Metody badania potencjalnych inhibitorów wirusa zapalenia

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2013, 65: 275 - 283
Metody badania potencjalnych inhibitorów wirusa zapalenia wątroby
typu C w linii komórkowej Huh-7.5
Methods of testing potential inhibitors of hepatitis C in Huh-7.5 cell line
Agnieszka Kołakowska, Paulina Godzik, Kazimierz Madaliński
Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego
– Państwowego Zakładu Higieny
Zgodnie z szacunkami Światowej Organizacji Zdrowia z powodu chorób
wątroby wywołanych wirusem HCV umiera rocznie 350 000 osób. Dotychczas nie udało się stworzyć skutecznej szczepionki przeciwko wirusowi HCV,
a dostępne obecnie terapie nie dają 100% pewności wyleczenia. Dlatego od
wielu lat na całym świecie prowadzone są intensywne badania nad poszukiwaniem nowych leków o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym. Celem
pracy było opracowanie metodyki badania aktywności oraz cytotoksyczności
potencjalnych inhibitorów helikazy HCV w systemie produkującym wirusowe cząstki potomne.
Słowa kluczowe: wirus zapalenia wątroby C, inhibitory replikacji HCV, linia komórkowa
Huh–7.5
ABSTRACT
Introduction: According to WHO reports, there are 130-170 million persons chronically infected with hepatitis C virus on a global scale. There is no effective vaccine against HCV, and
the current standard of chronic hepatitis C therapy has limited efficiency and undesirable side
effects. Current studies are focused on searching for a new therapeutic agents, which are specifically targeted against the virus. The aim of the study was to develop a methodology for testing
the activity and cytotoxicity of potential helicase inhibitors (derivatives of anthracycline
antibiotics) in Huh-7.5 cell line infected with HCV.
Methods: The Huh-7.5 cell line was infected with the JFH1 (Japanese Fulminant Hepatitis)
RNA by lipofection. The cytotoxicity of anthracycline antibiotics was measured by Cell
Proliferation Kit II (XTT), after 1, 2, 3, 4 and 24 hours after incubation with tetrazolium salt
XTT. The activity of anthracycline antibiotics was examined by Real-Time PCR method.
Results: The study allowed to optimize the conditions of cytotoxicity and activity studies
of anthracycline antibiotics.
276
A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński
Nr 4
Conclusions: Huh-7.5 cell line infected with HCV is a robust cell culture model for screening
new antivirals against HCV.
Key words: hepatitis C virus, inhibitors of HCV replication, Huh – 7.5 cell line
WSTĘP
Zgodnie z szacunkami Światowej Organizacji Zdrowia zakażenie wirusem zapalenia
wątroby typu C (HCV) dotyczy 130-170 mln osób na całym świecie. Rocznie z powodu
chorób wątroby wywołanych wirusem zapalenia wątroby typu C umiera 350 000 osób (19).
U około 60-80% dochodzi do zakażenia przewlekłego, które zwykle w początkowym okresie
przechodzi bezobjawowo lub skąpo-objawowo (11). Natomiast, w dłuższej perspektywie,
choroba prowadzi do poważnych następstw, takich jak: włóknienie i marskość wątroby
oraz rak wątrobowo-komórkowy. Dodatkowo zakażenie HCV może prowadzić również
do licznych pozawątrobowych objawów oraz chorób. Zjawiskiem najczęściej wiązanym
z zakażeniem HCV jest krioglobulinemia, której objawem klinicznym jest rozpowszechnione
zapalenie naczyń prowadzące do zapalenia kłębuszków nerkowych i polineuropatii (8).
Udział zakażenia HCV zaobserwowano również w takich chorobach, jak: zapalenie tarczycy, liszaj płaski, porfiria późna skórna, samoistna trombocytopenia i pierwotny zespół
Sjögrena (5, 7, 12, 10, 15).
