wpływ kontaktu ze środowiskiem szpitala na wrażliwość na

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 359 - 366
Anna K. Kwaszewska, Maria Sobiś-Glinkowska, Eligia M. Szewczyk
1
WPŁYW KONTAKTU ZE ŚRODOWISKIEM SZPITALA NA
WRAŻLIWOŚĆ NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI
LIPOFILNYCH SZCZEPÓW CORYNEBACTERIUM REZYDUJĄCYCH
NA SKÓRZE CZŁOWIEKA
Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej; Katedra Biologii i Biotechnologii
Farmaceutycznej; Uniwersytet Medyczny w Łodzi
Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. E. M. Szewczyk prof. UM
W pracy analizowano wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki dwóch
grup szczepów lipofilnych maczugowców rezydujących na skórze zdrowych
osób nie mających kontaktu ze środowiskiem szpitala oraz lekarzy ściśle
z nim związanych. Wykazano pięciokrotnie częstszą wielolekooporność wśród
szczepów izolowanych od lekarzy w tym oporność na antybiotyki stosowane
tylko w leczeniu szpitalnym.
Florę rezydencką skóry człowieka stanowią drobnoustroje względnie trwale ulokowane
w warstwie rogowej naskórka, nieusuwane przy zabiegach higienicznych, w związku z tym
na długo związane z określoną osobą i względnie trudno ulegające wymianie na drobnoustroje z otoczenia. Florę tę tworzą w przeważającej liczbie gronkowce, propionibakterie
i maczugowce. Udział ilościowy tych grup drobnoustrojów wśród rezydentów skóry jest
cechą osobniczą, a wśród nich najmniej liczną stanowią maczugowce (11). Flora rezydencka
stanowi istotną ochronę przed zasiedlaniem skóry przez drobnoustroje egzogenne, w tym
bakterie chorobotwórcze (16). Wielokrotnie wykazywano jednak, że rezydenci skóry mogą
być przyczyną zakażeń oportunistycznych, szczególnie u szpitalnych pacjentów z zaburzoną
odpornością. Bardzo często takie zakażenia powodowane są gronkowcami koagulazoujemnymi. Coraz częściej wykazywany jest także udział maczugowców, szczególnie C. jeikeium
w tych zakażeniach. Szczepy powodujące najniebezpieczniejsze zakażenia szpitalne charakteryzuje wielolekooporność.
Ocena oporności maczugowców bytujących jako rezydenci na skórze osób, które nie
miały kontaktu ze szpitalem i antybiotykami oraz zdrowych osób na co dzień mających
bardzo bliski kontakt ze środowiskiem szpitalnym była przedmiotem badań prezentowanych
w niniejszej pracy.
1
Praca finansowana z funduszy statutowych 503-3012-3
360
A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk
Nr 4
MATERIAŁ I METODY
S z c z e p y b a k t e r y j n e . Zbadano 179 szczepów maczugowców lipofilnych (Tabela
I). Były to szczepy trwale rezydujące na skórze człowieka, wyizolowane od osób, które nie
były związane ze środowiskiem medycznym (kolekcja I) i od lekarzy pracujących w Klinice
Chirurgii Ogólnej i Kolorektalnej UM w Łodzi (kolekcja II). Sposób izolacji i identyfikacji
tych maczugowców opisano wcześniej (10,11).
P o d ł o ż a i m e t o d y b a d a w c z e . Szczepy przechowywano w bulionie z glicerolem w
temp. –70oC. Namnażano je na podłożu TYT-80: TSA (Graso); Yeast Extract - 0,3% (Difco);
Tween 80 - 0,05% (INC Biomedicals); odwłókniona krew barania 5% (11). Wrażliwość na
antybiotyki i chemioterapeutyki oznaczano na podłożu Mueller-Hinton 2 Agar (BioMerieux)
z dodatkiem 0,1% Tween 80 (INC Biomedicals) metodą krążkowo-dyfuzyjną, przyjmując
wytyczne i kryteria dla S.aureus Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości
Drobnoustrojów (7). Szczepy średnio wrażliwe według tych kryteriów klasyfikowano jako
oporne. Wykonywano po dwa powtórzenia wszystkich oznaczeń.
