występowanie i zróżnicowanie genów odpowiedzialnych za

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: 13 - 17
Tomasz Jarzembowski1), Aleksandra Dybikowska2) Maria Dąbrowska-Szponar1)
WYSTĘPOWANIE I ZRÓŻNICOWANIE GENÓW
ODPOWIEDZIALNYCH ZA OPORNOŚĆ NA TETRACYKLINĘ
SZCZEPÓW ENTEROCOCCUS FAECALIS IZOLOWANYCH
W REGIONIE GDAŃSKIM.
1)
Katedra Mikrobiologii , Zakład Mikrobiologii Lekarskiej AM w Gdańsku
p.o. kierownika: dr M. Dąbrowska-Szponar
2)
Katedra i Klinika Hematologii i Transplantologii AM w Gdańsku
Kierownik: prof. dr hab. med. A. Hellmann
Porównano częstość występowania u E. faecalis genów tet(M) i tet(S) oraz
transpozonów Tn916 i Tn5397, na których najczęściej zlokalizowane są
powyższe geny. Stwierdzono istotne różnice w częstości występowania transpozonów i genu tet(S) w izolatach klinicznych oraz komensalnych. Filogenetyczna analiza genu tet(M), wykazała podobieństwa genetyczne niezależne od
pochodzenia szczepu, co może wskazywać na swobodne rozprzestrzenianie
się genu tet(M) pomiędzy szczepami.
Powszechne stosowanie antybiotyków prowadzi do selekcji szczepów opornych nie
tylko wśród chorobotwórczych bakterii, ale również wśród szczepów uważanych za komensalne. Powstaje w ten sposób „rezerwuar” genów oporności, który dzięki transferowi może
przyczyniać się do gwałtownego wzrostu liczby szczepów opornych. Grupą bakterii pełniąca
taką rolę są często paciorkowce kałowe, w tym E. faecalis (10,15). Powyższy mechanizm
doprowadził do dramatycznego wzrostu oporności na tetracykliny (2,6). Antybiotyki te,
charakteryzujące się szerokim spektrum działania, hamują syntezę białek u bakterii G(+)
i G(-) poprzez blokowanie łączenia się tRNA z podjednostką 30S rybosomów (10).
Oporność na tę grupę antybiotyków może być warunkowana przede wszystkim przez
dwa główne mechanizmy: blokowanie łączenia się antybiotyku z rybosomem przez białka
cytoplazmatyczne zaliczane do 6 klas tet M, tet O, tet B, tet Q, tet S, otrA (3, 8, 9, 13) oraz
aktywne usuwanie tetracykliny z komórki (7). Trzeci mechanizm, enzymatyczny rozkład
antybiotyku, jest bardzo rzadki (11).
Obecnie szczepy E. faecalis, oporne na tetracykliny, są izolowane zarówno od ludzi,
zwierząt jak i z produktów spożywczych. Wiadomo, że oporność szczepów klinicznych
jest najczęściej warunkowana przez geny tet(M) i tet(S) rozprzestrzeniające się wraz
z transpozonami Tn916 i Tn5397 (1,5). Natomiast informacje na temat oporności szczepów
komensalnych są bardzo ograniczone i oparte z reguły na badaniach fenotypowych (4).
Celem niniejszej pracy była identyfikacja genów oporności na tetracykliny u szczepów
E. faecalis izolowanych w regionie gdańskim oraz analiza rozprzestrzeniania się genów
14
Nr 1
T. Jarzębowski, A. Dybikowska, M. Dąbrowska-Szponar
tet(M) i tet(S) kodowanych na transpozonach Tn5397 i Tn916, na podstawie stopnia podobieństwa sekwencji DNA.
MATERIAŁ I METODY
Badania przeprowadzono na 24 szczepach E. faecalis wyizolowanych z kału zdrowych
osób oraz 27 szczepach wyizolowanych z różnych próbek materiału klinicznego, jako etiologiczny czynnik zakażenia, od pacjentów hospitalizowanych w jednym ze szpitali Gdańska.
