Telomery i aktywność telomerazy w komórkach prawidłowych oraz
advertisement
PRACE POGLĄDOWE Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 87–95 ISSN 1230−025X BERNARDA KAZANOWSKA, AGATA MIKOŁAJEWSKA, ADAM REICH, MAGDALENA REICH, ALICJA CHYBICKA Telomery i aktywność telomerazy w komórkach prawidłowych oraz w komórkach nowotworowych Telomeres and telomerase activity in normal and neoplastic cells Katedra i Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej AM we Wrocławiu Streszczenie Telomeraza jest enzymem rybonukleoproteinowym odpowiedzialnym za utrzymywanie stałej długości telomerów – struktur niezbędnych do prawidłowej funkcji i stabilności materiału genetycznego komórek eukariotycznych. Jej obecność zapewnia komórkom możliwość odnowy, a co się z tym wiąże, nieograniczonego podziału. W warun− kach fizjologicznych aktywność telomerazy wykazują m.in. komórki rozrodcze, komórki linii zarodkowej i nie− które hematopoetyczne komórki macierzyste; dojrzałe komórki somatyczne w większości tracą tą właściwość. Za− chowana ekspresja telomerazy może prowadzić do niekontrolowanych podziałów komórek i jest jedną z charakte− rystycznych cech transformacji nowotworowej. Celem pracy jest przedstawienie współczesnej wiedzy na temat te− lomerów i telomerazy, fizjologicznego znaczenia aktywności tego enzymu i jego roli w procesie nowotworzenia, a także dostępnych metod laboratoryjnych, służących jego oznaczaniu. Szczególną uwagę poświęcono aktywności telomerazy w prawidłowych komórkach oraz w komórkach nowotworowych (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 87–95). Słowa kluczowe: telomery, telomeraza, aktywność telomerazy, nowotwory. Abstract Telomerase is a ribonucleoprotein enzyme, which is responsible for the protection of telomeres, which are indi− spensable structures in normal function of genome and play key role in stabilization of chromosomes. Its presen− ce assures the possibility of regeneration and unlimited cell division. Telomerase activity is present physiological− ly in germline cells, human embryonic tissues and some hematopoetic stem cells. In majority of the adult somatic cells telomerase activity is represed. The further expression of telomerase may cause uncontrolled cell prolifera− tion and is a characteristic marker of the neoplastic transformation and tumour progression. The aim of this publi− cation is presentation of the current knowledge on telomeres and telomerase, the physiological function of this en− zyme and its significant role in tumorigenesis of different neoplasms, as well as the laboratory methods of telome− rase activity detection. The interest is concentrated especially on the presence of activated telomerase in the nor− mal cells and in the neoplastic cells (Adv. Clin. Exp. Med. 2003, 12, 1, 87–95). Key words: telomeres, telomerase, telomerase activity, neoplasms. Telomery są wyspecjalizowanymi, końcowymi odcinkami chromosomów, zbudowanymi z krót− kich powtórzeń DNA oraz białek. Ich dokładną strukturę określono dopiero w latach siedemdziesią− tych XX w., kiedy to powtarzalne sekwencje TTGGGG odkryto u jednokomórkowego rzęsistka Tetrahymena. Od tego czasu udowodniono obec− ność bogatych w tyminę i guaninę sekwencji nukleo− tydowych kończących chromosomy organizmów będących na różnym stopniu rozwoju ewolucyjne− go: począwszy od obleńców, zawierających se− kwencję TTAGGC, a skończywszy na komórkach mysich i ludzkich o charakterystycznym układzie TTAGGG. Zbadano nie tylko komórki należące do filogenetycznie odrębnych linii, lecz także komórki tego samego organizmu, będące na różnym etapie rozwoju (np. komórki zarodkowe i dojrzałe) lub po− chodzące z różnych tkanek (np. komórki krwi, na− 88 B. KAZANOWSKA et al. błonka itp.). Wykazano, że liczba powtórzeń se− kwencji w telomerach u różnych organizmów, a na− wet w różnych komórkach tego samego organizmu jest odmienna oraz może zmieniać się w czasie, za− chowując pewną charakterystyczną dla danego ga− tunku średnią (u człowieka każdy telomer zawiera średnio 2000 powtórzeń) [1, 2]. Rola telomerów i telomerazy Telomery są niezbędne do prawidłowej funkcji i stabilności materiału genetycznego komórek euka− riotycznych. Zapobiegają one sklejaniu się chromo− somów, chronią je przed nieprawidłową rekombina− cją i degradacją. Umożliwiają także kompletne po− wielanie materiału genetycznego. Odpowiedzialna za proces replikacji polimeraza DNA/DNA nie jest w stanie w pełni skopiować końców liniowego DNA. Wynika to z niemożności wypełnienia luki powstałej po usunięciu starterów na końcu 5’ nici potomnej, zsyntezowanej w sposób nieciągły. Każ− dy podział materiału genetycznego przebiega z nie− odwracalnym skróceniem chromosomu i utratą fragmentu powtarzalnych sekwencji telomerowych. Stanowi to tzw. „zegar biologiczny”, wyznaczający ściśle określoną liczbę podziałów komórkowych, zanim zostanie osiągnięte krytyczne skrócenie telo− merów (około 3 kbp), przy którym nie mogą już one chronić