Metody „biologii komórki”

2014-03-06
Wybrane, współczesne metody badań
struktury i funkcji komórek
Materiał do badań biologii komórek
(organizmów)
Chemiczne składniki komórek
Metody „biologii komórki”
• Współczesne
badania mikroskopowe
• Barwienia cytochemiczne
• Wizualizacja cząsteczek w Ŝywej komórce
• Hodowle komórkowe
Badania biochemiczne i molekularne
w biologii komórki
1
2014-03-06
BADANIA MIKROSKOPOWE
MIKROSKOPY
gr. mikros = mały; gr. skopein = patrzeć
przyrządy do obserwacji pod duŜym powiększeniem
przedmiotów blisko umieszczonych
• świetlne
• elektronowe
• nieoptyczne np. AFM
Mikroskopy świetlne
wykorzystują widzialne pasmo fal elektromagnetycznych
Zespół optyczny:
• źródło światła
• przesłona
oświetlacz
• kondensor
• obiektyw
• pośrednie układy optyczne
• okular
obraz mikroskopowy:
pozorny, silnie powiększony, odwrócony
2
2014-03-06
Mikroskopy świetlne
Zespół mechaniczny:
• podstawa
• statyw
• stolik przedmiotowy
• rewolwer
• tubus
• śruba makro- i mikrometryczna
Mikroskopy świetlne
Zdolność rozdzielcza mikroskopu
λ
d = κ --------2A
A = n x sin α
A = apertura numeryczna
λ = długość fali światła tworzącego obraz
κ = współczynnik zaleŜny od stosunku
A kondensora do A obiektywu
α = kąt między osią optyczną a skrajnym
promieniem wpadającym do obiektywu
n = współczynnik załamania fali
w środowisku
Ob
2α
K
gdy A = 1,4 i λ = 0,45µm
d = 0,2 µm
3
2014-03-06
Wizualizacja komórek przejrzystych
Kontrastowanie komórek:
• barwienia
• odmiany mikroskopów:
kontrastowo-fazowe
polaryzacyjno-interferencyjne
(z układem optycznym Nomarskiego)
Mikroskop kontrastowo-fazowy
Fizyk holenderski Frits
1953 - nagroda Nobla
Zernike - opracował zasadę kontrastu-faz;
bezpośrednie przekształcenie
zmian fazowych fali
świetlnej w badanym
preparacie na zmiany
natęŜenia światła w obrazie
mikroskopowym tego
preparatu
• przesłona pierścieniowa kondensora
• płytka fazowa w obiektywie
Układ optyczny, który przesuniecie fazy fali świetlnej
przekształca w zmianę amplitudy
4
2014-03-06
śywe komórki zwierzęce: zdjęcie spod mikroskopu:
a) jasnego pola, b) kontrastu-faz,
Mikroskopy świetlne
specjalne odmiany mikroskopów
Fibroblast (HSF) z hodowli; zdjęcie spod mikroskopu: A)
jasnego pola, B) kontrastu-faz, C) kontrastu róŜnicowego
Nomarskiego, D) ciemnego pola
5
2014-03-06
Mikroskop fluorescencyjny
wykorzystuje zjawisko
fluorescencji substancji :
•obecnych w komórce:
chlorofil, witamina A,
porfiryny, lipofuscyny
• wprowadzonych
(znaczniki fluorescencyjne):
fluoresceina, rodamina, oranŜ
akrydyny, DAPI, Hoechst,
bromek etydyny, Alexa,
Cyto.....
Mikroskop fluorescencyjny
oświetlenie
epi
epi fluorescencja
6
2014-03-06
Mikroskop fluorescencyjny
Wrzeciona mitotyczne w metafazie u
embriona muszki owocowej Drosophila
(DNA wybarwione na zielono;
mikrotubule wrzeciona na czerwono).
Mitoza w komórkach płuc traszkiw hodowli
(DNA wybarwione na niebiesko;
mikrotubule wrzeciona na zielono).
„uniwersalny
mikroskop badawczy”
wykorzystanie róŜnych
odmian mikroskopii
świetlnej przy uŜyciu
1 przyrządu
wizualizacja i analiza procesów biologicznych z
wykorzystaniem zautomatyzowanych systemów
mikroskopowych (chłodzone kamery CCD);
moŜliwości poklatkowej rejestracji obrazów;
cyfrowy zapis obrazów i analiza.
