Replikacja wirusa HCV w linii komórkowej Huh–7.5 HCV replication

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: 239 - 244
Replikacja wirusa HCV w linii komórkowej Huh–7.5
HCV replication in Huh–7.5 cell line
Marcin Komorowski, Agnieszka Kołakowska, Paulina Godzik, Kazimierz Madaliński
Pracownia Immunopatologii Zakażeń Hepatotropowych
Zakładu Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego
Zakładu Higieny w Warszawie
Zakażenie wirusem zapalenia wątroby C (HCV) stanowi globalny problem
zdrowotny. Prowadzone są intensywne badania nad stworzeniem komórkowego modelu replikacji wirusa. Opracowany konstrukt HCV o genotypie 2a
(JFH1 – Japanese Fulminant Hepatitis) badano in vitro początkowo w linii
komórkowej Huh–7. Ze względu na niską infekcyjność JFH1 w stosunku do
linii Huh–7 zastąpiono ją linią komórkową Huh–7.5. Celem bieżącej pracy
było zbadanie dynamiki zmian ilości wirusowego RNA w hodowli Huh–7.5.
Słowa kluczowe: wirus zapalenia wątroby C, linia komórkowa Huh - 7.5, replikacja wirusowa
ABSTRACT
Introduction. Infection with hepatitis C virus is a serious worldwide health problem. Since
its discovery in 1989, the development of a cell culture system for HCV has been a major
goal for scientists worldwide. In 2005 the first tissue culture that led to the production of
HCV particles (2a genotype) has been created. The aim of the study was to determine viral
RNA level in an infectious HCV cell culture system.
Methods. Huh-7.5 cell line was infected with the JFH1 (Japanese Fulminant Hepatitis) RNA
by lipofection. The level of HCV RNA was measured in supernatant of the cell culture by
Real-Time PCR method.
Results. HCV RNA was detected in the supernatant of Huh-7.5 cell line infected with the
use of JFH1 RNA and lipofectamin. The maximal level of HCV RNA (3.69x109 copies/ml)
was detected 96h after transfection. After about 30 days of transfection, HCV RNA was on
the stable level (107–108).
Conclusions. Huh-7.5 cell line infected with HCV form a robust cell culture model of
HCV infection. HCV replicates on high levels in Huh-7.5, which is the crucial event for
the investigation of new antivirals in in vitro model.
Key words: hepatitis C virus, Huh – 7.5 cell line, viral replication
240
M. Komorowski i inni
Nr 3
WSTĘP
Wirus zapalenia wątroby C (HCV) stanowi poważny problem zdrowotny. Według danych
Światowej Organizacji Zdrowia na świecie jest do 170 mln osób zakażonych HCV (9). U ponad 80% z nich dochodzi do zakażenia przewlekłego, które może prowadzić do włóknienia,
marskości wątroby, a nawet raka wątrobowo-komórkowego (7). Dotychczas nie udało się opracować szczepionki przeciwko HCV, a obowiązujący standard leczenia przeciwwirusowego nie
daje satysfakcjonujących rezultatów. Obecnie prowadzi się badania nad potencjalnymi lekami
przeciwko HCV. Podstawowymi komórkami gospodarza, w których dochodzi do replikacji
HCV są hepatocyty. Wirus dostaje się do wnętrza komórki poprzez pH–zależną endocytozę,
poprzedzoną połączeniem wirusowej glikoproteiny E2 z komórkowym receptorem CD81.
Uwolnione w ten sposób wirusowe RNA służy jako mRNA w procesie translacji poliproteiny.
Następnie poliproteina przetwarzana jest przez komórkowe i wirusowe białka, w wyniku czego
powstaje 10 białek wirusa. Wśród nich można wyróżnić białka strukturalne: białko rdzenia,
dwie glikoproteiny (E1 i E2), p7 oraz białka niestrukturalne: NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A
i NS5B. Białka niestrukturalne odpowiadają za translację oraz replikację wirusowego RNA.
Replikacja HCV rozpoczyna się od syntezy komplementarnej ujemnej nici RNA, która służy
jako matryca do produkcji wielu dodatnich nici genomowego RNA. Niekompletne są dane
na temat składania wirusa i uwalniania cząstek wirusowych z komórki. Sugeruje się, iż wirus
opuszcza komórkę poprzez konstytutywny szlak wydzielniczy.