Oznaczenie lekowrażliwości szczepów na tetracyklinę przeprowadzono metodą dyfuzyjno-krążkową zgodnie z zaleceniami NCCLS. DNA izolowano przy użyciu komercyjnego
zestawu „A&A Biotechnology”, zgodnie z instrukcją podaną przez producenta.
Wykorzystując metodę PCR, przy użyciu starterów przedstawionych w tabeli I, identyfikowano geny warunkujące oporność na tetracykliny tet(M) i tet(S). Obecność transpozonów koniugacyjnych w badanej populacji szczepów oznaczono przy pomocy metody PCR,
badając odpowiednio geny xis-Tn transpozonu Tn916 i tndX transpozonu Tn5397.
W skład mieszaniny reakcyjnej, o objętości 50 μl, wchodziło: dNTP w końcowym
stężeniu 200 µM, 1 jednostka polimerazy DNA Pfu (Fermentas), 20 pmoli każdego z pary
starterów (Tabela I) oraz 5 µl matrycy DNA w stężeniu ok. 5 ng/µl. Reakcję PCR przeprowadzono wg następującego protokołu: wstępna denaturacja 3 min 94 °C; 35 cykli: denaturacja 1 min 94 °C; przyłączanie starterów 1 min w optymalnej temperaturze (Tabela I);
wydłużanie 3 min 72 °C.
Tabela I. Sekwencje starterów użytych w reakcji PCR.
Startery
Tet(M)-2
Tet(M)-3
TetS-fw
TetS-rv
xis-Tn916-1
xis-Tn916-2
Tn5397-tndX-1
Tn5397-tndX-2
Sekwencja 5’ → 3’
TGGAGCGATTACAGAATTA
GCAGAAATCAGTAGAATTGC
GAAAGCTTACTATACAGTAGC
AGGAGTATCTACAATATTTAC
GCCATGACCTATCTTATA
CTAGATTGCGTCCAA
ATGATGGGTTGGACAAAGA
CTTTGCTCGATAGGCTCTA
Temperatura
przyłączania starterów
(°C)
52
Literatura
1
50
2
34
1
54
1
Produkty reakcji PCR rozdzielano w 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny i oglądano w świetle UV. Uzyskane produkty amplifikacji genu tet(M) zostały następnie
sekwencjonowane z wykorzystaniem fluorescencyjnie znakowanych dideoksynukleotydów
BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, USA).
Produkty reakcji sekwencjonowania rozdzielano w 4-kapilarnym aparacie ABI PRISM
3130. Sekwencjonowanie wykonano w Laboratorium Biotechnologii i Ochrony Środowiska
Pomorskiego Parku Naukowo-Technologicznego w Gdyni.
Analizę podobieństw przeprowadzono przy użyciu programu Mega 4 (12).
Częstość występowania poszczególnych genów oceniono testem χ2 .
Nr 1
Geny oporności na tetracykliny u E. faecalis
15
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
W niniejszej pracy badano częstość występowania genów tet(M) i tet(S) oraz obecność
transpozonów koniugacyjnych zarówno u szczepów pochodzących z różnych materiałów
klinicznych jak i od zdrowych osób. Z danych przedstawionych w tabeli II wynika, że częstość występowania genu tet(M) w szczepach izolowanych z zakażeń jest znacznie niższa
w porównaniu do danych piśmiennictwa, gdzie obecność genu tet(M) stwierdza się u około
95% enterokoków (5, 6).