W badaniach stosowano krążki antybiotykowe firmy BBL: penicylina 10 IU, amoksycylina/kwas klawulanowy 30 μg, cefalotyna 30 μg, cefuroksym 30 μg, ceftriakson 30 μg,
imipenem 10 μg, tetracyklina 30 μg, gentamicyna 10 μg, netilmicyna 30 μg, erytromycyna
15 μg, klindamycyna 2 μg, ciprofloksacyna 5 μg, lewofloksacyna 5 μg, chloramfenikol 30
μg, rifampicyna 5 μg.
A n a l i z a s t a t y s t y c z n a . Otrzymane wyniki analizowano w oparciu o parametryczny
test t oraz nieparametryczny Cohrana-Coxa przy użyciu programu Statistica 5.0 StatSoft.
Przyjęto poziom ufności p<0,05.
WYNIKI
Według klinicznych kryteriów oceny, większość szczepów z obu kolekcji wykazywała
oporność tylko na jedną lub dwie, rzadziej na trzy grupy badanych leków. Wśród szczepów
izolowanych od lekarzy zaobserwowano jednak większy udział szczepów opornych na antybiotyki beta-laktamowe, tetracykliny, aminoglikozydy, fluorochinolony i chloramfenikol
(Ryc. 1). Powszechna w obu grupach szczepów była kliniczna oporność na linkozamidy i
makrolidy. Izolowane od osób spoza środowiska szpitalnego dwa szczepy Corynebacterium
grupy CDC G 1 i jeden C. accolens były oporne na rifampicynę.
W ocenie wrażliwości badanych szczepów przyjęto określenie „wielolekooporność”
definiowane jako brak klinicznej wrażliwości szczepu na co najmniej cztery grupy antybiotyków i chemioterapeutyków. W kolekcji szczepów izolowanych od lekarzy wielolekooporność
występowała pięciokrotnie częściej niż wśród szczepów pochodzących spoza środowiska
szpitalnego (Ryc. 2). Tylko w tej kolekcji znalazły się szczepy oporne na więcej niż cztery
grupy leków. Wśród szczepów wielolekoopornych dominowały Corynebacterium grupa
CDC G2 i C. jeikeium (Tabela I).
Przeprowadzono analizę statystyczną wrażliwości szczepów w obu kolekcjach, porównując wielkości stref zahamowania wzrostu wokół krążków z określonymi lekami. Podobną
analizę wykonano również dla najczęściej izolowanych taksonów: C.jeikeium, Corynebacterium grupy CDC G1 oraz Corynebacterium grupy CDC G2 (Tabela II).
Nr 4
361
79,2%
74,3%
100%
80%
86,8%
87,8%
Lekowrażliwość Corynebacterium
RIFAMPICYNA
2,8%
0,0%
17,9%
27,0%
CHLORAMFENIKOL
0,9%
6,8%
kolekcja I
FLUOROCHINOLONY
LINKOZAMIDY
AMINOGLIKOZYDY
TETRACYKLINY
BETA-LAKTAMY
0%
MAKROLIDY
0,0%
1,4%
7,5%
20%
5,7%
13,5%
40%
20,3%
60%
kolekcja II
Rycina 1. Odsetki szczepów opornych według kryteriów klinicznych na badane antybiotyki i chemioterapeutyki w obu kolekcjach
87,6%
100,0%
74,3%
80,0%
Rycina 1. Odsetki szczepów opornych według kryteriów klinicznych na badane
60,0%
antybiotyki i chemioterapeutyki w obu kolekcjach
40,0%
20,0%
0,0%
9,5%
14,9%
10,8%
2,9%
wrażliwe na
wszystkie leki
oporne na mniej niż
4 grupy leków
kolekcja I
wielolekooporne
kolekcja II
Rycina 2. Wrażliwość i wielolekooporność badanych szczepów obu kolekcji
Istotne statystycznie różnice odnotowano w przypadku dziesięciu antybiotyków.