chromosomów, a niestabilność genomu powoduje śmierć komórki. Jest to jeden z mechani− zmów inicjujących apoptozę, będącą naturalną kon− sekwencją „starzenia się” komórek [3]. Właściwo− ści tej, charakterystycznej dla większości komórek eukariotycznych, nie wykazują komórki tkanek, do których funkcjonowania niezbędna jest możliwość odnowy, a co się z tym wiąże, nieograniczonego podziału. Osiągają to dzięki obecności telomerazy – enzymu odpowiedzialnego za utrzymywanie stałej długości telomerów, a w pewnych warunkach także ich wydłużanie. Cechę tę posiadać muszą wszystkie eukariotyczne organizmy jednokomórkowe, aby móc dzielić się bez utraty materiału genetycznego w komórkach potomnych. Jej aktywność wykazują komórki płciowe oraz komórki zarodka, komórki macierzyste szpiku, krypt jelitowych, torebki wło− sa, a być może także komórki wątroby. Jest to rów− nież jedna z charakterystycznych cech komórek no− wotworowych [4]. Budowa telomerazy i mechanizm jej działania Telomeraza jest enzymem rybonukleoprotei− nowym: polimerazą DNA zależną od RNA. Poza składnikiem białkowym, koniecznym do jej dzia− łania, zawiera także własną matrycę do syntezy te− lomerowego DNA w postaci komplementarnej se− kwencji RNA. Dołączając się do DNA przed roz− poczęciem replikacji, dodaje pewną liczbę po− wtórzeń telomerowych do jednego końca każdej nici rodzicielskiej. Powstałe w ten sposób sekwen− cje są komplementarne względem starterów, nie− zbędnych do replikacji, przebiegającej w sposób nieciągły na jednej z nici. Przy braku telomerazy, po usunięciu starterów po dokonanej replikacji, wobec niemożności uzupełnienia luki na końcu chromosomu, dochodzi każdorazowo do utraty fragmentu telomeru. Zaoszczędzona jednak zosta− je sekwencja istotnych dla funkcjonowania ko− mórki genów, zlokalizowanych na końcu chromo− somu. W ten sposób zsyntezowane nici potomne są krótsze niż oryginalne, ale zawierają kompletny materiał genetyczny. Obserwacje te wskazują, że uniknięcie skracania końcowych odcinków DNA podczas podziału i tym samym zdolność do nieo− graniczonej liczby podziałów wymaga obecności telomerazy w komórce [2]. Badania nad strukturą telomerazy przeprowa− dzono wykorzystując komórki o różnym stopniu rozwoju filogenetycznego: począwszy od wspo− mnianych już komórek Tetrahymena, a skończyw− szy na sklonowanych komórkach ssaków: ludz− kich oraz mysich. Ludzkie RNA wyizolowano za pomocą tech− nik, umożliwiających wyodrębnienie odcinków RNA, zawierających krótki region o sekwencji komplementarnej do telomerów. Geny kodujące ludzkie RNA użyto do utworzenia hybryd mysie− go RNA [5]. Obie telomerazowe cząsteczki RNA mają dłu− gość około 500 nukleotydów. W niektórych tkan− kach poziom mysiego telomerazowego RNA obni− ża się podczas rozwoju osobniczego. Komórki ludzkich tkanek oraz pierwotnie nieśmiertelne linie komórkowe również wykazują zróżnicowanie w poziomach RNA, choć nie tak duże, jak można byłoby się spodziewać, opierając się na względ− nych różnicach w aktywności telomerazy i obecno− ści lub braku telomerów. Wyniki ostatnich badań sugerują, że telomerazowe RNA odgrywa rolę w katalizie reakcji syntezy telomerów dzięki swo− jej matrycowej funkcji [5, 6]. Telomerazowe RNA jest zlokalizowane na końcu replikującej nici (co ma związek z jego funkcją w syntezie telomerów) oraz w swoistym miejscu jego magazynowania. Nagromadzenie albo lokalizacja RNA mogłoby re− gulować aktywność telomerazową, pozwalając na działanie enzymu tylko w obecności odpowiednich substratów. Za enzymatyczną aktywność telome− razy jest odpowiedzialny odkryty niedawno enzym – odwrotna transkryptaza ludzkiej telomerazy 89 Telomery i aktywność telomerazy (hTERT – human telomerase reverse transcriptase) [7, 8]. Przeanalizowano również mechanizmy re− gulujące aktywność hTERT, a ich poznanie uczyni− ło z hTERT drugi obok telomerazy marker prolife− racji i „nieśmiertelności” komórek [7]. Badania biochemiczne pozwoliły również na identyfikację składnika białkowego telomerazy. Dwa polipeptydy: 80 kDa i 95 kDa oddzielono łącznie po oczyszczeniu badanego materiału i wy− kazano ich związek z telomerazowym RNA, z którym współtworzą wyżej wymieniony trój− składnikowy kompleks hTERT [5, 6]. Białko p80 wchodzi w interakcje z telomera− zowym RNA, podczas gdy białko p95 wykazuje powinowactwo wobec primerów telomerowych. Hipotetyczny model struktury telomerazy przypo− mina odwrotną transkryptazę wirusa HIV−1. Więk− sza podjednostka enzymu zawiera miejsce aktyw− ne, mniejsza formuje część centrum wiążącego matrycę, umożliwiając wiązanie tRNA w centrum aktywnym. Primer jest związany końcem 3’ z RNA oraz z centrum niezależnym od RNA na podjednostce p95. Podjednostka p80 wiąże telo− merazowe RNA i prezentuje je w sposób pozwala− jący na utrzymanie matrycy w centrum aktywnym. Aktywność telomerazy w komórkach nienowotworowych w okresie rozwojowym Aktywność telomerazową wykryto w komór− kach jąder i jajników płodów, noworodków i doro− słych. Nie