „zysk” kliniczny z obniżonej zdolności replikacyjnej:
- załamanie wirusowe nie zawsze zwiastuje
załamanie kliniczne pacjenta (Brigido L, 2004 i liczne inne)
- wolniejszy postęp choroby
Wydolność
replikacyjna
Wpływ poszczególnych mutacji
na wydolność replikacyjną
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
NRTI
NNRTI
PI
WT TAMS*M184V K65R K103NG190A D30N L90M
Zależność między liczbą mutacji
a wydolnością replikacyjną
180
160
140
120
80
60
40
20
0
-20
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Wydolność replikacyjna
100
Liczba mutacji w PR i RT
Adherencja –okienko selekcji
wariantów R
Mark Sulkowski, HEPDART, USA 2005
Zależność szlaku selekcji mutacji R
od stężenia leku (Amprenavir)
Wysoki poziom APV
APV (ng/mL)
APV (ng/mL)
Niski poziom APV
I50V-inhibition
Threshold
I54L/M-inhibition
Threshold
Hours
I50V replication
Hours
I50V replication
I54L/M Replication
I54L/M dominuje
I50V dominuje
Elston R, et al. 8th CROI, Chicago 2001, #465
Technologie identyfikujące
lekooporność HIV
Genotypowanie
Identyfikacja mutacji powiązanych z klinicznie obserwowaną
lekoopornością
Fenotypowanie
Ocena wrażliwości izolatu HIV na lek mierzona stężeniem leku
hamującym replikację wirusa (najcz. o 50% - IC50) w hodowli in vitro;
ilość p24 jako miara replikacji, WO jako miara kliniczna
Wirtualne fenotypowanie
Porównanie efektu klinicznego wykrytych mutacji z wcześniej opisanymi,
skompletowanymi z banku danych 150 000 przypadków
Artificial intelligence
Sieci neuronowe
Interpretacja (?) wyniku algorytmy
Estimation of phenotypic clinical cutoffs (CCO)
for vircoTYPE®
Assessment of variability of CCOs for NRTIs
TDF
DDI
D4T
3TC
ZDV
0.1
1
Fold Change
10
100
Assessment of variability of CCOs for PIs
LPV
/r
SQV/RTV
SQV
NFV
APV/RTV
APV
IDV/RTV
IDV
0.1
1
Bacheler L, et al. 44th ICAAC, Washington 2004, #H-1133
Fold change
10
100
How should clinical cutoffs be used?
• Drugs with susceptibility below clinical cutoff
– Most likely to provide virologic response
– Preferred drugs for treatment regimens
– Does not guarantee successful response
• Drugs with susceptibility above clinical cutoff
– Less likely to provide virologic response
– Probability of response decreases as fold change increases
– Does not completely rule out use of drug
– Increased drug exposure may overcome resistance
Technologie identyfikujące
lekooporność HIV
Wirtualne fenotypowanie:
Oparte jest na bazie danych, w której gromadzone są
sekwencje HIV pochodzące z próbek klinicznych i odpowiadające
im fenotypy
Obecnie ponad 150 000 „par”
Uwzględnia wszystkie powiązania między mutacjami
Tak samo wiarygodne jak rzeczywiste fenotypowanie1
Usługa komercyjna (VirtualPhenotypeTM)
J Acquir Immune Defic Syndr 2003;32:268-279
Kiedy zastosować właściwy test
Przydatność kliniczna
Fenotypowanie + genotypowanie
Genotypowanie
Fenotypowanie
Rosnąca złożoność genetyczna
Naiwny
1 niepowodzenie 2
3
4
5
Historia leczenia
W: https://www.virologichiv.com/mdr/2500.asp
Ograniczenia genotypowania
1. Testy wykazują najwyższą dokładność przy identyfikowaniu
oporności dla aktualnego schematu leczenia
2. Brak oporności na używany wcześniej lek nie wyklucza istnienia
rezerwuarów szczepu opornego (mogącego się ujawnić po ponownym
włączeniu danego leku).
