prof. dr hab. Dariusz Bartosik Zakład Genetyki Bakterii Instytut

advertisement
prof. dr hab. Dariusz Bartosik
Zakład Genetyki Bakterii
Instytut Mikrobiologii
Uniwersytet Warszawski
ul. Miecznikowa 1
02-096 Warszawa
Warszawa, 22.06.2017
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Kingi Bondarczuk
pt. „Opornośd na antybiotyki beta-laktamowe u bakterii bytujących w oczyszczalni ścieków w
Żywcu i Jeziorze Żywieckim"
wykonanej w Katedrze Mikrobiologii, Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska
Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach
pod kierunkiem prof. dr hab. Zofii Piotrowskiej-Seget
Zastosowanie antybiotyków w terapii medycznej oraz w rolnictwie pozwoliło, przez dziesiątki
lat, nie tylko na skuteczną walkę z bakteriami patogennymi, lecz także na zwiększanie biomasy
roślin i zwierząt hodowlanych. Produkcja antybiotyków na skalę przemysłową i ich
niekontrolowane stosowanie, spowodowało akumulację tych związków (i produktów ich
przemian) w różnych środowiskach. W dużej mierze wynika to z dynamicznego rozwoju
medycyny, weterynarii i metod hodowli roślin i zwierząt. Przekonują o tym m.in. dane European
Medicines Agency, według których jedynie w 2014 roku sprzedano w Polsce aż 578 ton
antybiotyków, z przeznaczeniem do hodowli zwierząt.
Jako główne przyczyny powstawania i rozprzestrzeniania oporności bakterii na
antybiotyki, wymienia się: (i) nadmierne i niewłaściwe stosowanie tych leków, które dokonują
selekcji klonów opornych, pojawiających się w sposób naturalny w ich populacjach, (ii)
przenoszenie genów opornościowych między różnym gospodarzami bakteryjnymi, drogą
horyzontalnego transferu genów (HGT; ang. horizontal gene transfer) oraz (iii)
rozprzestrzenianie się drobnoustrojów opornych za sprawą m.in. mobilności ludzi i zwierząt.
Opornośd na antybiotyki, kojarzona wcześniej jedynie z izolatami klinicznymi bakterii, jest zatem
zjawiskiem bardziej powszechnym. Postuluje się, że bakterie bytujące w środowiskach
naturalnych stanowią bogaty rezerwuar genów oporności, które mogą byd przekazywane
bakteriom patogennym w wyniku HGT, co stanowi poważny problem natury klinicznej. W
efekcie, leczenie zakażeo i chorób infekcyjnych staje się coraz trudniejsze, coraz więcej
mikroorganizmów dysponuje znanymi od dawna determinantami oporności, coraz szybciej
pojawiają się także nowe warianty genów opornościowych, stanowiące skuteczną odpowiedź
drobnoustrojów na wprowadzane do użytku środki terapeutyczne najnowszych generacji.
Problem ten przestaje byd wyłącznie przedmiotem zainteresowao środowisk naukowych,
bowiem, ze względu na zakres obserwowanego zjawiska, zyskuje wymiar globalny.
1
Swoistym „tyglem”, będącym bogatym rezerwuarem genów oporności, są oczyszczalnie
ścieków, w których występują drobnoustroje oporne na niemal wszystkie stosowane w
lecznictwie antybiotyki i związki o działaniu antybakteryjnym. Należy podkreślid, że liczne
determinanty oporności, często sprzężone są z ruchomymi elementami genetycznymi, m.in.
plazmidami i transpozonami. Transfer tych elementów do innych gospodarzy, w połączeniu z
silną presją antropogeniczną, umożliwia generowanie i selekcję szczepów wieloopornych, które
trafiają, wraz z oczyszczonymi ściekami, do naturalnych środowisk wodnych. Zagadnieniem
niezwykle ważnym, lecz wciąż w niedostatecznym stopniu poznanym, jest określenie
rzeczywistego wpływu mikroorganizmów wprowadzanych z oczyszczalni ścieków do wód
powierzchniowych, na strukturę i właściwości konsorcjów bakterii bytujących w środowiskach
naturalnych.
Recenzowana rozprawa doktorska wpisuje się w ten nurt tematyczny. Jej zasadniczym
celem było monitorowanie mikrobiomu i rezystomu bakterii na różnych etapach procesów
przeprowadzanych w Żywieckiej Oczyszczalni Ścieków, a także w wodach Jeziora Żywieckiego,
które są odbiornikiem ścieków z tego Zakładu. Należy podkreślid, że Oczyszczalnia ta jest
odbiorcą ścieków z terenów objętych szczególną ochroną, jakimi są tereny Żywieckiego Parku
Krajobrazowego, a wody Jeziora Żywieckiego zasilają również położony niżej zbiornik w Czaocu,
który jest miejscem poboru wody dla aglomeracji Śląskiej.