W dziewięciu przypadkach (wyjątek stanowiła rifampicyna) szczepy z kolekcji II, a więc
pochodząceRycina
od lekarzy,
miały mniejsze
strefy zahamowania
wzrostu,obu
a zatem
wykazywały
2. Wrażliwość
i wielolekooporność
badanych szczepów
kolekcji
8
362
Nr 4
A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk
Tabela I. Gatunki wrażliwe na wszystkie leki i gatunki wielolekooporne w obu badanych kolekcjach
Liczba szczepów
Gatunek/takson
liczba szczepów
liczba szczepów
wrażliwych
wielolekoopornych
kolekcja kolekcja kolekcja kolekcja kolekcja kolekcja
I
II
I
II
I
II
31
25
5
1
1
3
C. jeikeium
33
23
1
2
0
4
Corynebacterium grupa CDC G2
15
16
1
3
0
1
Corynebacterium grupa CDC G1
10
2
3
0
0
1
C. afermentans subsp.lipophilum
5
5
0
1
0
2
Corynebacterium grupa CDC F1
2
2
0
0
0
0
C. diphtheriae var. intermedius
2
1
0
1
1
0
C. kroppenstedtii
4
0
0
C. urealyticum
2
0
1
C. accolens
1
0
0
C. macginleyi
Tabela II. Porównanie średnich wartości wielkości stref zahamowania wzrostu dla wszystkich szczepów oraz dla najczęściej izolowanych gatunków w obu kolekcjach
Wszystkie
kolekcja I
kolekcja II
kolekcja I
kolekcja II
wartość p
kolekcja I
kolekcja II
wartość p
41
38
0,072
37
38 0,836
42
37
0,000
44
41
0,001
48
46
0,164
44
45 0,733
49
44
0,000
50
50
48
45
40
55
34
37
41
11
6
40
39
28
35
44
42
38
50
29
34
38
11
6
36
35
26
38
0,035
0,021
0,160
0,005
0,005
0,008
0,038
0,002
0,004
0,031
0,004
44
43
37
53
32
35
40
13
7
40
39
28
36
45
42
38
47
27
34
37
11
3
34
33
25
37
50
45
41
55
35
38
42
8
4
40
39
27
36
44
41
37
50
26
32
37
9
6
36
36
25
38
0,052
0,439
0,923
0,000
0,000
0,000
0,000
0,000
0,153
0,000
0,219
0,003
0,000
48
48
41
59
37
37
40
12
6
43
39
27
32
48
45
41
54
37
38
43
15
7
39
38
27
42
0,849
0,000
0,976
0,507
0,000
0,129
0,000
0,968
0,250
wartość p
wartość p
Penicylina
Amoksycylina
/kwas klawulanowy
Cefalotyna
Cefuroksym
Ceftriakson
Imipenem
Tetracyklina
Gentamicyna
Netilmicyna
Erytromycyna
Klindamycyna
Ciprofloksacyna
Lewofloksacyna
Chloramfenikol
Rifampicyna
kolekcja II
Średnia strefa (mm)
dla:
Corynebacterium Corynebacterium
grupa CDC G2
grupa CDC G1
C. jeikeium
kolekcja I
badane szczepy
0,942
0,745
0,660
0,135
0,144
0,400
0,191
0,596
0,116
0,028
0,009
0,314
0,681
Nr 4
Lekowrażliwość Corynebacterium
363
mniejszą wrażliwość. Największe różnice dotyczyły imipenemu, aminoglikozydów i chinolonów.