wykazują jej dojrzałe plemniki oraz nie− zapłodnione komórki jajowe. Blastocyty wykazu− ją wysoki poziom aktywności telomerazy, podob− nie jak większość tkanek płodowych w 16–20 ty− godniu rozwoju, z wyjątkiem komórek mózgo− wych. Wysoki poziom aktywności enzymu wykry− to także w komórkach krwi obwodowej noworod− ków i w tkance napletka. Nie znaleziono jej jednak w żadnej somatycznej tkance uzyskanej od 2−mie− sięcznego dziecka, poza wyżej wspomnianymi li− niami komórek rozrodczych i macierzystych. Ani łożysko, ani wyhodowane amniocyty nie zawiera− ły wykrywalnej aktywności telomerazy [9]. Aktywność telomerazy w różnych fazach cyklu komórkowego Aktywność telomerazy wykryto w proliferują− cych komórkach w fazie G1, S, G2 oraz M cyklu komórkowego, jest ona jednak tłumiona, gdy ko− mórki są w fazie G0, w wyniku pozbawienia ich czynników wzrostu, zahamowania kontaktowego, indukcji procesu starzenia się oraz różnicowania [13]. Poza komórkami zróżnicowanymi, zahamo− wanie ekspresji w fazie G0 jest w pełni odwracal− ne. Jeśli większość komórek w mieszanej popula− cji jest w fazie G0, wykrywana aktywność telome− razy pozostaje na bardzo niskim poziomie. Od− wrotnie jest wówczas, gdy przeważają komórki dzielące się. Ponieważ aktywność telomerazy nie zmienia się podczas faz G1, S, G2 + M, jej poziom w populacji komórek nie odzwierciedla wskaźnika podziałów, lecz raczej frakcję komórek uczestni− czących w cyklu [9–11]. Rola telomerazy w procesie starzenia się komórek Istnieją dowody potwierdzające teorię, że sta− rzenie się zależy od liczby podziałów komórek, a nie czasu chronologicznego [12]. Utrata telome− rów, po przekroczeniu wartości krytycznej, indu− kuje ostatecznie sygnały antyproliferacyjne, których skutkiem jest starzenie się [13]. Telomery są więc zegarem replikacyjnego wyczerpania się, ich funkcja może być jednak odtwarzana. Wsta− wienie genów białek wchodzących w skład telo− merazy do starzejących się komórek ludzkich po− woduje wydłużenie ich telomerów do długości ty− powej dla młodych komórek. Komórki wykazują wtedy wszystkie cechy charakterystyczne dla mło− dych komórek jądrzastych. Sugeruje to, że telome− raza jest nie tylko centralnym mechanizmem regu− lującym czas życia komórek, ale także, że mecha− nizm ten może być ponownie włączony, przedłu− żając replikacyjny okres życia komórek, wykazu− jących markery ekspresji genów charakterystycz− nych dla młodej komórki. Nie wiadomo, jaki wpływ na „telomerazowy zegar” mają inne wy− znaczniki starzenia się komórek (oksydatywne uszkodzenie DNA, ekspozycja na UV, onkogeny ras), niezależne od skracania się telomerów. W komórkach, które nie wykazują replikacyj− nego starzenia się (komórki nowotworowe, ko− mórki linii zarodkowej, komórki macierzyste szpi− ku i krypt jelitowych), telomeraza utrzymuje stałą długość telomerów, przez co zapobiega ich starze− niu się [14]. Średnio roczna utrata wynosi około 56 bp końcowego DNA, przy czym dynamika te− go procesu jest różna w zależności od wieku [15]. Do 40. roku życia wynosi średnio 84 bp w ciągu roku, a powyżej 40 roku życia – 41 bp [16]. Jeże− li przyjąć, że człowiek ma telomery długości śre− 90 B. KAZANOWSKA et al. dnio 11 kbp, to można obliczyć, że czas potrzebny na skrócenie telomerów do 3 kbp (limit Hayflic− ke’a), wynosi około 125 lat. Leczenie wysokimi dawkami chemioterapeutyków lub długotrwałe ich stosowanie powodują skrócenie telomerów o 1–2 kbp i skracają ten okres o 18–36 lat [15, 17]. Laboratoryjne metody określania aktywności telomerazy Najczęściej obecnie stosowaną metodą wy− krywania aktywności telomerazy jest wysoce czu− ła i swoista reakcja TRAP (telomeric repeat ampli− fication protocol) [7, 9, 18]. Pozwala na wykrycie aktywności telomerazy w bardzo małej ilości ma− teriału tkankowego, dzięki czemu znalazła szero− kie zastosowanie zarówno w laboratoriach nauko− wych, jak też diagnostycznych. Po wstępnym roz− puszczeniu komórek detergentami, inkubuje się badany materiał z dodatkiem swoistych primerów, które w dalszym etapie są powielane za pomocą reakcji PCR. Istnieje wiele modyfikacji reakcji TRAP, różniących się przede wszystkim czasem inkubacji, liczbą cykli PCR oraz sposobem obra− zowania otrzymanych produktów. Ponieważ aktywność telomerazy zależy od wielu czynników zarówno fizycznych, jak i bioche− micznych (np. temperatury otoczenia, obecności RNAz, proteaz), w pewnych warunkach reakcja TRAP wymaga uzupełnienia o metody pozwalające na wykrycie telomerazowego RNA (hTR – human telomerase RNA), którego poziom odpowiada stop− niowi ekspresji telomerazy. Do tego celu najczę− ściej wykorzystuje się metodę RT−PCR, w której po izolacji RNA z analizowanego materiału biologicz− nego, syntetyzuje się cDNA. Uzyskane w ten spo− sób cDNA jest powielane w reakcji PCR. Dzięki za− stosowaniu swoistych primerów, zwielokrotnione zostaje tylko cDNA odpowiadające hTR. Wykry− wanie hTR może być także zastosowane w wykry− waniu komórek nowotworowych wykazujących ekspresję