7
2014-03-06
Mikroskopy elektronowe
transmisyjny mikroskop elektronowy (TME)
cewki
magnetyczne
próŜnia
TME dla preparatów biologicznych:
d- 2nm, pow. do 1mln razy
Mikroskopy elektronowe
transmisyjny mikroskop elektronowy
8
2014-03-06
Mikroskopy elektronowe
skaningowy mikroskop elektronowy
SME dla preparatów biologicznych: d – od 3 do 20 nm
Mikroskopy elektronowe
skaningowy mikroskop elektronowy
10µm
10µm
Mikrografia szczurzych fibroblastów z
hodowli in vitro ( na podłoŜu plastikowym)
Mikrografia komórek droŜdŜy piekarskich
9
2014-03-06
Mikroskopy elektronowe
przygotowanie materiału do mikroskopii
1. Utrwalanie
2. Osmowanie (utrwalanie wtórne)
3. Odwadnianie
4. Zatapianie
- Ŝywice epoksydowe; Ŝywice akrylowe
5. Krojenie skrawków i nakładanie na siatki
grubość: 20 -60 nm (noŜe szklane lub diamentowe)
6. Kontrastowanie skrawków
- octan uranylu (białka, kwasy nukleinowe)
cytrynian ołowiu (lipidy, wielocukry)
Wizualizacja struktury komórki
• Klasyczne barwienia cytologiczne
(histologiczne)
• Metody immunocytochemiczne
oparte na wysokiej swoistości wiązania antygenu z
przeciwciałem
• Autoradiografia
metoda wykrywania izotopów promieniotwórczych
dzięki ich zdolności do zaczerniania emulsji światłoczułej
10
2014-03-06
Barwienia cytologiczne (histologiczne)
Hematoksylina (jądra)
powinowactwo do struktur
zasadochłonnych, ujemnie naładowanych
(DNA, RNA, kwaśne białka)
Eozyna (substancja międzykomórkowa)
powinowactwo do cząsteczek
kwasochłonnych
Komórki zbiorczego kanalika moczowego nerki
Immunocytochemia
Znaczniki:
• fluorochromy
• enzymy
• metale cięzkie
• antygen
-kaŜda substancja w komórce, która ma właściwości
immunogenne
• przeciwciało
- immunoglobulina skierowana przeciw danemu antygenowi
róŜnorodność
swoistość przeciwciał
11
2014-03-06
Immunocytochemia
Metody wizualizacji cząsteczek
w Ŝywej komórce
Genetyczne znakowanie białek
GFP (green fluorescent protein) zielono białko fluoryzujące
(z cyklicznym trójpeptydem ser-tyr-glic )
• wprowadzanie genu kodującego GFP
do komórki i łączenie z genem
kodującym badane białko
(technika rekombinacji DNA)
• śledzenie znakowanych białek w
Ŝywych komórkach (białka fuzyjne)
238 aa
Aequorea
vicotria
Nagroda Nobla 2008
Osamu Shimomura
Martin Chalfie
Roger Y. Tsien
12
2014-03-06
Materiał do badań biologii komórki
• Pobieranie materiału z organizmów
• Hodowle komórkowe
• Organizmy modelowe
Hodowla komórek i tkanek
utrzymanie przy Ŝyciu oddzielonych od organizmu komórek
(w warunkach sztucznych), in vitro → hodowla
• dostarczenie wszystkich składników i odpowiednich
warunków niezbędnych do wzrostu i rozwoju
- poŜywki: odpowiedni skład, pH, osmolarność
poŜywki naturalne (osocze, wyciągi tkankowe)
poŜywki sztuczne (zdefiniowane; z dodatkiem surowicy)
- temperatura, %CO2
13
2014-03-06
• zachowanie jałowości
- jałowość całej procedury hodowli
- naczynia hodowlane
- antybiotyki
Hodowla komórek i tkanek
Zdjęcie mioblastów
w hodowli
Zdjęcie fibroblastów
w hodowli
Zdjęcie komórek prekursorowych
oligodendrocytów w hodowli
14
2014-03-06
Organizmy modelowe
w badaniach
Cecha
Zalety
małe rozmiary
i proste poŜywienie
hodowla nie wymaga duŜo miejsca,
jest łatwa i tania w utrzymaniu
pozwala na wiarygodną analizę
statystyczną wzorów dziedziczenia
umoŜliwia obserwację wzorów
dziedziczenia w kolejnych pokoleniach
mała ilość DNA do analizy;
łatwiej badać chromosomy w mikroskopie
świetlnym
wiele genetycznych mutantów jest
dostępnych do analiz
duŜa liczba potomstwa
krótki cykl Ŝyciowy
mały genom
duŜe chromosomy
dostępność informacji i
technik badawczych
Organizmy modelowe -Prokarionty
Escherichia coli (pałaczka okręŜnicy)
(Enterobacteriaceae)
Gram-ujemna bakteria
flora bakteryjna jelita grubego