Główne zadania badawcze rozprawy obejmowały (i) określenie liczebności hodowalanych
frakcji mikroorganizmów w badanych środowiskach, (ii) poznanie bioróżnorodności zespołów
bakterii oraz genów warunkujących antybiotykoopornośd w metagenomach badanych
środowisk, a także (iii) identyfikację plazmidów (naturalnych, mobilnych nośników
genetycznych), odpowiedzialnych za rozprzestrzenianie oporności na antybiotyki β-laktamowe.
Właśnie tej grupie antybiotyków Doktorantka poświęciła w pracy szczególną uwagę, co jest w
pełni zrozumiałe, biorąc pod uwagę fakt, że β-laktamy stanowią najczęściej wykorzystywaną w
praktyce grupę terapeutyków, co, niestety, pociąga za sobą narastająca opornośd na te związki.
Mając na względzie wagę zagadnienia antybiotykooporności bakterii oraz znikomy stan wiedzy
na temat zakresu tego zjawiska w środowiskach naturalnych naszego kraju, uważam że podjęcie
tej tematyki w ocenianej rozprawie było w pełni zasadne.
Ocena układu pracy
Przedstawiona do oceny rozprawa została napisana w języku polskim i ma w zasadzie układ
typowy dla większości prac eksperymentalnych, a przygotowując ją zachowano zrównoważone
proporcje w objętości poszczególnych rozdziałów. Praca liczy łącznie 109 stron i zawiera 20
ilustracji oraz 11 tabel. Została ona przygotowana starannie pod względem językowym i
edytorskim.
W początkowej części pracy wyróżniono dwa równocenne rozdziały - jednostronicowy
Wstęp oraz 16 stronicowy Przegląd literatury, który stanowi zasadnicze wprowadzenie do
tematyki badao. Rozdzielenie tych treści na dwa niezależne rozdziały nie wydaje mi się celowe.
2
W rozprawie zamieszczono także, oprócz opisu części metodycznej, Wyników i Dyskusji, (i)
Wykaz stosowanych skrótów, (ii) rozdział Wnioski, punktujący najważniejsze osiągnięcia pracy,
(ii) Streszczenie, w języku polskim angielskim i oraz (iii) Aneks, w którym zestawiono częśd
wyników analiz metagenomicznych.
Ocena poszczególnych części pracy
Rozdział Przegląd literatury składa się z 5 równocennych części. W pierwszej opisano problem
antybiotykooporności u bakterii, zwracając uwagę na przyczynę tego zjawiska, ewolucyjne
pochodzenie determinantów oporności oraz dużą różnorodnośd mechanizmów warunkujących
opornośd. W dwóch kolejnych częściach scharakteryzowano antybiotyki β-laktamowe oraz
mechanizmy oporności na te związki. W czwartej części opisano rolę oczyszczalni ścieków w
rozprzestrzenianiu antybiotykooporności, a w ostatniej - metody stosowane w badaniach
antybiotykooporności, z podziałem na metody hodowlane i niehodowlane.
Mam kilka drobnych uwag do tej części pracy. Po pierwsze, nie zgodzę się ze
sformułowaniem, że "...nastanie tzw. ery antybiotyków doprowadziło do przyspieszenia procesu
przenoszenia ARGs z genomów bakterii środowiskowych do szczepów chorobotwórczych oraz
nabywania oporności przez patogeny na drodze mutacji" (str. 5). Obecnośd antybiotyku nie
wpływa bowiem na przyspieszenie tempa pojawiania się mutacji determinujących opornośd, lecz
stanowi czynnik selekcjonujący te zdarzenia i prowadzący do naturalnej amplifikacji szczepów
opornych. Po drugie, na str. 16 Doktorantka zalicza integrony do grupy ruchomych elementów
genetycznych, chociaż same integrony nie są mobilne, w przeciwieostwie do występujących w
nich kaset genowych. Z obowiązku recenzenta wspomnę również o nielicznych błędach
interpunkcyjnych i językowych, które jednak nie wpływają na pozytywny odbiór tej części pracy.
Uważam, że rozdział Przegląd literatury jest w całości spójny, został napisany przejrzyście i
zawiera informacje niezbędne do interpretacji wyników przedstawionych w dalszych rozdziałach
pracy.