telomerazy w materiale biopsyjnym, dzię− ki zastosowaniu hybrydyzacji in situ. Należy jednak zauważyć, że hTR bywa stwierdzane w prawidło− wych tkankach, w których test na aktywność telo− merazową wypadł ujemnie. Różnica w poziomie wykrywanego hTR jest jednak wystarczająca do identyfikacji nowotworów telomerazododatnich. Aktywność telomerazy a proces nowotworzenia Koncepcja udziału telomerazy i telomerów w procesie nowotworzenia przyczyniła się do po− szerzenia wiedzy na temat karcynogenezy. Hipoteza ta przyjmuje, że większość ludzkich komórek soma− tycznych nie wykazuje aktywności telomerazy, a większość komórek nowotworowych, mimo skróce− nia telomerów, aktywność tę prezentuje. Potwier− dzają to dotychczasowe doniesienia, według których aktywność telomerazy obecna jest w komórkach około 85% przebadanych nowotworów [19, 21]. Telomery komórek nowotworowych są krót− kie, gdyż synteza telomerazy zachodzi w nich do− piero po rozpoczęciu niekontrolowanych podzia− łów, prawdopodobnie już po utracie znacznej ilo− ści podjednostek. Zaktywowany enzym stabilizuje bardzo skrócone telomery, pozwalając unieśmier− telnić się dzielącym się komórkom [25]. Wiadomo, że progresja procesu nowotworowe− go wymaga kumulacji serii zmian genetycznych, za− pewniających im nieograniczoną proliferację. Pierw− szą barierą, którą muszą pokonać komórki, aby wyjść z ram fizjologicznego cyklu komórkowego, są geny kodujące białka supresorowe p53 i Rb. Ich mu− tacja i związana z nią zmiana ekspresji wydłuża cykl, nie wystarcza jednak do ominięcia apoptozy [23]. Zaburzona regulacja lub reekspresja telomerazy jest istotnym czynnikiem, odpowiedzialnym za utrzymu− jący się wzrost guza [24]. Wydaje się możliwe, iż „unieśmiertelnienie” komórek odbywa się w wyniku mutacji w genach uczestniczących w tłumieniu ak− tywności telomerazy, co wyzwala ekspresję tego en− zymu w komórkach nowotworowych. Prawidłowe komórki, które in vitro pobudzo− no do proliferacji, wykazują jednak również ak− tywność telomerazy. Może to świadczyć, że en− zym ten nie jest markerem złośliwości, lecz wska− źnikiem proliferacji komórek. Fakt ten potwier− dzałby także spadek aktywności telomerazy przy zahamowaniu proliferacji komórek nowotworo− wych. Brakuje natomiast jeszcze dowodów na to, że ekspresja telomerazy jest związana z transfor− macją nowotworową. Zależnie od rodzaju nowotworu i stopnia jego zaawansowania zmienia się wykrywalna aktyw− ność telomerazy. Wczesne wykrycie możliwe jest w przypadku nowotworów sutka, głowy i szyi, płuc (także w stanach przednowotworowych u pa− laczy), w rakach skóry oraz w skórze uszkodzonej przez promieniowanie UV, w pierwotnych nowo− tworach wątroby oraz w stanach przednowotworo− wych, takich jak marskość czy zapalenie wątroby. Późną ekspresję enzymu stwierdza się w patoge− nezie raka okrężnicy, trzustki i tarczycy [4, 9]. Shay i Wright przebadali wiele tkanek nowo− tworowych złośliwych i łagodnych, tkanek z bez− pośredniego sąsiedztwa rozrostu nowotworowego oraz tkanek prawidłowych [9]. Wykazano wyra− źne różnice w liczbie komórek o podwyższonej aktywności telomerazy między tkankami nowo− 91 Telomery i aktywność telomerazy tworów złośliwych a tkankami przylegającymi do guza oraz pochodzącymi z rozrostów niezłośli− wych i stanów przednowotworowych (tab. 1). Zaobserwowano, że wysoki poziom aktywno− ści telomerazy jest związany ze złym rokowaniem w przypadku takich nowotworów, jak np.: nerwiak zarodkowy, ostra białaczka szpikowa, rak sutka i przewodu pokarmowego. Nie jest to jednak regu− łą, gdyż ten sam poziom aktywności może być związany zarówno z korzystnym, jak i niekorzyst− nym rokowaniem, zależnie od rodzaju nowotworu. Wydaje się więc konieczne utworzenie „profilu aktywności telomerazowej” dla poszczególnych typów nowotworów [4]. Powyższe spostrzeżenia sugerują możliwość zastosowania oznaczenia aktywności telomerazy jako biomarkera przebiegu procesu nowotworo− wego. Wykazano, że znane dotychczas markery nie pozwalają np. na rozróżnienie łagodnego roz− rostu od raka gruczołu krokowego, co doskonale daje się uzyskać na podstawie badania telomerazy [24] Wydaje się, że jej oznaczanie może mieć war− tość jako marker proliferacji, podobnie jak ozna− czanie Ki−67 czy MIB1 [14]. Wykrycie aktywności telomerazowej może być także markerem niewielkich zmian rezydualnych u pacjentów poddanych chemioterapii, przez co mo− że stanowić wyznacznik skuteczności leczenia. Zaobserwowano, że obecność aktywnej telo− merazy wydaje się niezbędna do proliferacji więk− szości komórek nowotworowych. Preparaty za− wierające inhibitory telomerazy mogą być poten− Tabela 1. Aktywność telomerazy w tkankach nowotworowych i prawidłowych Table 1. Telomerase activity in malignant and normal tissues Tkanka nowotworowa liczba prób dodatnich/ /liczba prób zbadanych (Malignant No. positive/No. tested) Tkanka przylegająca do guza liczba prób dodatnich/ /liczba prób zbadanych (Adjacent to tumour No. positive/No. tested) Zmiany