WYSTĘPOWANIE PRZECIWCIAŁ DLA ANTYGENÓW

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 375 - 379
Waldemar Rastawicki, Natalia Rokosz, Marek Jagielski
WYSTĘPOWANIE PRZECIWCIAŁ DLA ANTYGENÓW
MYCOPLASMA PNEUMONIAE W POSZCZEGÓLNYCH
PODKLASACH IgG W PRZEBIEGU MYKOPLAZMOZY
Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski
Przeanalizowano poziom przeciwciał podklas IgG1-IgG4 dla antygenu komórkowego M. pneumoniae w 138 próbkach surowicy uzyskanych od osób
z mykoplazmozą. Przeciwciała podklasy IgG1 wykryto w 47 (34,1%) próbkach, podklasy IgG2 w 42 (30,4%) i podklasy IgG3 w 58 (42,0%) próbkach
surowicy. W żadnej próbce surowicy nie wykryto obecności przeciwciał
podklasy IgG4 w mianie diagnostycznie znamiennym. Wykazano również,
że poziom przeciwciał podklasy IgG2 dla M. pneumoniae narasta wraz
z wiekiem badanych osób chorych.
Przeciwciała klasy IgG stanowią około 70-75% całkowitej puli wszystkich immunoglobulin człowieka. Immunoglobuliny te składają się z dwóch łańcuchów lekkich i dwóch
identycznych ciężkich łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniem dwusiarczkowym. Na podstawie typu łańcucha ciężkiego klasę IgG podzielono na 4 podklasy (IgG1IgG4). Występują one odpowiednio w następujących proporcjach: IgG1 – 66%, IgG2-23%,
IgG3-7%, IgG4-4% (5, 15).
Stężenie przeciwciał należących do poszczególnych podklas IgG zależy od wieku osoby
badanej. Poziom przeciwciał otrzymanych od matki obniża się po urodzeniu i osiąga minimum w 3-6 miesiącu życia. W największym stopniu przechodzą przez łożysko przeciwciała
podklasy IgG1 i IgG3, w najmniejszym zaś przeciwciała podklasy IgG2. Synteza każdej
podklasy jest regulowana niezależnie. Stężenie przeciwciał podklasy IgG1 i IgG3 występujące u osób dorosłych osiągane jest już w młodym wieku, natomiast stężenie przeciwciał
podklasy IgG2 i IgG4 znacznie później (2, 5).
Dotychczasowa analiza humoralnej odpowiedzi w przebiegu mykoplazmozy u ludzi
ograniczała się do poszukiwania swoistych przeciwciał w klasie immunoglobulin A, G i M
(1, 4, 8, 9, 16, 17). W dostępnej literaturze istnieją jedynie sporadyczne doniesienia na temat badania przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG swoistych dla M. pneumoniae
(13). Mając jednakże na uwadze fakt, że w przypadku zakażeń wywoływanych przez inne
bakteryjne patogeny analiza taka została przeprowadzona (3, 10, 12, 14, 18), celem zaplanowanych badań była ocena częstości występowania i poziomu przeciwciał należących do
poszczególnych podklas IgG w przebiegu mykoplazmozy u ludzi.
376
W. Rastawicki, N. Rokosz, M. Jagielski
Nr 4
MATERIAŁ I METODY
P r ó b k i s u r o w i c y. Przedmiotem badań było 185 próbek surowicy uzyskanych
od osób z zakażeniem układu oddechowego podejrzanych klinicznie o mykoplazmozę,
w których we wcześniej wykonanych badaniach stwierdzono odczynem wiązania dopełniacza podwyższony poziom swoistych przeciwciał. Dodatkowo, w celu wyznaczenia wartości diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał, przebadano 65 próbek surowicy
krwiodawców.
O d c z y n E L I S A . Badania przeprowadzono pośrednim testem immunoenzymatycznym ELISA zgodnie z procedurą podaną uprzednio (10). Jako antygenu użyto homogennej
zawiesiny fragmentów błon komórkowych uzyskanych po rozbiciu ultradźwiękami komórek
szczepu FH M. pneumoniae (6). W odczynie ELISA posłużono się mysimi, monoklonalnymi
przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową (Invitrogen) dla ludzkich immunoglobulin IgG, IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. W wyniku wstępnego miareczkowania przyjęto
rozcieńczenie koniugatu anty-IgG 1/2000, natomiast rozcieńczenie koniugatów anty-IgG1,
IgG2, IgG3 i IgG4 1/500. Wartość diagnostycznie znamiennego poziomu przeciwciał wyliczano ze średniej arytmetycznej wartości miana przeciwciał oznaczonych w 65 próbkach
surowicy osób klinicznie zdrowych powiększonej o 2 odchylenia standardowe.