W przypadku antybiotyków β-laktamowych istotne statystycznie różnice wielkości
stref, wskazujące na mniejszą wrażliwość szczepów pochodzących od lekarzy dotyczyły
przede wszystkim Corynebacterium grupa CDC G2 i w mniejszym stopniu Corynebacterium grupa CDC G1, ale nie C. jeikeium. Szczepy wszystkich trzech gatunków tej kolekcji
wykazywały wyraźnie mniejszą wrażliwość na chinolony, przy czym tylko w przypadku
C. jeikeium dotyczyło to obu badanych preparatów tej grupy.
Największe różnice między badanymi kolekcjami wykazały szczepy należące do Corynebacterium grupy CDC G2. Odnotowano mniejszą wrażliwość szczepów kolekcji II na
osiem badanych leków. Dotyczyła ona prawie wszystkich badanych grup, w tym aminoglikozydów, tetracyklin i chloramfenikolu.
Porównanie wielkości stref zahamowania wzrostu potwierdziło powszechną, dotyczącą
wszystkich badanych gatunków i niezależną od miejsca izolacji oporność na makrolidy
i linkozamidy.
DYSKUSJA
Informacje dotyczące wrażliwości na antybiotyki bakterii należących do rodzaju Corynebacterium dotyczą szczepów izolowanych od osób chorych i nie zawierają danych
o naturalnej wrażliwości tych pałeczek na antybiotyki i chemioterapeutyki. Brak jest badań
przeprowadzonych na szczepach spoza środowiska szpitalnego, czy też oceny łatwości
nabywania genów oporności.
Zastosowany w przedstawionych tu badaniach sposób izolacji maczugowców ze skóry
gwarantował izolację stałych rezydentów, trwale związanych z jej powierzchnią na długie
okresy czasu (11). Obie kolekcje bakterii izolowano od młodych, zdrowych mężczyzn nie
poddawanych antybiotykoterapii w okresie co najmniej 3 miesięcy przed pobraniem próbek.
Lekarze pracowali w oddziale zabiegowym, gdzie u pacjentów stosowano szerokowidmową
profilaktykę, a często też terapię antybiotykową.
Oznaczanie wrażliwości maczugowców na antybiotyki i chemioterapeutyki jest trudne,
z powodu konieczności uwzględniania wymagań wzrostowych tych drobnoustrojów i ich
powolnego wzrostu (12), oraz przyjęcia specjalnych kryteriów oceny tej wrażliwości. Przez
różnych autorów i ośrodki naukowe, dla maczugowców przyjmowane są kryteria opracowane
dla innych rodzajów bakterii: dla Listeria (19), Streptococcus (1,19), lub najczęściej, dla
Staphylococcus (1,3). Oznaczanie wartości MIC jest polecaną metodą badania wrażliwości
maczugowców w praktyce klinicznej (8), ale jest bardzo kosztowne przy analizie dużych
grup szczepów (13). Dla potrzeb niniejszej pracy uznano, że porównanie szczepów obu
kolekcji metodą dyfuzyjno-krążkową, poddaną starannej walidacji, da wystarczająco jasną
odpowiedź na postawione w celu badań pytanie.
W niektórych publikacjach opisywano izolowany z próbek materiału klinicznego C.
jeikeium jako gatunek oporny na wszystkie antybiotyki z wyjątkiem glikopeptydów (2).
W prezentowanej pracy większość szczepów wyizolowanych ze skóry zdrowych osób była
jednak względnie wrażliwa. Wyniki tej pracy wskazują, że wielolekooporność lipofilnych
maczugowców jest cechą nabywaną i selekcjonującą się w szpitalu. Często opisywana jest
364
A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk
Nr 4
oporność na penicylinę szczepów izolowanych z przypadków klinicznych (5). W przedstawianych badaniach szczepy C.jeikeium były na ogół wrażliwe na ten antybiotyk, ale
widać znaczącą różnicę w oporności na antybiotyki β-laktamowe między szczepami
Corynebacterium grupy CDC G2 i CDC G1 obu kolekcji. Wśród szczepów izolowanych
od lekarzy była mniejsza wrażliwość, lub stwierdzono kliniczną oporność na imipenem,
aminoglikozydy i chinolony - antybiotyki stosowane przede wszystkim, lub tylko, w warunkach szpitalnych.