Wirus HCV został zidentyfikowany w 1989 roku i zaklasyfikowany do rodziny Flaviviridae (4). Jego materiał genetyczny występuje pod postacią pojedynczej nici RNA o dodatniej
polarności. RNA zawiera pojedynczą otwartą ramkę odczytu (ang. Open Reading Frame,
ORF) kodującą poliproteinę, z której na skutek kotranslacyjnego oraz potranslacyjnego
działania komórkowych i wirusowych proteaz powstają 4 białka strukturalne oraz 6 białek
niestrukturalnych. Genom wirusa, poza konserwatywnymi regionami UTR, różni się pomiędzy poszczególnymi izolatami wirusa. Na podstawie tych rozbieżności można wyróżnić
6 głównych genotypów oraz liczne podtypy wirusa. Zróżnicowanie to wpływa na szereg
cech wirusa. Genotyp 1 jest najbardziej rozpowszechniony, częściej prowadzi do poważnych
uszkodzeń wątroby oraz nowotworów, jak również pacjenci zakażeni tym genotypem gorzej
odpowiadają na leczenie niż zakażeni genotypami 2 i 3.
Ze względu na dużą zmienność HCV, nie udało się jak dotąd wytworzyć skutecznej
szczepionki przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu C (wzw C). Do niedawna
standardem w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu C była terapia dwulekowa
(pegylowany interferon alfa oraz rybawiryna). Skuteczność tej terapii jest niezadowalająca
i w przypadku najbardziej rozpowszechnionego genotypu 1 wynosi około 42–54% (9,16).
Dlatego od wielu lat na całym świecie prowadzone są intensywne badania nad poszukiwaniem nowych leków o bezpośrednim działaniu przeciwwirusowym. W wyniku tych prac
w 2011 roku Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration, FDA) zatwierdziła możliwość stosowania inhibitorów proteazy wirusa HCV:
boceprewiru i telaprewiru w terapii skojarzonej z interferonem i rybawiryną u dorosłych
pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby typu C wywołanym przez genotyp 1. Stosowanie trójlekowej terapii w znaczny sposób zwiększyło trwałą odpowiedź wirusologiczną
Nr 4
Aktywność inhibitorów helikazy HCV
277
(ang. Sustained Virological Response, SVR) (1). W Polsce telaprewir oraz boceprewir
stosowane są od maja 2013 roku w ramach programów lekowych.
Pomimo znacznego zwiększenia skuteczności terapii trójlekowej z zastosowaniem
telaprewiru i boceprwewiru, wciąż istnieje potrzeba poszukiwania nowych leków o bezpośrednim działaniu antywirusowym. Obecnie stosowana terapia trójlekowa nadal daje około
75% wyleczalności. Jednocześnie część pacjentów nie może ukończyć leczenia z powodu
niepożądanych skutków prowadzonej terapii.
Niewątpliwą trudność w badaniu nowych substancji o działaniu inhibicyjnym w stosunku do wirusa HCV stanowi brak zwierzęcego modelu badawczego. Jedynymi zwierzętami,
u których dochodzi do zakażenia są szympansy. Ze względów etycznych oraz finansowych nie
jest możliwe prowadzenie na szeroką skalę badań nad nowymi lekami u tej grupy zwierząt.
W celu prowadzenia badań nad patogenezą zakażeń wirusem HCV wytworzono transgeniczne
myszy posiadające chimeryczne wątroby zbudowane z ludzkich i mysich hepatocytów (17).