S t a t y s t y c z n e o p r a c o w a n i e w y n i k ó w. Istotność różnic w częstości wykrywania
przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG w próbkach surowicy osób chorych oceniano
testem niezależności chi-kwadrat z zastosowaniem poprawki Yatesa. Za znamienne statystycznie przyjęto różnice, gdzie poziomy istotności p były mniejsze od 0,05 (p<0,05).
WYNIKI I DYSKUSJA
Przeprowadzone badania wykazały, że przeciwciała klasy IgG w mianie diagnostycznie
znamiennym wykryto w 138 (74,6%) próbkach surowicy. Dalsze poszukiwanie przeciwciał
w poszczególnych podklasach IgG ograniczono więc wyłącznie do tej grupy próbek surowicy.
I tak, przeciwciała podklasy IgG1 stwierdzono w 47 (34,1%) próbkach, podklasy IgG2 w 42
(30,4%) i podklasy IgG3 w 58 (42,0%) próbkach surowicy. W żadnej próbce surowicy nie
wykazano obecności przeciwciał podklasy IgG4 w mianie diagnostycznie znamiennym.
Nie wykazano statystycznie istotnych różnic (p>0,05) w częstości występowania
przeciwciał należących do podklas IgG1 i IgG3 w zależności od wieku badanych osób. Nie
mniej jednak częstość występowania przeciwciał należących do tych podklas była najwyższa
u najmłodszych dzieci, w wieku do 5 roku życia i nieznacznie malała wraz ze wzrostem
wieku badanych osób. Zasadniczą, statystycznie istotną różnicę w częstości występowania
przeciwciał w zależności od wieku badanych osób zauważano natomiast przy oznaczaniu
poziomu przeciwciał podklasy IgG2. Przeciwciał tych nie stwierdzano u dzieci do 5 roku
życia. U dzieci starszych, młodzieży a zwłaszcza u osób dorosłych przeciwciała te występowały już w znacznym odsetku (Ryc. 1)
Analiza odpowiedzi humoralnej w przebiegu mykoplazmozy, przeprowadzona na podstawie badania próbek surowicy uzyskanych dwukrotnie od tych samych osób, nie wykazała
istotnych różnic w poziomie przeciwciał należących do poszczególnych podklas w różnych
okresach choroby. Niemniej, u niektórych osób chorych poziom przeciwciał klasy IgG3
Ryc.1. Częstość występowania przeciwciał podklas IG1-IgG4 dla antygenu M. pneumoniae w
próbkach surowicy osób z mykoplazmozą należących do różnych grup wiekowych.
Nr 4
Podklasy IgG w zakażeniach M. pneumoniae
IgG1
Odsetek wyników dodatnich
60
IgG2
IgG3
377
IgG4
50
40
30
20
10
0
0-5 lat
(20 osób)
Ryc.1. 6-10 lat
(57 osób)
11-20 lat
(43 osoby)
>20 lat
(12 osób)
Częstość występowania przeciwciał podklas IG1-IgG4 dla antygenu M. pneumoniae
w próbkach surowicy osób z mykoplazmozą należących do różnych grup wiekowych.
spadał szybciej niż poziom przeciwciał IgG1. Zjawisko to związane jest prawdopodobnie
ze znacznie krótszym okresem półtrwania przeciwciał IgG3 (7 dni) w stosunku do okresu
półtrwania przeciwciał IgG1 (21 dni).
Nie wykazano również statystycznie istotnych różnic (p>0,05) w częstości występowania
przeciwciał należących do poszczególnych podklas w zależności od płci badanych osób.