Przeprowadzone badania wyraźnie potwierdzają wcześniejsze obserwacje innych autorów mówiące o oporności lipofilnych maczugowców na klindamycynę i erytromycynę.
U kilku szczepów zaobserwowano, że ma ona charakter indukcyjnej oporności MLSB.
Oporność taką opisywali też Rosato i wsp. (14), wiążąc ją z obecnością genu ermX na
transpozonie Tn5432 umiejscowionym w chromosomie. U innych gatunków gen ten znajdowano na plazmidzie (17, 18). Wymiana genetyczna, a tym samym pozyskiwanie genów
oporności występuje między gatunkami maczugowców szczególnie w warunkach szpitalnych
(6). Wiadomo, że komórki maczugowców lipofilnych często nie zawierają plazmidów lub
mają je nieliczne (17). Nie udowodniono jeszcze u nich bezpośredniego transferu genów
oporności. Tymczasem niektórzy autorzy sugerują pozyskiwanie ich przez maczugowce od
współbytujących na skórze Propionibacterium (14), czy Staphylococcus (4). Szczególnie
ważna dla szczepów rezydentów byłaby możliwość przekazywania ich przez gronkowce
koagulazoujemne. Ich szczepy, stanowiąc istotny składnik flory rezydenckiej, są także
elementem flory przejściowej. Jung i wsp. (9) twierdzą, że gronkowce koagulazoujemne
są składnikiem flory skóry wywodzącym się z wielu źródeł. Potwierdza to fakt, że w środowisku szpitala wykrywane są liczne wielolekooporne szczepy tych bakterii (15). Można
więc sądzić, że w badanym przez nas modelu to one mogły selekcjonować się na skórze
leczonych antybiotykami pacjentów, a następnie być z łatwością przekazywane bezpośrednio lub pośrednio na skórę lekarzy i tam użyczać genów oporności ściślej związanym
ze skórą maczugowcom. Dobler i Braveny izolowali z cewnika wielolekooporny szczep
C. macginleyi obok gronkowców koagulazoujemnych o podobnym profilu oporności (4).
Hipoteza o przekazywaniu genów lekooporności gronkowców maczugowcom wymaga
jednak potwierdzenia na poziomie molekularnym.
Dane przedstawione w tej pracy wskazują, że nabywanie oporności przez szczepy rezydujące na skórze personelu medycznego jest procesem powolnym. Wielolekooporność,
pięciokrotnie częstsza, niż w grupie szczepów izolowanych od osób bez kontaktu ze szpitalem, dotyczyła 14,9% szczepów. Ich obecność wskazała proces, który może się pogłębiać.
Badano osoby młode, o niedługim stażu pracy w szpitalu. Z czasem ich skóra może stanowić
znaczące źródło wielolekoopornych pałeczek. W pracy wykazano także, że maczugowcami
najczęściej kumulującymi geny antybiotykooporności były Corynebacterium grupa CDC
G2, stanowiąc obok wskazywanych najczęściej w literaturze C. jeikeium, realne zagrożenie
jako czynnik etiologiczny oportunistycznych zakażeń szpitalnych wywoływanych przez
lipofilne maczugowce (20).
Nr 4
Lekowrażliwość Corynebacterium
365
A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk
INFLUENCE OF CONTACT WITH HOSPITAL ENVIRONMENT ON SENSITIVITY TO
ANTIBIOTICS OF LIPOPHILIC STRAINS OF CORYNEBACTERIUM RESIDING ON HUMAN
SKIN
SUMMARY
Sensitivity of two groups of lipophilic corynebacteria strains of different species, which form
stable residential flora on human skin, to therapeutically significant groups of antibiotic was compared.
Strains were isolated from people who did not have any contact with hospital environment, and from
doctors closely connected with hospital. It was shown that strains isolated from doctors, which were
in fact not under antibiotic pressure, were five times more multiresistant whilst at the same time being
resistant to antibiotics used only in hospital treatment.