Materiały i Metody przedstawiono w rozprawie w jednym rozdziale. W badaniach zastosowano
różnorodne metody (genetyczne, mikrobiologiczne, bioinformatyczne), a ich opisy
przedstawiono na tyle precyzyjnie, aby możliwe było powtórzenie przeprowadzonych
eksperymentów w innych warunkach laboratoryjnych. W podrozdziale, w którym powinny byd
zgrupowane Materiały wykorzystane w badaniach, czytelnik znajduje jedynie opis Jeziora
Żywieckiego oraz informacje metodyczne, dotyczące sposobu poboru prób. Uważam, że treści te
powinny zostad umieszczone w innych częściach rozprawy. W omawianym podrozdziale brakuje
natomiast informacji przedstawianych standardowo w innych rozprawach, m.in. na temat źródeł
i charakterystyki wykorzystanych w badaniach szczepów bakteryjnych, plazmidów i starterów, a
także stosowanych podłoży i ich suplementów. Co prawda, większośd tych danych można
odnaleźd w opisach części metodycznej, są one jednak rozproszone, a czytelnik nie jest na nie
bezpośrednio nakierowany.
3
Rozdział Wyniki stanowi zasadniczą częśd rozprawy. W badaniach wykorzystano próby
pochodzące ze ścieków surowych, osadu czynnego i ścieków oczyszczonych z oczyszczalni
ścieków w Żywcu oraz wód i osadów z jeziora Żywieckiego. Chociaż analiza wymienionych prób
byłaby wystarczająca do realizacji postawionego celu badawczego, Doktorantka włączyła także
do badao, jako kontrolę, próby pochodzące z rzeki Soły. W pierwszym etapie prac określiła
ogólną liczbę bakterii hodowalnych występujących w analizowanych próbach, a także bakterii
opornych na amplicylinę. Badania te uzupełniła, oznaczając liczbę kopii genu 16S rRNA w
metagenomowym DNA, izolowanym z poszczególnych prób. Te wstępne badania przyniosły
obserwacje, świadczące o tym, że podczas procesu oczyszczania ścieków dochodzi do istotnego
statystycznie spadku liczebności bakterii heterotroficznych, a także bakterii opornych na
ampicylinę. Zgromadzone dane sugerują również, że bakterie niosące geny warunkujące
antybiotykoopornośd są kumulowane w populacjach mikroorganizmów zasiedlających osady
denne Jeziora Żywieckiego i Soły. Należy zaznaczyd, że Doktorantka pobierała próby w dwóch
kolejnych latach (2014 i 2015), co pozwoliło na zestawienie uzyskanych danych i wyciągnięcie
wniosków na temat fluktuacji liczby analizowanej części mikrobiomu i rezystomu w badanych
środowiskach. Efektem tych prac było również zgromadzenie bogatej kolekcji
ampicylinoopornych szczepów bakterii, która może stanowid punkt wyjścia do bardziej
szczegółowych analiz genetycznych.
W kolejnym etapie, Doktorantka przeprowadziła analizę danych, uzyskanych w wyniku
wysokoprzepustowego sekwencjonowania metagonomowego DNA, wyizolowanego z prób wód
Jeziora Żywieckiego, Soły oraz ścieków opuszczających oczyszczalnię (były to pojedyncze próby,
nie podano jednak, w którym roku zostały one pobrane; uwaga ta dotyczy także dalszych części
rozdziału Wyniki). Analizy te pozwoliły na zbadanie stopnia zróżnicowania taksonomicznego
zespołów bakterii bytujących w poszczególnych środowiskach oraz określenie in silico
potencjalnego rezystomu tych bakterii. Zgodnie z oczekiwaniami, największy udział
różnorodnych genów warunkujących antybiotykoopornośd, a także integraz integronów klasy 1,
z którymi często sprzężony jest fenotyp wielooporności, stwierdzono w ściekach oczyszczonych,
wprowadzanych bezpośrednio do Jeziora Żywieckiego. Zestawienie wyników z trzech
analizowanych metagenomów sugeruje jednak, że uwalniane ścieki nie wpływają znacząco na
rozprzestrzenienie antybiotykooporności wśród zespołów bakterii zasiedlających wody jeziora.
Aby uzyskad pełniejszy obraz, korzystne byłoby włączenie do analiz metagenomicznych prób
osadów dennych tego zbiornika.
Zastosowanie podejścia metagenomicznego przyniosło bardzo dużą ilośd danych, które
przedstawiono w rozprawie w sposób syntetyczny i przemyślany. Należy podkreślid, że analiza
sekwencji metagenomów nie jest łatwa, jednak Doktorantka doskonale poradziła sobie z tym
wyzwaniem, co świadczy o dobrze opanowanym prze nią warsztacie bioinformatycznym.