łagodne i stany przednowotworowe liczba prób dodatnich/liczba prób zbadanych (Benign and premalignant No. positive/No. tested) Nerwiak zarodkowy (Neuroblastoma) 99/105 Rak okrężnicy (Colon cancer) 53/56 nerwiak zarodkowy (neuroblastoma) 0/13 Rak gruczołu krokowego (Prostate cancer) 27/31 Rak sutka (Breast cancer) 117/125 Nowotwory tkanki mózgowej (Brain tumours) 43/59 Gwiaździak zarodkowy (Anaplastic astrocytoma) 1/16 Rak wątroby (HCC) 28/33 rak gruczołu krokowego (prostate cancer) 3/25 rak sutka (breast cancer) 3/42 nerwiak zwojowy (ganglioneuroma) 0/4 polipy okrężnicy (colon polyps) 0/20 gruczolaki okrężnicy (colon adenoma) 0/1 gruczolak gruczołu krokowego (prostate adenoma) 3/5 włókniakogruczolak sutka (breast fibroadenoma) 2/3 oponiak łagodny (benign meningioma) 4/27 Rak płuca (Lung cancer) 120/147 Rak żołądka (Gastric cancer) 72/85 Rak nerki (Renal cancer) 40/55 rak płuca (lung cancer) 3/68 zapalenie wątroby (hepatitis) 19/38| marskość wątroby (cirrhosis) 6/8 gruczolak żołądka (gastric adenoma) 1/2 rak nerki (renal cancer) 0/55 Według Shay i Wright (According to Shay and Wright) [9]. 92 B. KAZANOWSKA et al. cjalnym źródłem efektywnej terapii z możliwie niewielkimi efektami ubocznymi [21, 25–31]. In− hibitory telomerazy mogłyby być użyte razem z metodami konwencjonalnymi do zapobieżenia ponownemu rozplemowi pozostałych po leczeniu komórek nowotworowych. Uzasadnione wydaje się także ich wykorzystanie w leczeniu początko− wych stadiów nowotworu, w celu zmniejszenia ry− zyka powstawania przerzutów [21, 31]. Prawidłowe komórki krwi W przeciwieństwie do innych komórek soma− tycznych, jądrzaste komórki krwi (leukocyty) oraz komórki szpiku wykazują niewielką aktywność te− lomerazy. Aktywność ta jest najwyższa u osób młodych i maleje z wiekiem, aż do niewykrywal− nego często poziomu u osób w podeszłym wieku [16]. Spadek aktywności jest związany ze stałym skracaniem się telomerów. Próbując uszeregować tkanki pod względem ak− tywności telomerazy ustalono, że jest najwyższa w aktywowanych migdałkach, nieco niższa w akty− wowanych węzłach chłonnych i szpiku, a najniższa w leukocytach krwi obwodowej [32]. Niska aktyw− ność telomerazy w komórkach krwi obwodowej może być interpretowana dwojako: ekspresja jest ograniczona do niewielkiej subpopulacji komórek lub niski poziom aktywności jest niewystarczający do utrzymania normalnej długości telomerów. Po− twierdzają to obserwacje wykazujące, że telomery są krótsze w dojrzałych limfocytach w porównaniu do ich długości w limfocytach młodych [16, 33]. Słaba aktywność telomerazy może odgrywać rolę w zdolnościach regeneracyjnych komórek. Prawdo− podobnie zaktywowane limfocyty z węzłów chłon− nych i migdałków wędrują do krwi obwodowej i tworzą tam subpopulację limfocytów z wyższą ak− tywnością telomerazy. Stosunkowo wysoka aktyw− ność telomerazy w węzłach chłonnych jest związa− na z obecnością frakcji młodych limfocytów B [33]. W aktywowanych migdałkach najwyższa aktyw− ność telomerazy dotyczy centrów rozrodczych (GCB – germinal centers). Wysoką aktywność wy− kazują komórki CD19+, a niską CD19−, ale nie wia− domo jeszcze, czy telomerazododatnie komórki B są nieśmiertelne [16, 33]. Nowotwory hematologiczne i guzy lite u dzieci Ostre białaczki W chwili rozpoznania u wszystkich pacjentów jest wykrywana wysoka aktywność telomerazy, zarówno we krwi, jak i w szpiku [15, 34–36]. Ak− tywność telomerazy w szpiku jest wyższa niż we krwi obwodowej. Łączy się to prawdopodobnie z wyższym odsetkiem komórek blastycznych w szpiku. Również średnia długość telomerów jest krótsza w komórkach pobranych ze szpiku w po− równaniu z komórkami krwi. Analiza długości te− lomerów jądrzastych komórek krwi wykazała obe− cność dwóch szczytów długości: niższy szczyt od− powiadał komórkom białaczkowym z krótkimi te− lomerami, wyższy szczyt komórkom zdrowym. Skracanie telomerów może być związane z proce− sem nowotworowym. Utrata telomerów prowadzi do postępującej niestabilności chromosomów (do ich utraty włącznie), co może powodować aberra− cje chromosomalne (delecje, dyslokacje) obserwo− wane w komórkach nowotworowych. Proces skra− cania chromosomów tłumaczy również fenomen fuzji obserwowany w białaczkach. Skracanie telo− merów może odgrywać także istotną rolę w pato− genezie ostrych białaczek przez aktywowanie onkogenów zlokalizowanych w pobliżu. Aktywność telomerazy we krwi obwodowej osób chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną (ALL) jest związana ze złym rokowaniem. Nie wykazano różnic w aktywności telomerazy mię− dzy komórkami białaczki pre–B, T i mieszanej po− staci ALL [15]. W ostrej białaczce mieloblastycznej (AML) wzrost aktywności telomerazy towarzyszy obe− cności zaburzeń cytogenetycznych w komórkach białaczkowych [35]. Zaobserwowano również za− leżność między aktywnością telomerazy a ekspre− sją antygenu CD34: komórki białaczkowe CD34– > komórki białaczkowe CD34+ > prawidłowe limfocyty CD34– > > prawidłowe limfocyty CD34+. Ocena