symbiont
podział co 20min
Poznanie mechanizmów
replikacji, transkrypcji i
translacji
2µm; 0,8µm
1 kolista cząsteczka DNA
4,6 mln par zasad; 4300 białek
od 15 tys. do 30 tys. rybosomów
15
2014-03-06
Organizmy modelowe -Eukarionty
Organizmy jednokomórkowe
Saccharomyces cerevisiae - droŜdŜe piekarskie
DNA 12,1 mln par zasad (2,5 x więcej)
Poznanie mechanizmów
6 275 genów (5800 funkcjonalnych)
cyklu komórkowego
23% genomu droŜdŜy - jak u ludzi
komórki eukariotycznej
kompletna sekwencja genomu (1-szy eukariont)
Rośliny modelowe
bliskie pokrewieństwo ewolucyjne roślin
kwiatowych (200mln lat)
z 300 000 gatunków
Arabidopis thaliana
- rzodkiewnik pospolity
5-30 cm
Łatwość hodowli
w szklarniach
hydroponiczna
Genom -110 mln par zasad, znana sekwencja
Badania mechanizmów rozwoju i róŜnicowania roślin kwiatowych
16
2014-03-06
Zwierzęta modelowe
Caenorhabditis elegans - nicień
Genom
97 mln par zasad
19 000 genów
sekwencja znana
Poznanie
959 komórek
70% białek człowieka ma
odpowiedniki u C. elegans
mechanizmów rozwoju
embrionalnego i działania
wielu genów (apoptozy)
Drosophila melanogaster - muszka owocowa
genom (4 chromosomy)
185 mln par zasad
Samiec i samica
13 000 białek
Poznanie podstaw
genetyki klasycznej
i mechanizmów rozwoju
zarodkowego i larwalnego
17
2014-03-06
Kręgowce modelowe
Danio rerio – Danio pręgowany (ryby)
Genom
1,527,000,581par zasad
17 330 genów białek
sekwencja znana
Poznanie
Szybki rozwój
Łatwość uzyskiwania
mutantów
mechanizmów rozwoju
embrionalnego i działania
wielu genów kręgowców
Mus musculus – Mysz domowa (ssaki)
Prosta i tania hodowla
DuŜa liczba potomstwa
Zarodki myszy moŜna łatwo hodować in vitro
Zarodki hodowane in vitro moŜna poddawać
licznym manipulacjom np. nokauty genowe
Uzyskiwanie myszy transgenicznych
(z ekspresją obcego genu)
Linie myszy z mutacjami genowymi lub
skonstruowanymi genami
Izolacja i hodowla in vitro komórek ES
Genom: sekwencja poznana
mysz ma 2,7 mld par zasad,
człowiek ok. 3,1 mld par zasad,
mysz ma 20 par chromosomów,
człowiek - 23 pary
Poznanie mechanizmów
działania wielu genów na
poziomie komórki i
całego organizmu
18
2014-03-06
Homo sapiens – człowiek (ssaki)
Badania na róŜnorodnych komórkach ludzkich w hodowlach in vitro
( defekt w genie kit - komórki barwnikowe)
PoniewaŜ geny człowieka mają ścisłe odpowiedniki u organizmów
prostszych , to badania tych organizmów (modelowych) mogą być
kluczem do zrozumienia jak skonstruowane są i jak funkcjonują
organizmy zwierzęce i organizm człowieka.
Chemiczne składniki komórek
Zbudowane z takich samych
związków jak materia nieoŜywiona
96,5% masy komórek
H, O, C i N
65%
Pierwiastki chemiczne w komórkach:
- makroelementy (pierwiastki biogenne)
H, O, C, N, S, P
Ca, Mg, K, Na, Cl
>1% suchej masy
- mikroelementy
Fe, Cu, Mn, Mo, B, Zn, Co, J, F
0,01% - 0,00001% suchej masy
18%
3%
- ultraelementy
Ra, Au, Ag, Pt, Se
<10-6 % suchej masy
19
2014-03-06
Komórki wykorzystują prawa fizyki i chemii, aby przeŜyć
„Chemia komórki”
• opiera się na związkach C (związki organiczne)
• zaleŜy od reakcji przebiegających w środowisku wodnym,
wąskim zakresie temperatur
• wykazuje ogromną złoŜoność
• zdominowana przez cząsteczki polimerowe
• zachodzące reakcje są ściśle kontrolowane
(miejsce, czas)
Chemiczne składniki komórek
DNA
jony nieorganiczne 1%
małe cząsteczki organiczne 3%
RNA
makrocząsteczki
białka
26%
polisacharydy
ogromne zagęszczenie cząsteczek
dynamika ruchu i oddziaływań cząsteczek
20
2014-03-06
Skład chemiczny komórki bakteryjnej
% masy
komórki
jony nieorganiczne
1
małe cząsteczki organiczne
3
cukry i ich prekursory
1
aminokwasy i prekursory
0,4
nukleotydy i prekursory
0,4
kwasy tłuszczowe i prekur.
