popularyzatorski opis rezultatów projektu

Nr wniosku: 154295, nr raportu: 13920. Kierownik (z rap.): prof. dr hab. Wojciech Krzysztof Rode
Robaki pasożytnicze są najpowszechniejszymi chorobotwórczymi czynnikami infekcyjnymi
atakującymi człowieka, głównie w krajach rozwijających się. Globalnie, liczbę ludzi zakażonych tylko
nicieniami pasożytniczymi szacuje się na ponad dwa miliardy. Groźną chorobą, wywoływaną przez
nicienia pasożytniczego zarówno w krajach rozwijających się, jak i rozwiniętych, w tym dość
regularnie w Polsce, jest trichinelloza, czyli włośnica, będąca konsekwencją infekcji larwami
mięśniowymi włośnia krętego (Trichinella spiralis).
Inhibicja enzymu syntazy tymidylanowej jest od ponad 50 lat wykorzystywana w chemioterapii,
przede wszystkim przeciwnowotworowej, ale także przeciwwirusowej, przeciwgrzybicznej i
przeciwpierwotniaczej. Występowanie zaskakująco wysokiego poziomu tego enzymu stwierdziliśmy
wcześniej w całym rozwoju włośnia. Zjawisko wydaje się być wspólne dla nicieni, jako że
zaobserwowaliśmy je także w rozwoju innego nicienia, Caenorhabditis elegans, stosowanego w
badaniach jako organizm modelowy. Dlatego zaprojektowaliśmy badania, których celem było
poszukiwanie możliwości selektywnej inhibicji syntazy tymidylanowej nicieni (czyli inhibicji
znacznie słabiej wpływającej na enzym ssaka/człowieka niż nicienia), zakładając ewentualne
wykorzystanie tej inhibicji w zwalczaniu nicieni pasożytniczych. W celu znalezienia prototypu
inhibitora zastosowaliśmy podejście zastosowane wcześniej z powodzeniem przez innych badaczy w
celu znalezienia selektywnego inhibitora bakteryjnej syntazy tymidylanowej, polegające na
wirtualnym przeszukiwaniu baz danych, zawierających struktury komercyjnie dostępnych związków,
w poszukiwaniu takiego, który "pasowałby" lepiej do struktury trójwymiarowej enzymu włośnia/C.
elegans niż myszy/człowieka.
Biorąc pod uwagę brak opisanej struktury trójwymiarowej syntazy tymidylanowej
jakiegokolwiek nicienia (w całej grupie metazoa znane były tylko struktury trójwymiarowe syntaz
tymidylanowych ludzkiej, szczurzej i mysiej), poznanie takich struktur było warunkiem powodzenia.
Realizowaliśmy następujące zadania:
1. Poznanie struktur krystalograficznych syntazy tymidylanowej T. spiralis oraz C. elegans w postaci
wolnej oraz w kompleksach z substratem/analogiem lub substratem/analogiem i
kofaktorem/analogiem;
2. Porównanie struktury białek syntazy tymidylanowej każdego z dwóch nicieni ze strukturą białka
enzymu ludzkiego, w kontekście możliwości selektywnej inhibicji enzymu nicienia;
3. Wirtualna selekcja potencjalnych inhibitorów syntazy tymidylanowej, przeprowadzona na
podstawie struktury trójwymiarowej białka enzymu każdego z dwóch nicieni, z uwzględnieniem
wyników porównania z enzymem ludzkim, poprzez przeszukanie przy pomocy programu DOCK bazy
danych ZINC, zawierającej związki dostępne komercyjnie, pod kątem możliwości wiązania z
enzymem;
4. Weryfikacja eksperymentalna wpływu wyselekcjonowanych związków na reakcję katalizowaną
przez syntazę tymidylanową każdego z dwóch nicieni, w porównaniu z wpływem na parametry reakcji
katalizowanej przez enzymy mysi/ludzki. Ponadto badano zdolność tych związków do ograniczania
żywotności nicienia C. elegans oraz eliminacji larw mięśniowych T. spiralis z mięśni myszy..
W konsekwencji realizacji projektu poznano 12 nowych krystalograficznych struktur syntaz
tymidylanowych obu nicieni oraz myszy. W oparciu o matryce, wykorzystujące wybrane struktury,
wyselekcjonowano ponad 30 związków - potencjalnych selektywnych inhibitorów enzymu nicienia.
Związki te poddano badaniom aktywności w stosunku do syntaz tymidylanowych nicieni/myszy i
człowieka oraz ich wpływu na żywotność nicienia C. elegans.
Badania te wzbogaciły wiedzę o strukturach przestrzennych białka syntazy tymidylanowej,
ważnego celu molekularnego chemioterapii. Ponadto dostarczyły nowych informacji na temat
mechanizmu reakcji enzymu, co jest ich „produktem ubocznym”, związanym z odkryciem nowych
faktów nt. słabo poznanego mechanizmu inhibicji enzymu przez N4-hydroksy-dCMP. Kontynuowana
weryfikacja eksperymentalna aktywności licznych wyselekcjonowanych związków powinna także
dostarczyć nowej wiedzy na temat możliwości selektywnego wpływu na aktywność syntazy
tymidylanowej nicieni oraz na ich żywotność.