aktywności telomerazy wykazuje znaczne różnice u pacjentów chorych na ostrą bia− łaczkę, w zależności od jej fenotypów [35, 37]: M1 > M2 > M5 > M4 (podział według FAB). Po zastosowaniu leczenia przeciwnowotworo− wego następuje spadek aktywności telomerazy. U pacjentów w remisji całkowitej (CR) jej aktyw− ność jest niska lub nawet niewykrywalna. Po wprowadzeniu leczenia obserwuje się wzrost śre− dniej długości telomerów o 2 kbp [15]. Rezultatem takiego postępowania jest również skracanie się telomerów w prawidłowych komórkach hemopoe− tycznych, szczególnie linii mieloidalnej. Przedłu− żone leczenie lub terapia dużymi dawkami leków wymaga regeneracji układu krwiotwórczego, co jest przyczyną skrócenia telomerów o 1–2 kbp. Sugeruje się, że takie skrócenie telomerów powo− duje nie do końca poznane późne działania ubocz− 93 Telomery i aktywność telomerazy ne leczenia. Tłumaczyłoby to występowanie zwią− zanego z wiekiem wzrostu odsetka zachorowalno− ści na zespoły mielodysplastyczne chorych na bia− łaczkę, u których osiągnięto całkowitą remisję. Wyższy poziom aktywności telomerazy jest charakterystyczny dla nowotworów o gorszym ro− kowaniu. Odsetek uzyskiwanych CR nie jest związany z aktywnością telomerazy wykrywanej w chwili rozpoznania [15–35]. Mimo to wzrost aktywności telomerazy w czasie leczenia jest nie− korzystnym czynnikiem prognostycznym. Chorzy są oporni na chemioterapię i rzadko uzyskują re− misję [35, 37]. Obecność podwyższonej aktywności telomerazy w zaawansowanych stadiach białaczek może sugero− wać alternatywne drogi rozwoju choroby. Pierwsza hipoteza zakłada, że komórki pierwotnie są pozba− wione telomerazy, a w miarę skracania się telomerów dochodzi do jej powtórnej aktywacji i klony, wśród których doszło do takiej reaktywacji, zaczynają do− minować. Druga sugeruje istnienie komórek macie− rzystych wykazujących niezmienną aktywność telo− merazy. Komórki te zdolne są do podziału i dają po− kolenia komórek pozbawionych aktywności tego en− zymu. Same jednak komórki telomerazododatnie za− chowują normalną długość telomerów i to właśnie z nich wywodzą się komórki białaczkowe. Białaczki przewlekłe (CLL) Leukocyty od pacjentów we wczesnym sta− dium CLL wykazują średnio niższe wartości ak− tywności telomerazy w porównaniu do komórek pochodzących od osób zdrowych [33]. Leukocyty od pacjentów w późnej fazie CLL wykazują nato− miast wzrost aktywności tego enzymu. Długość te− lomerów w komórkach z niską aktywnością telo− merazy jest zbliżona do długości w prawidłowych komórkach (7,9 kbp). W późnej fazie CLL telome− ry są natomiast znacznie skrócone (4,4 kbp) i po− równywalne do wartości otrzymywanych z ko− mórek raka jajnika [33, 40]. Skrócone telomery i wysoka aktywność telomerazy są sprzężone do− datnio z krótkim okresem przeżycia, a aktywność telomerazy wydaje się najbardziej znaczącym czynnikiem rokowniczym dla całkowitego przeży− cia w CLL. Nie wykazano zależności między ak− tywnością telomerazy a stopniem zaawansowania klinicznego choroby [38]. Chłoniaki nieziarnicze (NHL) W przypadku NHL wykrywa się podwyższoną aktywność telomerazy, przy czym jest ona zdecy− dowanie wyższa w chłoniakach o wysokim stop− niu złośliwości niż w chłoniakach o niskim stop− niu złośliwości. Nie zaobserwowano zależności między aktywnością telomerazy a fenotypem chłoniaków [32]. Ziarnica złośliwa Podwyższona aktywność jest wykrywana tyl− ko w części przypadków ziarnicy złośliwej. Brak jej aktywności zaobserwowano u chorych z eozy− nofilią. Wykryto swoistą neurotoksynę eozynofi− lową oraz kationowe białko we frakcji oczy− szczonych eozynofili (obydwa białka to RNA− −zy), które degradowały telomerazę. Stosując in− hibitory RNA−az udaje się wykryć telomerazę w pierwotnie ujemnych komórkach ziarnicy zło− śliwej. Aktywność ta jest wyższa niż w prawidło− wych węzłach chłonnych, niższa zaś niż w NHL. Liczba komórek Red–Sternberga oraz Hodgkina nie ma związku z aktywnością telomerazy. Rów− nież między poszczególnymi typami ziarnicy nie obserwuje się istotnych różnic w ekspresji tego enzymu [39]. Zespoły mielodysplastyczne (MDS) W szpiku osób chorujących na MDS wykrywa się podwyższoną aktywność telomerazy (wzrost około 2−krotny), a telomery wykazują zmienną długość. W związku z tym w 1996 r. wyróżniono 3 klasy MDS: 1) krótkie telomery w chwili rozpoznania, bez zmian w czasie ewolucji choroby, 2) długie telomery i ich skracanie w czasie choroby, 3) długie i stabilne telomery [33]. Guzy lite u dzieci W komórkach pobranych z guzów nowotwo− rowych aktywność telomerazy jest bardzo wyso− ka, a telomery są wybitnie skrócone [40]. W prób− kach krwi obwodowej oraz szpiku u tych pacjen− tów nie wykryto natomiast istotnych różnic w po− równaniu ze zdrową populacją. Jedynie pacjenci z uogólnioną chorobą (stadium IV – przerzuty) wykazywali wzrost aktywności telomerazy we krwi obwodowej i szpiku. Chemioterapia powodu− je skracanie średniej długości telomerów leukocy− tów krwi obwodowej [15, 40]. 