1
inne
0,2
makrocząsteczki
26
liczba rodzajów
cząsteczek
20
800
250
100
100
50
300
3000
Małocząsteczkowe związki organiczne:
masa cząst. 100 –1000
do ok. 30 atomów C
cukry, aminokwasy, nukleotydy, kwasy tłuszczowe
ok. 1000 rodzajów cząsteczek w komórce eukariotycznej
• wolne cząsteczki w cytoplazmie
• jednostki monomeryczne makrocząsteczek
elementy konstrukcyjne makrocząsteczek i struktur komórkowych
źródło energii
inne funkcje (sygnałowe)
21
2014-03-06
Cukry - małocząsteczkowe związki
Monosacharydy
(CH2O) n
n=3–7
- róŜnorodność
C6H12O6
stereoizomeria
n- liczba C
2n - stereoizomerów
D- galaktoza
D- glukoza
D-mannoza
izomeria optyczna
L- glukoza
D- glukoza
Monosacharydy - pochodne cukrów
glukozy
kwas glukuronowy
glukozoamina
N-acetyloglukozoamina
Disacharydy (dwucukry)
- róŜnorodność
11 róŜnych disacharydów z kondensacji
2 cząsteczek glukozy
22
2014-03-06
Małocząsteczkowe związki organiczne aminokwasy
R –łańcuch boczny
forma niezjonizowana
forma zjonizowana
20 aminokwasów – powszechnych (α
α-amiokwasów) biogennych
kwaśne (Asp, Glu)
zasadowe (Lys, Arg, His)
polarne bez ładunku (Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr)
niepolarne (Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, Trp, Cys)
aminokwasy
izomeria optyczna
formy D- i L- aminokwasów
D i L-alanina
L- aminokwasy – białka
D- aminokwasy – ściany komórek bakterii
antybiotyki
jednostki monomeryczne
peptydów, polipeptydów, białek
23
2014-03-06
Małocząsteczkowe związki organiczne nukleotydy
Nukleotydy:
adenina
rybonukleotydy
deoksyrybonukleotydy
trifosforan
Zasady azotowe:
pirymidynowe:
ryboza
cytozyna (C), tymina, (T) uracyl (U)
adenozyna
Purynowe:
film
ATP
adenina (A), guanina (G)
Małocząsteczkowe związki organiczne nukleotydy
krótkotrwałe nośniki energii chemicznej
(ATP, GTP)
nośniki innych grup chemicznych
cząsteczki sygnałowe (cAMP)
połączone z innymi cząsteczki (CoA)
monomery kwasów nukleinowych
(przekaz informacji biologicznej)
24
2014-03-06
Małocząsteczkowe związki organiczne
–kwasy tłuszczowe
R-COOH (R oznacza łańcuch węglowodorowy),
C: 14-24
zwykle 16-18
łańcuchy nasycone
łańcuchy nienasycone
(cis)
cząsteczka amfipatyczna kwasu palmitynowego
–kwasy tłuszczowe
C 18; 1=
C 18
kwas oleinowy
kwas stearynowy
kwas linolenowy
C18; 3=
C 18; 2=
w komórkach (zwykle) :
estry lub amidy;
kwas linolowy
25
2014-03-06
Makrocząsteczki
Ogólna reakcja uzyskiwania/degradacji makrocząsteczek
H-
-OH
+ H-
+H2O
hydroliza
H-
-
-
-
- H2O
kondensacja
-
-
-
-
wiązania
kowalencyjne
glikozydowe
peptydowe
fosfodiestrowe
podjednostka - makrocząsteczka
Makrocząsteczki
• róŜnorodność sekwencji
Białko o łańcuchu 150 aminokwasów - 20150 kombinacji
DNA o łańcuchu 10 000 nukleotydów -
410 000 kombinacji
Trisacharyd - setki kombinacji (łańcuchy rozgałęzione)
• róŜnorodność konformacji (elastycznośc łańcuchów)
• łączenie podjednostek w odpowiedniej kolejności = sekwencja
• reakcje katalizowane przez enzymy
26
2014-03-06
unikatowy układ przestrzenny makrocząsteczek
- wiązania niekowalencyjne:
wodorowe
jonowe
van der Waalsa
hydrofobowe
własności biologiczne
Makrocząsteczki
wiązania niekowalencyjne
-wybiórcze wiązanie innych cząsteczek
powierzchnie „nie pasują”,
ruchy termiczne rozdzielają
cząsteczki
powierzchnie „ pasują”,
cząsteczki związane wiązania niekowalencyjne
27
2014-03-06
aminokwasy - peptydy/ polipeptydy/ białka
polarność strukturalna
wiązanie peptydowe
α-helisa;
β-harmonijka;
superhelisa;
oligomeryzacja
sekwencja peptydu: Phe-Ser-Glu-Lys
kwasy nukleinowe
wiązanie
fosfodiestrowe
DNA; RNA
peptyd G-A-T-C
28