Jak wynika z naszych badań, różnice w częstości występowania genu tet(M) w grupie
szczepów komensalnych i izolowanych jako czynnik etiologiczny nie były istotne statystycznie. W odniesieniu do genu tet(S) różnica była już wyraźnie widoczna i potwierdzona testem
χ2 (Tabela II). Wśród izolatów klinicznych stwierdzono znacznie wyższą, niż u szczepów
komensalnych, częstość występowania transpozonów. Była ona zbliżona do obserwowanej
przez innych autorów i wynosiła 82% (1,14). Należy ponadto zauważyć, że u wszystkich
szczepów pochodzących z zakażeń, u których występował gen tet(M), wykryto również
przynajmniej jeden z transpozonów. Można przypuszczać, że we wszystkich przypadkach
gen ten był zlokalizowany na transpozonie. W przypadku 50% szczepów komensalnych nie
udało się zidentyfikować żadnego z transpozonów, co może sugerować, że gen tet(M) był
zlokalizowany na innym elemencie mobilnym, takim jak na przykład plazmidy (9). Uzyskane
wyniki różniły się pod tym względem od doniesień innych autorów. Wykazywali oni związek
obecności transpozonu z opornością na tetracykliny również u szczepów niechorobotwórczych, ale również rzadsze występowanie genów tet(M) w tej grupie bakterii (6).
Tabela II. Częstość występowania genów tet(M), tet(S) oraz transpozonów koniugacyjnych xis-Tn,
tnd-X w szczepach izolowanych od osób chorych i zdrowych.
Geny
tet(M
tet(S),
xis-Tn
tnd-X
Szczepy
Z zakażeń (n=27)
14 (51,8%)
4 (14,8%)
24 (88,9%)
4 (14,8%)
Komensalne (n=24)
16 (66,7%)
0 (0%)
12 (50%)
0 (0%)
Stwierdzone różnice w częstości występowania badanych genów sugerujące istnienie
bariery w rozprzestrzenianiu się oporności na tetracyklinę pomiędzy szczepami enterokoków
izolowanych z próbek materiału klinicznego oraz szczepami pochodzącymi od zdrowych
osób, skłoniły nas do wykonania analizy podobieństwa sekwencji genu tet(M)
Podobnie jak w badaniach innych autorów (6), wśród badanych sekwencji genu tet(M)
wyróżniono 4 grupy o wysokim stopniu podobieństwa SGH (sequence homology group) genu
tet(M) (Ryc.1). Grupa I i IV obejmowała szczepy pochodzące z materiałów klinicznych oraz
szczepy od zdrowych osób, pozbawione badanych transpozonów. Grupę II stanowiły sekwencje stwierdzone wyłącznie u enterokoków pochodzacych z zakażeń. Natomiast w skład
grupy III wchodziły sekwencje pochodzące ze szczepów z zakażeń i komensalnych pozbawionych lub posiadających transpozon. Duże podobieństwo pomiędzy genami izolowanymi
ze szczepów o różnym pochodzeniu wskazuje na bardzo efektywne rozprzestrzenianie się
transpozonu kodującego gen tet(M) w środowisku.
16
T. Jarzębowski, A. Dybikowska, M. Dąbrowska-Szponar
Ryc.1.
Nr 1
Analiza podobieństwa sekwencji genu tet(M) metodą UPGMA.
Zak – szczep z zakażeń; Kom – szczep komensalny; szczep+TN – szczep, u którego wykryto transpozon; SGH (sequence homology group) – grupa o wysokiej homologii. Przy
gałęziach podano wartości testu boostrap.
Ze względu na stosunkowo dużą zmienność badanego genu stwierdzenie wysokiej
homologii sekwencji pochodzących ze szczepów o różnych właściwościach epidemiologicznych może świadczyć o swobodnym rozprzestrzenianiu się genu tet(M) pomiędzy
szczepami enterokoków.
T. J a r z e mb o w s k i , A. Dybi kowska , M. Dą b row s ka-S zponar
THE PREVALANCE OF TETRACYCLINE RESISTANCE GENES IN CLINICAL AND
COMMENSAL STRAINS OF ENTEROCOCCUS FAECALIS ISOLATED IN GDAŃSK.
SUMMARY
The common use of antibiotics is responsible for selecting of drug resistance not only in pathogenic, clinical bacteria but also in commensal, not pathogenic strains which could cause the rapid
dissemination of the resistance to these antibacterial agents. However, information regarding the antibiotic resistance of commensal bacteria is very scarce, and the data is based mostly on phenotypical
research. Therefore the use of genotyping methods for detection of tetracycline resistance genes, in
commensal and medical isolates of bacteria, is essential, for understnding the spread of antibiotic
resistance.