94 B. KAZANOWSKA et al. Podsumowanie Telomery są niezbędne do prawidłowej funk− cji i stabilności materiału genetycznego komórek eukariotycznych. Ich skracanie jest jednym z me− chanizmów inicjujących apoptozę, będącą natural− ną konsekwencją starzenia się i umierania ko− mórek. Tkanki, dla których funkcjonowania nie− zbędna jest możliwość odnowy i nieograniczone− go podziału komórkowego (tkanka rozrodcza, ko− mórki linii zarodkowej, niektóre komórki macie− rzyste szpiku), wytworzyły zdolność utrzymania stałej długości telomerów, a w pewnych warun− kach także ich wydłużania. Dzieje się to dzięki obecności polimerazy DNA zależnej od RNA, czyli telomerazy. Aktywność telomerazy stwierdzono również w wielu ludzkich komórkach nowotworowych. Enzym ten pozwala tym komórkom na przejście praktycznie nieograniczonej liczby podziałów ko− mórkowych, a w następstwie wzrost guza i eks− pansję nowotworu. Poziom aktywności telomera− zy zależy od rodzaju nowotworu i stopnia jego za− awansowania. Wysoka aktywność jest związana ze złym rokowaniem w takich nowotworach, jak: neuroblastoma, ostra białaczka szpikowa, rak sut− ka i rak jelita grubego. W niektórych nowotwo− rach, np.: raku żołądka, błon śluzowych jamy ust− nej i gardła, nowotworach skóry, aktywność telo− merazy pojawia się już we wczesnych etapach roz− woju choroby. Jednym z najbardziej interesujących odkryć ostatnich lat była obserwacja, iż telomeraza funk− cjonuje jako dimer złożony z hTERT, hTR lub oby− dwu składników jednocześnie [41]. Białko hTERT wydaje się odgrywać kluczową rolę w tworzeniu aktywnej formy tego enzymu. Dlatego obecnie co− raz większą uwagę poświęca się regulacji aktyw− ności poszczególnych składników kompleksu telo− merazy: hTR, hTERT i hTEP1 (telomerase associa− ted protein 1 – białko 1 związane z telomerazą) [42]. Badania Poole et al. dowiodły decydującego znaczenia regulacji hTERT dla ekspresji telomera− zy w większości komórek nowotworowych [43]. Regulacja ta dotyczy zarówno fazy przed−, jak i po− translacyjnej. Jej bliższe poznanie pozwoli być mo− że na stworzenie odpowiednich czynników hamu− jących ekspresję telomerazy na tym poziomie. Inne przeprowadzane obecnie badania doty− czą związków między aktywnością telomerazy a wrażliwością na chemioterapię. Obserwacje Ishibashi et al. dowiodły, iż telomery są docelo− wym miejscem działania takich leków przeciw− nowotworowych, jak np. cisplatyna [44]. Anali− zowany jest również wpływ chemioterapeuty− ków i napromieniania na modyfikowanie ekspre− sji telomerazy [17]. Znajomość powyższych faktów, a także poja− wiające się wciąż nowe doniesienia dotyczące ak− tywności telomerazy w różnych typach nowotwo− rów, wnoszą nowe informacje na temat biologii nowotworów. Oznaczanie stopnia aktywności te− lomerazy może być użyteczne w ocenie rokowni− czej przebiegu choroby nowotworowej oraz jako marker potencjału wzrostowego nowotworu i wy− krywania minimalnych zmian resztkowych u pa− cjentów po chemio− lub radioterapii. Znajomość aktywności tego enzymu służyć może monitoro− waniu przebiegu choroby, a inhibitory telomerazy mogą natomiast znaleźć zastosowanie w leczeniu przeciwnowotworowym w niedalekiej przyszłości [17, 21, 22–31, 44]. Piśmiennictwo [1] Watanabe N.: Telomerase, cell immortality and cancer. Hokkaido Igaku Zasshi 2001, 76, 127–132. [2] Martens U. M.: Telomeres and Telomerase. Biomedical Progress 2001, 14, 37–41. [3] Aragona M., Pontoriero A., Panetta S., La Torre I., La Torre F.: The role of telomere−binding proteins in car− cinogenesis. Minerva Med. 2000, 91, 299–304. [4] Shay J. W., Gazdar A. F.: Telomerase in early detection of cancer. J. Clin. Pathol. 1997, 50, 106–109. [5] Collins K.: Structure and function of telomerase. Curr. Opin. Cell Biol. 1996, 8, 374–380. [6] Cottliar A. S., Slavutsky I. R.: Telomeres and telomerase activity: their role in aging and in neoplastic develop− ment. Medicina (B Aires) 2001, 61, 335–342. [7] Kyo S., Takakura M., Inoue M.: Telomerase activity in cancer as a diagnostic and therapeutic target. Histol. Hi− stopathol. 2000, 15, 813–824. [8] Hiyama E., Hiyama K., Yokoyama T., Shay J. W.: Immunohistochemical detection of telomerase (hTERT) pro− tein in human cancer tissues and subset of cells in normal tissues. Neoplasia 2001, 3, 17–26. [9] Shay J. W., Wright W. E.: Telomerase activity in human cancer. Curr. Opin. Oncol. 1996, 8, 66–71. [10] Shay J. W.: Telomerase in Human Development and Cancer. J. Cell. Physiol. 1997, 173, 266–270. [11] Rao M. S., Mattson M., P.: Stem cells and aging: expanding the possibilities. Mech. Ageing Dev. 2001, 122, 713–734. [12] Shay J. W.: Molecular pathogenesis of aging and cancer: are telomeres and telomerase the connection? J. Clin. Pathol. 1997, 50, 799–800. [13] Ahmed A., Tollefsbol T.: Telomeres and telomerase: basic science implications for aging. J. Am. Geriatr. Soc. 2001, 49, 1105–1109. 