Ostatnia częśd pracy koncentruje się na identyfikacji i analizie plazmidów niosących geny
oporności na antybiotyki -laktamowe. Aby osiągnąd ten cel, zastosowano egzogenną izolację
plazmidów, która przebiega z pominięciem etapu charakteryzowania pierwotnego gospodarza
tych replkonów. Uważam, że wybór tej strategii, mimo pewnych jej ograniczeo, był trafnym
rozwiązaniem. Po pierwsze, egzogenna izolacja eliminuje problematyczny etap rozróżniania
4
właściwej oporności (wynikającej np. z wytwarzania enzymów inaktywujących antybiotyk) od
naturalnej niewrażliwości spowodowanej, na przykład, strukturą osłon komórkowych. Po
drugie, stosując tę strategię możliwa jest także identyfikacja plazmidów występujących w
bakteriach niehodowalnych oraz niosących geny oporności nieulegające ekspresji w pierwotnych
gospodarzach.
Uzyskaną pulę plazmidów Doktorantka wstępnie pogrupowała na podstawie
zróżnicowania ich profili restrykcyjnych oraz typowania grup niezgodności metodą multiplex
PCR. Kolejne etapy charakterystyki obejmowały określenie profilu oporności poszczególnych
plazmidów oraz ich zdolności do transferu koniugacyjnego i mobilizacji. Analizę
mobilizowalności plazmidów przeprowadzono z wykorzystaniem pomocniczego systemu
transferu plazmidu RK2. Przy opisie tego podejścia podano informację, że system ten umożliwia
mobilizację plazmidów zawierających origin transferu koniugacyjnego. Należy dodad, że w
typowych plazmidowych modułach MOB wymagana jest również obecnośd genu relaksazy,
białka oddziałującego specyficznie z oriT. Jest to istotne, bowiem warunkiem mobilizacji są
interakcje relaksazy z białkiem łącznikowym pomocniczego systemu transferu.
Doktorantka podjęła także próbę określenia zakresu gospodarzy plazmidów
koniugacyjnych oraz identyfikacji in vivo transpozonów opornościowych, potencjalnie
sprzężonych z genomami analizowanych plazmidów.
Uzyskane wyniki wykazy, że większośd analizowanych plazmidów to replikony
koniugacyjne lub mobilizowalne, co podkreśla ich potencjał w rozprzestrzenianiu fenotypów
oporności. Zaobserwowano także duże zróżnicowanie ich systemów replikacyjnych, których, w
większości, nie udało się przypisad do żadnej z 18 testowanych grup niezgodności. Poznanie
sekwencji nukleotydowych tych replikonów niewątpliwie byłoby interesującym dopełnieniem
tej części rozprawy. Cieszy jednak fakt, że zadanie to zostało ujęte, w przedstawionych w
rozprawie, dalszych planach badawczych Doktorantki.
Wyniki uzyskane w trakcie badao zostały rzeczowo omówione w rozdziale Dyskusja. Lektura
tego rozdziału przekonuje mnie, że Doktorantka jest w pełni dojrzałym badaczem, zdolnym nie
tylko do przeprowadzenia ciągu analiz eksperymentalnych i bioinformatycznych, lecz również do
właściwej interpretacji uzyskanych wyników, a także przedstawienia ich na tle aktualnej wiedzy
z omawianej dziedziny (w pracy zacytowano łącznie 97 pozycji literaturowych oraz 8 źródeł
internetowych).
W podsumowaniu stwierdzam, że przedstawiona do oceny rozprawa stanowi oryginalne
rozwiązanie problemu naukowego, wykazuje ogólną wiedzę Doktorantki oraz umiejętnośd
samodzielnego prowadzenia przez nią badao naukowych. Dzięki logicznie zaprojektowanym
eksperymentom i wnikliwej analizie uzyskanych danych, Doktorantka poczyniła wiele
wartościowych obserwacji, istotnych zarówno z poznawczego, jak i praktycznego punktu
widzenia. Uzyskane wyniki przyniosły informacje na temat struktury mikrobiomu oraz skali
problemu antybiotykooporności w analizowanych środowiskach. Dowiodły także, że geny
oporności mogą stanowid marker, pomocny w ocenie stanu czystości środowisk wodnych oraz w
5
oszacowaniu wpływu presji antropogenicznej. Uważam, że badania tego typu powinny byd
prowadzane cyklicznie w ramach monitoringu naturalnych środowisk wodnych, zwłaszcza tych
do których odprowadzone są ścieki, będące rezerwuarem bakterii opornych i potencjalnie
patogennych. Na koniec chciałbym podkreślid, że wyniki przedstawione w rozprawie są efektem
realizacji grantu NCN, kierowanego przez Doktorantkę, co podkreśla również autorski charakter
prowadzonych prac.
Uważam, że oceniana praca w pełni spełnia warunki stawiane rozprawom doktorskim. Wnoszę
więc do Rady Naukowej Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w
Katowicach o dopuszczenie Pani mgr Kingi Bandarczuk do dalszych etapów przewodu
doktorskiego.
prof. dr hab. Dariusz Bartosik
6
Download