PIŚMIENNICTWO
1. Ang LMN, Brown H. Corynebacterium accolens isolated from breast abscess: possible association
with granulomatous mastitis. J Clin Microbiol 2007; 45: 1666-8.
2. Balci I, Ekşi F, Bayram A. Coryneform bacteria isolated from blood cultures and their antibiotic
susceptibilities. J Int Med Res 2002; 30: 422-7.
3. Conejo MC, Martínez-Martínez L, Pascual Á i inni. Activities of ABT-773 against Listeria monocytogenes and coryneform bacteria of clinical interest. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:
1403-6.
4. Dobler G, Braveny I. Highly resistant Corynebacterium macginleyi as cause of intravenous
catheter-related infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003; 22: 72-3.
5. Funke G, von Graevenitz A, Clarridge III JE, Bernard KA. Clinical microbiology of coryneform
bacteria. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 125-59.
6. Garcia-Bravo M, Aguado JM, Morales JM, Noriega AR. Influence of external factors in resistance
of Corynebacterium urealyticum to antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 1996;
40: 497-9.
7. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypta K i inni. Rekomendacje doboru testów do oznaczania
wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Post Mikrobiol 2005; 44: 175-92.
8. Jorgensen JH. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently
Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline. M45-A
9. Jung K, Brauner A, Kühn I i inni. Variation of coagulase-negative staphylococci in the skin flora
of healthy individuals during one year. Microb Ecol Health Dis 1998; 10: 85-90 124.
10. Kaźmierczak AK, Szarapińska-Kwaszewska JK, Szewczyk EM. Opportunistic coryneform organisms – residents of human skin. Pol J Microbiol 2005; 54: 27-35.
11. Kaźmierczak AK, Szewczyk EM. Bacteria forming a resident flora of the skin as a potential source
of opportunistic infections. Pol J Microbiol 2004; 53: 249-55.
12. Martínez-Martínez L, Pascual Á, Suárez AI, Perea EJ. In-vitro activity of levofloxacin, ofloxacin
and d-ofloxacin against coryneform bacteria and Listeria monocytogenes. J Antimicrob Chemother
1999; 43: 27-32.
13. Mikucka A. Znaczenie Corynebacterium sp. w zakażeniach szpitalnych. Post Mikrobiol 2003;
42: 403-18.
14. Rosato AE, Lee BS, Nash KA. Inducible macrolide resistance in Corynebacterium jeikeium.
Antimicrob. Agents Chemother 2001; 45: 1982-9.
366
A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk
Nr 4
15. Szewczyk EM, Piotrowski A, Różalska M. Predominant staphylococci in the intensive care unit
of a paediatric hospital. J Hosp Infect 2000; 45: 145-54.
16. Tancrède C. Role of human microflora in health and disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
1992; 11: 1012-5.
17. Tauch A, Kaiser O, Hain T i inni. Complete genome sequence and analysis of the multiresistant
nosocomial pathogen Corynebacterium jeikeium K411, a lipid-requiring bacterium of the human
skin flora. J Bacteriol 2005; 187: 4671-82.
18. Tauch A, Krieft S, Kalinowski J, Pühler A. The 51,409-bp R-plasmid pTP10 from the multiresistant clinical isolate Corynebacterium striatum M82B is composed of DNA segments initially
identified in soil bacteria and in plant, animal, and human pathogens. Mol Gen Genet 2000; 263:
1-11.
19. Weiss K, Laverdière M, Rivest R. Comparison of antimicrobial susceptibilities of Corynebacterium
species by broth microdilution and disk diffusion methods. Antimicrob Agents Chemother 1996;
40: 930-3.
20. Williams DY, Selepak ST, Gill VJ. Identification of clinical isolates of nondiphtherial Corynebacterium species and their antibiotic susceptibility patterns. Diagn Microbiol Infect Dis 1993; 17:
23-8.
Otrzymano: 18 IX 2009
Adres Autora: 90-235 Łódź, ul. Pomorska 137, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej
e-mail: [email protected], tel. (42)6779300