95 Telomery i aktywność telomerazy [14] Krupp G., Bonatz G., Parwaresch R.: Telomerase, immortality and cancer. Biotechnol. Annu. Rev. 2000, 6, 103–140. [15] Engelhardt M., Ozkaynak M. F., Drullinsky P., Sandoval C., Tugal O., Jayabose S., Moore M. A. S.: Telo− merase activity and telomere length in pediatric patients with malignancies undergoing chemotherapy. Leukemia 1998, 12, 13–24. [16] Iwama H., Ohyashiki J. H., Hayashi S., Yahata N., Ando K., Toyama K., Hoshika A., Takasaki M., Mori M., Shay J. W.: Telomeric length and telomerase activity vary with age in peripheral blood cells obtained from nor− mal individuals. Hum. Genet. 1998, 102, 397–402. [17] Lin Z., Lin S., Viani M. A., Sapp M., Lim M. S.: Down−regulation of telomerase activity in malignant lympho− mas by radiation and chemotherapeutic agents. Am. J. Pathol. 2001, 159, 711–719. [18] Matthews P., Jones C. J.: Clinical implications of telomerase detection. Histopathology 2001, 38, 485–498. [19] Kim N. W.: Clinical Implications of Telomerase in Cancer. Eur. J. Cancer 1997, 33, 781–786. [20] Shay J. W., Zou Y., Hiyama E., Wright W. E.: Telomerase and cancer. Hum. Mol. Genet. 2001, 10, 677–685. [21] Sasgary S., Wieser M., Cerni C.: Targeted inhibition of telomerase in human cancer: will it be a double−edged sword? Onkologie 2001, 24, 22–26. [22] Robinson M. O.: Telomerase and cancer. Genet. Eng. (NY) 2000, 22, 209–222. [23] Stewart S. A., Weinberg R. A.: Telomerase and human tumorigenesis. Semin. Cancer Biol, 2000, 10, 399–406. [24] Greider C. W.: Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 90–92. [25] Shammas M. A., Simmons C. G., Corey D. R., Shmookler Reis R. J.: Telomerase inhibition by peptide nucleic acids reverses ‘immortality’ of transformed human cells. Oncogene 1999, 18, 6191–6200. [26] Hahn W. C., Meyerson M.: Telomerase activation, cellular immortalization and cancer. Ann. Med. 2001, 33, 123–129. [27] Kyo S., Inoue M.: Telomerase inhibitor. Gan To Kagaku Ryoho, 2001, 28, 614–621. [28] White L. K., Wright W. E., Shay J. W.: Telomerase inhibitors. Trends Biotechno. 2001, 19, 114–120. [29] Rowley P. T., Tabler M.: Telomerase inhibitors. Anticancer Res. 2000, 20, 4419–4429. [30] Shay J. W., Wright W. E.: Telomeres and telomerase: implications for cancer and aging. Radiat. Res. 2001, 155, 188–193. [31] Rakoval A. L., Bokarev I. N., Rezvan V. V.: Telomerase – new diagnostic and therapeutic options in oncology. Voen Med. Zh. 2000, 32, 26–29. [32] Norrback K. F., Dahlenborg K., Carlsson R., Roos G.: Telomerase activation in normal B−lymphocytes and non−Hodgkin`s lymphomas. Blood 1996, 88, 222–229. [33] Counter C. M., Gupta J., Harley C. B., Leber B., Bacchetti S.: Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood 1994, 85, 2315–2320. [34] Adamson D. A. G., King D. J., Haites N. E.: Significant shortening in childhood leukemia. Cancer Genet. Cy− togenet. 1992, 61, 204–206. [35] Xu D., Gruber A., Peterson C., Pisa P.: Telomerase activity and the expression of telomerase components in acu− te myelogenous leukaemia. Br. J. Haematol. 1998, 102, 1367–1375. [36] Youngren K., Jeanclos E., Aviv H., Kimura, M. Stock J., Hanne M., Skurnick J., Banderguez A., Aviv A.: Synchrony in telomere length of the human fetus. Hum. Genet. 1998, 102, 640–643. [37] Seol J. G., Kim S. E., Park W. H., Jung W. C., Kim B. K., Lee Y. Y.: Telomerase activity in acute myelogenous leukaemia: clinical and biological implications. Br. J. Haematol. 1998, 100, 156–165. [38] Belair C. D., Yeager T. R., Lopez P. M., Reznikoff C. A.: Telomerase activity: a biomarker of cell proliferation, not malignant transformation. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 13677–13682. [39] Ohshima K., Sugihara M., Haraoka S., Suzumiya J., Kanda M., Kawasaki C., Shimazaki K., Kikuchi M.: Possible immortalization of Hodgkin and Reed−Sternberg cells: telomerase expression, lengthening of telomere, and inhibition of apoptosis by NF−kappaB expression. Leuk. Lymphoma 2001, 41, 367–376. [40] Jinyoung Y., Robinson R.A.: Expression of Telomerase Activity and Telomerase RNA in Human Soft Tissue Sarcomas. Arch. Pathol. Lab. Med. 2000, 124, 393–397. [41] Wenz C., Enencel B., Amacker M., Kelleher C., Damm K., Lingner J.: Human telomerase contains two coo− perating telomerase RNA molecules. Embo. J. 2001, 20, 3526–3534. [42] Kojo S. J. Elenitoba−Johnson: Complex Regulation of Telomerase Activity. Implications for Cancer Therapy. Am. J. Pathol. 2001, 2, 405–410. [43] Poole J. C., Andrews L. G., Tollefsbol T. O.: Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene 2001, 269, 1–12. [44] Ishibashi T., Lipphard S. J.: Telomere loss in cells treated with cisplatin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 4219–4223. Adres do korespondencji: Katedra i Klinika Hematologii i Onkologii Dziecięcej AM ul. Bujwida 44 53−345 Wrocław e−mail : [email protected] Praca wpłynęła do Redakcji: 28.01.2002 r. Po recenzji: 20.05.2002 r. Zaakceptowano do druku: 29.09.2002 r. Received: 28.01.2002 Revised: 20.05.2002 Accepted: 29.09.2002