3. Jeżeli oporność na dany lek została kiedykolwiek wykryta, lek ten
nie powinien być użyty kolejny raz, ponieważ najprawdopodobniej
istnieją „zarchiwizowane” mutanty.
Identyfikacja lekooporności HIV
PBMCS-HIV jako czynnik prognostyczny DR
•Pozakomórkowe (cell –free) izolaty HIV najlepszym markerem DR
•Prowirus unika presji leków
•Ciągła wymiana między cell-free—cell-associated populacjami
•Różne stężenia leków w różnych kompartmentach- różna presja
selekcyjna
•Różnice w DR między wirusami krążącymi a obecnymi w PBMCs
•Różnice w DR między wirusami obecnymi w różnych subpopulacjach
leukocytów
ZALECENIA
Europejskie Zalecenia dotyczące
oznaczania lekooporności
• Testowanie powinno być rozważone przed rozpoczęciem leczenia
• zalecane przed rozpoczęciem leczenia, gdy transmisja szczepów
lekoopornych wynosi ponad 10%
• zalecane, gdy ryzyko zakażenia szczepem opornym jest wysokie
(np. źródłem zakażenia była osoba leczona antyretrowirusowo
• zalecane dla kobiet w ciąży z wykrywalną pomimo leczenia wiremią
• zalecane dla dzieci matek z wykrywalną wiremią w okresie porodu
AIDS. 2001 Feb 16;15(3):309-20
Zalecenia cd 2
Modyfikacje dyskutowane w grudniu 2005 r.
- Uwzględnienie najnowszych danych o transmisji szczepów R
- Rozróżnienie między ostrą a świeżą infekcją
- Uwzględnienie różnorodności genetycznej HIV-1
- Wprowadzenie działu poświęconego HIV-2
- Uwzględnienie problemu oporności na inhibitory wejścia
- Decyzje w przypadku całkowitej oporności na leki- przerwać leczenie
i czekać na przewagę wariantu dzikiego?, kontynuować? wycofywać
poszczególne leki licząc na resztkową aktywność podstawowych?
- Preferowane genotypowanie - jest korzystniejsze klinicznie od
fenotypowania
- Międzynarodowe kontrole jakości testowania
HIV DR w Polsce 2005
Ośrodki
Kliniki (14)
SPREAD
limit
230
50
wykorzystano (?)
67
0 (nie uwzględniając
ośrodków warszawskich)
Uwarunkowania polskie
-do dyskusji
•zalecane po I i II niepowodzeniu terapeutycznym
• Test powinien być wykonany w trakcie prowadzonej nieskutecznej
terapii ARV lub nie później niż 4 tyg. po jej przerwaniu.
•zalecane przed rozpoczęciem leczenia, gdyż transmisja
szczepów lekoopornych wynosi ponad 10%
•do rozważenia dla kobiet w ciąży z wykrywalną pomimo
leczenia wiremią
• do rozważenia dla dzieci matek z wykrywalną wiremią
w okresie porodu
Uwarunkowania polskie
- koszty
Abbott - 980 (300 rocznie)
VG
- 1 080
860 (600)
1 000
+ koszty laboratoryjne 190
(izolacja, 2xPCR, sprzęt jednorazowy,
koszty osobowe)
Uwarunkowania polskie
- źródła finansowania
- Krajowe Centrum ds AIDS
- Firmy dobrodzieje
- Środki własne
Uwarunkowania polskie
- co możemy sami
Intensywna, twórcza dyskusja
Ustalenia
Deklaracje
Wykonanie
dyskusja
• Możliwość wykonywania genotypowania w
kilku referencyjnych laboratoriach
• Badanie określenia oporności szczepów
wirusowych wykonywane wg ustalonych
standardów jest badaniem usługowym.