W dostępnej literaturze brakuje danych dotyczących występowania przeciwciał
w poszczególnych podklasach IgG dla antygenów M. pneumoniae przeprowadzonych na
reprezentatywnej grupie osób z mykoplazmozą. Jak dotąd jedynym dostępnym doniesieniem
jest praca Seggev i wsp. (13), w której autorzy opisali wyniki poszukiwania odczynem western-immunoblotting obecności przeciwciał dla białek M. pneumoniae w poszczególnych
podklasach IgG jedynie w kilkunastu wybranych próbkach surowicy uzyskanych w różnych
fazach choroby. Według tych autorów w surowicy osób z mykoplazmozą dominują przeciwciała podklasy IgG1 i IgG3 (odpowiednio obecne ogółem w 73,7% oraz 68,8% wszystkich
zbadanych próbek surowicy), rzadziej natomiast stwierdza się przeciwciała podklasy IG2
i IgG4 (odpowiednio obecne w 41,2% i 31,3% próbek surowicy).
W badaniach własnych posługiwano się antygenem komórkowym, uzyskanym po
rozbiciu ultradźwiękami zawiesiny komórek szczepu FH M. pneumoniae. Antygen ten zawiera wszystkie składowe błony cytoplazmatycznej, na które składają się zarówno białka
jak i lipidy, decydujące o jego pełnej aktywności antygenowej. Wyniki badań laboratoryjnych wykazały, że antygen ten można z powodzeniem stosować w rutynowej diagnostyce
mykoplazmozy prowadzonej zarówno przy użyciu wiązania dopełniacza jak i odczynu
ELISA (6, 7, 9, 11). Tak więc, wydaje się, że różnice w procentowym udziale przeciwciał
z poszczególnych podklas IgG w odpowiedzi humoralnej u osób z mykoplazmozą, obserwowane w pracy Seggev i wsp. (13) i w badaniach własnych, mogą wynikać z odmiennych
właściwości preparatów antygenowych użytych w obydwu doświadczeniach.
378
W. Rastawicki, N. Rokosz, M. Jagielski
Nr 4
Istnieje wiele publikacji dotyczących kinetyki przeciwciał klasy IgG w przebiegu
mykoplazmozy. Jacobs i wsp. (4) stwierdzili, że w próbkach surowicy pochodzących od
noworodków do 10 dnia życia można wykryć, nabyte od matki w okresie życia płodowego,
mykoplazmowe przeciwciała w klasie IgG. U dzieci do 3 roku życia przeciwciała klasy IgG
występowały w niskich mianach, u dzieci starszych następował wyraźny wzrost poziomu,
który u osób dorosłych pomiędzy 20 i 30 rokiem życia osiągał najwyższe wartości. Podobne
spostrzeżenia dotyczące poziomu mykoplazmowych przeciwciał klasy IgG u osób z różnych
grup wieku zostały poczynione również przez innych autorów (1, 8, 9, 16)
Poziom przeciwciał w poszczególnych podklasach IgG w przebiegu mykoplazmozy nie
był dotychczas analizowany a dane dotyczące kinetyki przeciwciał IgG1-IgG4 pochodzą
z badań przeprowadzonych w innych zakażeniach bakteryjnych (3, 10, 12, 14, 18). Wynika
z nich, że stężenie przeciwciał poszczególnych podklas IgG zależne jest od rodzaju antygenu,
drogi zakażenia i od czasu jaki upłynął od ekspozycji na antygen. Wykazano, że bakteryjne
antygeny białkowe stymulują wytwarzanie głównie przeciwciał podklasy IgG1 a w mniejszym stopniu IgG3, IgG4 i IgG2 natomiast antygeny polisacharydowe przede wszystkim
przeciwciała podklasy IgG2 oraz znacznie słabiej IgG1. U dzieci charakterystyczne jest
niskie powinowactwo przeciwciał podklasy IgG1 do antygenów węglowodanowych, jednak w miarę dojrzewania układu immunologicznego przeciwciała te zastępowane są przez
IgG2 o wyższym powinowactwie. Przedłużona ekspozycja na antygeny może prowadzić
do wzrostu stężenia w surowicy chorego przeciwciał podklasy IgG4.
W. R a s ta w ic k i, N. Rokosz , M. Ja gi e l ski
SUBCLASS DISTRIBUTION OF HUMAN IGG ANTIBODIES TO MYCOPLASMA
PNEUMONIAE IN THE COURSE OF MYCOPLASMOSIS
SUMMARY
The prevalence of human IgG1-IgG4 to sonicated antigen of M. pneumoniae in the 138 sera
obtained from patients with mycoplasmosis was analysed. Antibodies of IgG1 were diagnosed in 47
(34,1%), IgG2 in 42 (30,4%) and IgG3 subclass in 58 (42,0%) serum samples. The concentration of
IgG4 was below detection level. Generally, the frequency of occurrence of IgG2 antibodies increased
with age reaching its peak among adults. On the other hand IgG1 and IgG3 for M. pneumoniae were
diagnosed more often in serum samples obtained from children than from adults. We did not find any
essential changes in the pattern of IgG subclass during the course of infection however it seems that
the level of IgG3 antibodies decreased faster than IgG1 which may be caused by the fact that the IgG3
antibodies have a much shorter half-life in comparison to the IgG1.