Od roku 1989, w którym zidentyfikowano HCV, prowadzone są intensywne badania nad
stworzeniem komórkowego modelu replikacji wirusa. Badania nad replikacją wirusa HCV
z wykorzystaniem konstruktów zawierających pełnogenomowe cDNA były prowadzone
przez wielu badaczy, jednak nie dawały wystarczająco dobrych rezultatów (5,10). Replikacja
HCV zachodziła na bardzo niskim poziomie i nie udało się zaadoptować hodowli komórkowej tak, aby otrzymać jej wysoki poziom (4). Dopiero w 2005 roku pojawiło się pierwsze
doniesienie o stworzeniu systemu replikacyjnego HCV in vitro. Do stworzenia konstruktu
HCV wykorzystano RNA wirusa o genotypie 2a (JFH1– Japanese Fulminant Hepatitis),
wyizolowane od japońskiego pacjenta z piorunującym zapaleniem wątroby. Przepisany na
cDNA materiał genetyczny wirusa wklonowano w plazmid, a następnie przeprowadzono
transkrypcję in vitro. Otrzymany produkt wprowadzono do linii komórkowej Huh–7 (hepatoma cell line). Po 24 godzinach wykryto pełnogonomowe RNA wirusa w komórkach,
zaś po 72 - białko rdzeniowe oraz białka niestrukturalne wirusa. Cząstki wirusowe wykryto
w supernatancie znad hodowli metodą mikroskopii elektronowej. Były one zakaźne zarówno
w stosunku do niezakażonej linii Huh–7, jak i szympansów (8). Ograniczeniem opisanego
systemu był niski poziom infekcyjności JFH1 w stosunku do linii Huh–7. Wyższą infekcyjność osiągnięto w linii Huh–7.5 (2).
System JFH1 stanowi dotychczas jedyny system replikacji wirusa HCV, w którym
produkowane są infekcyjne cząstki wirusowe. Pomimo wielu prób nie udało się stworzyć
systemu replikacji opartego na materiale genetycznym genotypu 1. Naukowcom udało się
jedynie skonstruować subgenomowe replikony HCV genotypu 1, które nie kodują białek
strukturalnych wirusa, a zatem nie są zdolne do produkcji cząstek wirusowych (1,3,6).
Zarówno system replikacji wirusa HCV oparty na JFH1, jak i subgenomowe replikony są powszechnie wykorzystywane w badaniach nad nowymi potencjalnymi związkami
przeciwwirusowymi.
Nr 3
Replikacja wirusa HCV
241
Celem pracy było otrzymanie stabilnego komórkowego modelu replikacji HCV in vitro
oraz zbadanie dynamiki zmian ilości wirusowego RNA w hodowli Huh–7.5 .
MATERIAŁ I METODY
Konstrukt HCV oraz transkrypcja. Otrzymano plazmid pJFH1 zawierający
sekwencję HCV cDNA pod kontrolą promotora T7 (dzięki uprzejmości dr Takaji Wakita,
Toray Industries and Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research). Plazmid
został zlinearyzowany na końcu 3’ HCV cDNA przy pomocy enzymu restrykcyjnego XbaI.
Oczyszczone DNA posłużyło jako matryca w transkrypcji in vitro (TranscriptAid T7 High
Yield Transcription Kit, Fermentas).
Hodowla komórkowa. Linię komórkową Huh–7.5 otrzymano dzięki uprzejmości
dr Małgorzaty Rychłowskiej z Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Zarówno niezakażoną, jak i transfekowaną HCV hodowlę komórkową prowadzono w podłożu DMEM
uzupełnionym 10% FCS oraz antybiotykami w 37°C i 5% CO2. Komórki pasażowano 2
razy w tygodniu w stosunku 1:6.
Transfekcj a HCV RNA. Otrzymane w wyniku transkrypcji in vitro RNA JFH1
wprowadzono do komórek Huh–7.5 metodą lipofekcji (Lipofectamin 2000, Invitrogen). Na
jedną dobę przed planowanym eksperymentem zakładano hodowlę Huh–7.5 w probówkach
ze skosem o pojemności 2ml. Każda probówka zawierała 4x105 komórek zawieszonych w 2
ml medium hodowlanego DMEM uzupełnionym 10% FCS bez antybiotyków. Do lipofekcji
podłoże wzrostowe zastępowano podłożem OPTI–MEM, a następnie dodawano mieszaninę
RNA z lipofektyną (LIPO) oraz mieszaniny kontrolne (RNA:LIPO) w proporcjach podanych w podpisie pod ryciną 1. Tak założone hodowle inkubowano w cieplarce z dostępem
CO2 w temp. 37°C przez kolejną dobę. Po tym czasie zmieniono OPTI–MEM na podłoże
wzrostowe DMEM.