In this study 24 commensal and 27 clinical isolates of Enterococcus faecalis has been screened by
PCR methods for tet(M), tet(S) genes and Tn916 and Tn5397 transpozons. Subsequently, the tet(M)
gene amplicones were sequenced and phylogenetic analysis was performed. We have found that the
prevalence of tet(S) gene varied significantly between commensal and clinical strains. Moreover,
Nr 1
Geny oporności na tetracykliny u E. faecalis
17
the frequency of transpozons in clinical isolates was much higher comparing to strains isolated from
healthy individuals.
The phylogenetic analysis did not show significant differences between clinical and commensal
strains but it could suggest that the genetic similarity between these two groups could be favourable
factor for broad range spread of tet(M) gene.
PIŚMIENNICTWO
1. Agersø Y, Pedersen AG, Aarestrup FM. Identification of Tn5397-like and Tn916-like transposons
and diversity of the tetracycline resistance gene tet(M) in enterococci from humans, pigs and
poultry. J Antimicrob Chemother 2006; 57: 832–9
2. Aminov RI, Garrigues-Jeanjean N, Mackie RI. Molecular ecology of tetracycline resistance:
development and validation of primers for detection of tetracycline resistance genes encoding
ribosomal protection proteins. Appl Environ Microbiol 2001; 67: 22–32.
3. Burdet V. Purification and characterization of Tet(M), a protein that renders ribosomes resistant
to tetracycline. J Biol Chem 1991; 266: 2872–7.
4. Doherty N, Trzcinski K, Pickerill P i inni. Genetic diversity of the tet(M) gene in tetracyclineresistant clonal lineages of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 2000; 44:
2979–84.
5. Gevers D, Danielsen M, Huys G, Swings J. Molecular characterization of tet(M) genes in Lactobacillus isolates from different types of fermented dry sausage. Appl Environ Microbiol 2003;
69: 1270–5.
6. Huys G, D’Haene K, Collard JM, Swings J. Prevalence and molecular characterization of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from food. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 1555–62.
7. Levy SB. Active efflux mechanisms for antimicrobial resistance. Antimicrob Agents Chemother
1992; 36: 695–703.
8. Manavathu EK, Fernandez CL, Cooperman BS, Taylor DE. Molecular studies on the mechanism
of tetracycline resistance mediated by Tet(O). Antimicrob Agents Chemother 1990; 34: 71–7.
9. Roberts MC. Tetracycline resistance determinants: mechanisms of action, regulation of expression,
genetic mobility, and distribution. FEMS Microbiol Rev 1996; 19: 1–24.
10. Schnappinger D, Hillen W. Tetracyclines: antibiotic action, uptake, and resistance mechanisms.
Arch Microbiol 1996; 165: 359–69.
11. Speer BS, Salyers AA. Novel aerobic tetracycline resistance gene that chemically modifies tetracycline. J Bacteriol 1989; 171:148–53.
12. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)
software version 4.0. Mol Biol Evol 2007; 24: 1596-9.
13. Taylor DE, Chau A. Tetracycline resistance mediated by ribosomal protection. Antimicrob Agents
Chemother 1996; 40: 1–5.
14. Rice LB. Tn916 family conjugative transposons and dissemination of antimicrobial resistance
determinants. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 1871–7.
15. Roberts AP, Davis IJ, Seville L, Villedieu A i inni. Characterization of the ends and target site
of a novel tetracycline resistance-encoding conjugative transposon from Enterococcus faecium
664.1H1. J Bacteriol 2006; 188: 4356–61.
Otrzymano: 12 II 2008 r.
Adres Autora: 80-227 Gdańsk, ul. Do Studzienki 38,
Zakład Mikrobiologii Lekarskiej AM w Gdańsku