PIŚMIENNICTWO
1. Dussaix E, Slim A, Tournier P. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and complement fixation test for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. J Clin Pathol 1983;
36:228-32.
2. Gregorek H, Imielska D, Gornicki J i inni. Development of IgG subclasses in healthy polish
children. Arch Immunol Ther Exp 1994; 42:377-82.
Nr 4
Podklasy IgG w zakażeniach M. pneumoniae
379
3. Islam D, Wretlind B, Ryd M i inni. Immunoglobulin subclass distribution and dynamics of Shigella-specific antibody responses in serum and stool samples in shigellosis. Infect Immun 1995;
63:2054-61.
4. Jacobs E, Bennewitz A, Bredt W. Reaction pattern of human anti-Mycoplasma pneumoniae antibodies in enzyme-linked immunosorbent assays and immunoblotting. J Clin Microbiol 1986;
23:517-22.
5. Jakóbisiak M. Przeciwciała, str. 25-33. W: Immunologia. Red. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek.
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2005.
6. Kałużewski S. Ocena przydatności wybranych testów serologicznych w diagnostyce zakażeń
wywołanych przez Mycoplasma pneumoniae. I. Antygen do odczynu wiązania dopełniacza. Med
Dośw Mikrobiol 1972; 24: 333-42.
7. Kałużewski S, Rastawicki W, Namysł E. Ocena efektywności diagnostyki testem ELISA zakażeń
wywoływanych przez Mycoplasma pneumoniae w Polsce, w latach 2006-2008. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: 183-90.
8. Mizutani H, Mizutani H. Immunologic responses in patients with Mycoplasma pneumoniae infections. Am Rev Respi Dis 1983; 127:175-9.
9. Rastawicki W. Ocena odczynami tradycyjnymi i nowej generacji odpowiedzi humoralnej na
antygeny Mycoplasma pneumoniae w przebiegu naturalnego zakażenia u ludzi. Praca doktorska
PZH, Warszawa 1994.
10. Rastawicki W, Jakubczak A. Serum immunoglobulin IgG subclass distribution of antibody
responses to Yop proteins and lipopolysaccharide of Yersinia enterocolitica in patients with
yersiniosis. Pol J Microbiol 2007; 56:233-8.
11. Rastawicki W, Rokosz N, Jagielski M. Ocena przydatności wybranych antygenów Mycoplasma
pneumoniae do serodiagnostyki mykoplazmozy. Med Dośw Mikrobiol 2009; 61:175-82.
12. Schenk K, Michaelsen TE. IgG subclass distribution of serum antibodies against lipopolysaccharide from Bacteroides gingivalis in periodontal health and disease. Acta Pathol Microbiol Scand
1987; 95: 41-6.
13. Seggev JS, Sedmak GV, Kurup VP. Isotype-specific antibody response to acute Mycoplasma
pneumoniae infection. Ann Allergy Asthma Immunol 1996; 77:67-73.
14. Shackelford PG, Granoff DM, Nelson SJ. Subclass distribution of human antibodies to Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide. J Immunol 1987; 138:587-92.
15. Spiegelberg HL. Biological activities of immunoglobulins of different classes and subclasses.
Adv Immunol 1974; 303:178-82.
16. Uldum SA, Jensen JS, Sondergård-Andersen J, Lind K. Enzyme immunoassay for detection of
immunoglobulin M (IgM) and IgG antibodies to Mycoplasma pneumoniae. J Clin Microbiol
1992; 30:1198-204.
17. Vikerfors T, Brodin G, Grandien M i inni. Detection of specific IgM antibodies fort he diagnosis
of Mycoplasma pneumoniae infections: a clinical evaluation. Scand J Infect Dis 1988; 20:60110.
18. Widhe M, Ekerfelt C, Forsberg P. IgG subclasses in Lyme borreliosis: A study of specific IgG
subclass distribution in an interferon-g-predominated disease. Scand J Immunol 1998; 47:57581.
Otrzymano: 16 XI 2009 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH w Warszawie