Oznaczanie HCV RNA w hodowli komórkowej. Obecność RNA wirusa
oznaczono w supernatancie znad hodowli jakościową oraz ilościową metodą łańcuchowej
reakcji polimerazy (PCR). Badaniu poddano 21 supernatantów, gromadzonych systematycznie podczas kolejnych pasaży prowadzonej hodowli. Pierwsze oznaczenie wykonano po 24
godzinach od lipofekcji metodą Nested PCR, w celu potwierdzenia efektywności zakażenia
hodowli. Badanie kolejnych supernatantów metodą Real–Time PCR (HCV Real–TM Quant,
Sacace Biotechnologies) pozwoliło ocenić dynamikę zmian ilości HCV RNA w zakażonej
linii komórkowej.
WYNIKI
W wyniku przeprowadzonej transfekcji linii komórkowej Huh–7.5 przy zastosowaniu
transkryptu JFH1 oraz lipofektyny otrzymano hodowlę Huh–7.5 zakażoną genotypem 2a
wirusa HCV. Wirusowe RNA w supernatancie hodowli wykryto wyłącznie w próbkach,
do zakażenia których użyto JFH1 oraz lipofektyny. Obraz elektroforetycznego rozdziału
produktów PCR uzyskanych z supernatantów znad hodowli Huh–7.5 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji prezentuje rycina 1.
242
Ryc. 1
M. Komorowski i inni
Nr 3
Elektroforegram obrazujący rozdział produktów reakcji PCR wykonanej z użyciem supernatanó z nad hodowli Huh_7.5 24h po przeprowadzonej lipofekcji. Ścieżka „K-” - kontrola
negatywna PCR; Ścieżka „K+” - kontrola pozytywna PCR; Ścieżki oznaczone symbolami
od 2A do 4D - produkty PCR uzyskane dla różnych wariantów lipofekcji: 2A-1µg RNA
+ 0µl LIPO; 1A-0µg RNA + 0µl LIPO; 3A-2.5µg RNA + 0µl LIPO; 4A-5µg RNA + 0µl
LIPO; 1B-0µg RNA + 2µl LIPO; 2B-1µg RNA + 2 µl LIPO; 1C-0µg RNA + 5µl LIPO;
2C-1µg RNA + 5µl LIPO; 3C-2.5µg RNA + 5µl LIPO; 4C-5µg RNA + 5µl LIPO; 1D-0µg
RNA + 10µl LIPO; 2D-1µg RNA + 10µl LIPO; 3D-2.5µg RNA + 10µl LIPO; 4D-5µg RNA
+ 10µl LIPO
Badanie dynamiki zmian ilości wirusowego RNA zaplanowano dla dwóch wariantów
zakażonej hodowli Huh–7.5: 3D–2.5µg RNA + 10µl LIPO oraz 4D–5µg RNA + 10µl
LIPO. W związku z zanikiem replikacji wirusa HCV w wariancie 3D podczas kolejnych
pasaży, dalsze analizy przeprowadzono dla wariantu 4D linii komórkowej Huh–7.5.
Hodowlę prowadzono przez okres 3 miesięcy (21 pasaży) według warunków opisanych
w materiałach i metodach. Najwięcej wirusowego RNA (3.69x109 kopii/ml) wykryto w 96
godzin po przeprowadzonej transfekcji (przed pierwszym pasażem). W kolejnych pasażach
ilość RNA spadała, uzyskując najniższą wartość przed siódmym pasażem (2.14x105). Przez
kolejne 4 pasaże ilość RNA wzrastała, a następnie utrzymywała się na stałym poziomie
(107–108) aż do końca prowadzenia hodowli. Wyniki reakcji Real-Time PCR przedstawia
rycina 2. Hodowlę zakończono na 21 pasażu ze względu na rozpoczynającą się degenerację
komórek. Hodowlę Huh–7.5 zakażoną HCV umieszczono w banku hodowli komórkowych
Zakładu Wirusologii NIZP–PZH. Obecność materiału genetycznego wirusa wykryto w linii
komórkowej Huh–7.5 prowadzonej po rozmrożeniu. Ilość materiału genetycznego wirusa
określono na 107 kopii RNA/ml.
Ryc. 2 Dynamika zmian ilości wirusowego RNA w trakcie prowadzenia hodowli (21 pasaży).
Nr 3
Replikacja wirusa HCV
243
DYSKUSJA
Przeprowadzone badania pozwoliły uzyskać stabilny model komórkowy hodowli wirusa HCV w linii Huh–7.5, w którym wirus ulega replikacji. Wyboru hodowli komórkowej
dokonano w oparciu o dostępne dane literaturowe. Linię tę uzyskano poprzez traktowanie
interferonem linii Huh–7. Stworzenie Huh–7.5 dało możliwość prowadzenia badań z użyciem
pełnogenomowego replikonu HCV. Linia ta była bardziej podatna na zakażenie JFH1 niż
Huh–7, co zwiększyło jej przydatność jako modelu replikacji wirusa in vitro (2).
W obecnym badaniu linię komórkową Huh–7.5 transfekowano wirusem JFH1 przy użyciu lipofektyny. Uzyskane wyniki potwierdziły konieczność jej zastosowania. W próbkach,
w których podjęto próbę zakażenia samym wirusowym RNA, nie wykryto obecności materiału genetycznego HCV w badanym supernatancie. Użycie lipofektyny oraz wirusowego
RNA dało pozytywny rezultat transfekcji, niezależnie od ilości obu składników. Istotne jest
natomiast zastosowanie odpowiedniej proporcji transkryptu JFH1 do lipofektyny. Według
danych literaturowych właściwy stosunek RNA:LIPO wynosi 1:2, co potwierdzają bieżące
badania (11).
Zakażoną genotypem 2a HCV hodowlę Huh–7.5 prowadzono przez okres 3 miesięcy.
Tak długi czas utrzymania niezdegenerowanej linii komórkowej niewątpliwie stanowi zaletę
przedstawionego modelu badawczego. Stwarza on możliwość prowadzenia czasochłonnych
eksperymentów in vitro. Dodatkowym atutem, mającym wpływ na osiągnięcie powtarzalnych wyników, jest wysoki i stały poziom materiału genetycznego HCV, utrzymujący się
w hodowli. Wspomniane cechy modelu badawczego zaobserwowano w bieżącym badaniu.
Stworzony w oparciu o linię Huh–7.5 model badawczy może stać się dobrym narzędziem służącym testowaniu potencjalnych leków przeciwko HCV, które mogą wpływać
bezpośrednio na jego replikację. Zaobserwowany w badaniach Wakita i wsp. oraz potwierdzony w bieżącym doświadczeniu, powtarzalny schemat dynamiki zmian ilości RNA HCV
w hodowli daje możliwość uzyskania porównywalnych warunków badania inhibitorów
wirusa in vitro (8).
WNIOSKI
• Linia Huh–7.5 zakażona wirusem HCV stanowi stabilny model komórkowy, w którym
wirus ulega replikacji.
• Zbadany model komórkowy hodowli HCV charakteryzuje się określoną dynamiką zmian
ilości materiału genetycznego wirusa.
• Opisany model komórkowy może stanowić podstawę badań nad potencjalnymi lekami
hamującymi replikację HCV.
Podziękowanie: Praca została wykonana w ramach realizacji grantu MNiSW NN405
132539 (2010–2013)
Acknowledgement: This study was supported by grant NN405 132539 from the Ministry
of Science and Higher Education (2010–2013)
244
M. Komorowski i inni
Nr 3
PIŚMIENNICTWO
1. Blight K, Kolykhalov A, Rice C. Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.
Science 2000; 290: 1972–4
2. Blight K, McKeating J, Rice C. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis
C virus RNA replication. J Virol 2002; 76: 13001–14
3. Blight KJ, McKeating JA, Marcotrigiano J i inni. Efficient replication of hepatitis C virus genotype
1a RNAs in cell culture. J Virol 2003; 77: 3181–90
4. Godzik P. System replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) in vitro. Post Mikrobiol
2009; 48: 207–12
5. Kolykhalov A, Agapov E, Blight K i inni. Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation
with transcribed RNA. Science 1997; 277: 570–4
6. Lohmann V, Korner F, Koch JO i inni. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in
a hepatoma cell line. Science 1999; 285: 110-3
7. Saito I, Miyamura T, Ohbayashi A i inni. Hepatitis C virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 6547–9
8. Wakita T, Pietschmann T, Kato T i inni. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture
from a cloned viral genome. Nat Med 2005; 11: 791–6
9. WHO. Hepatitis C – global prevalence (update). Wkly Epidemiol Rec 2000; 75: 18–9
10. Yanagi M, Purcell R, Emerson S i inni. Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee. Proc Natl
Acad Sci USA 1997; 94: 8738–43
11. Zhong J, Gastaminza P, Cheng G i inni. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl
Acad Sci USA 2005; 102: 9294-9
Otrzymano: 11 IX 2012 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Pracownia Immunopatologii Zakażeń
Hepatotropowych Zakładu Wirusologii NIZP-PZH w Warszawie