Model ten pozwolił na uzyskanie stabilnej replikacji wirusa HCV, natomiast nie dał możliwości badania związków o potencjalnym działaniu antywirusowym, ponieważ pozbawiony
był prawidłowo funkcjonującego układu odpornościowego. Pod koniec lat 90-tych XX wieku
przeprowadzono pierwsze próby utworzenia hodowli wirusa HCV. Trudność polegała na tym,
iż RNA wirusa izolowane bezpośrednio od osób zakażonych nie było infekcyjne w stosunku do
hodowli komórkowych. Przełomowym wydarzeniem było utworzenie przez Lohmanna i wsp.
subgenomowych replikonów HCV (JFH1– Japanese Fulminant Hepatitis), które replikowały
się w linii komórkowej Huh–7 (hepatoma cell line) (14). Replikon ten pozbawiony był RNA
kodującego białka strukturalne, dlatego system nie dawał możliwości tworzenia cząstek wirusowych. W 2005 roku opublikowano pierwszą pracę na temat utworzenia systemu replikacji
HCV in vitro, w którym powstawały zakaźne cząstki wirusowe (18).
Obecnie powszechnie wykorzystuje się systemy hodowli in vitro oparte na subgenomowych replikonach do badania nowych potencjalnych związków przeciwwirusowych. Celem
prezentowanej pracy było opracowanie metodyki badania aktywności oraz cytotoksyczności
potencjalnych inhibitorów (pochodnych antybiotyków antracyklinowych) HCV w systemie
produkującym wirusowe cząstki potomne.
MATERIAŁ I METODY
Hodowla komórkowa. Oznaczenie aktywności inhibicyjnej pochodnej antybiotyku
antracyklinowego oraz badanie jej cytotoksyczności przeprowadzono w linii komórkowej
Huh–7.5, otrzymanej dzięki uprzejmości Pracowni Biologii Molekularnej Wirusów Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego. Hodowlę prowadzono w podłożu wzrostowym DMEM wzbogaconym 10% FCS, mieszaniną aminokwasów oraz antybiotyków i inkubowano w cieplarce
z dostępem dwutlenku węgla (37°C; 5% CO2).
Transfekcja linii komórkowej Huh–7.5. W celu badania aktywności inhibicyjnej pochodnej antracyklinowej przeprowadzono transfekcję RNA wirusa HCV do linii
komórkowej Huh–7.5 z zastosowaniem związków lipidowych (Lipofectamin 2000, Invitrogen). HCV RNA użyte do lipofekcji powstało w wyniku linearyzacji plazmidu pJFH1
(otrzymany dzięki uprzejmości Toray Industries and Tokyo Metropolitan Organization for
Medical Research) przy pomocy enzymu restrykcyjnego XbaI, oczyszczenia otrzymane-
278
A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński
Nr 4
go DNA oraz jego transkrypcji in vitro (TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit,
Fermentas). Otrzymany transkrypt RNA wraz z lipofektaminą (mieszanina transfekcyjna
w proporcji 2:1) wprowadzono do komórek Huh–7.5, wykorzystując zjawisko tworzenia
między kwasami nukleinowymi a związkami lipidowymi lipopleksów oraz ich ułatwionej
endocytozy. Proces lipofekcji przeprowadzono w 24–godzinnej hodowli komórkowej
o gęstości wyjściowej 4x104 kom/dołek, założonej na płytce 96-dołkowej. Do lipofekcji
zastosowano podłoże bez antybiotyków OPTI–MEM. Po 18 godzinach inkubacji w 37°C
i środowisku 5% CO2 podłoże OPTI–MEM wymieniono na podłoże wzrostowe DMEM.
Badany związek. Zbadano aktywność pochodnej antybiotyku antracyklinowego
(otrzymanej dzięki uprzejmości prof. Ireny Oszczapowicz oraz dr Małgorzaty Łukawskiej
z Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków), dla której stwierdzono wcześniej w fluorometrycznym teście aktywności helikazy (2,3) wysoką aktywność przeciwko helikazie RNA
wirusa HCV (białku NS3).
Badanie cytotoksyczności związków. Oznaczenie cytotoksyczności pochodnej
antracyklinowej wykonano w niezakażonej linii komórkowej Huh–7.5 z użyciem kolorymetrycznego testu Cell Proliferation Kit II (Roche). Zastosowany test badania cytotoksyczności
polega na spektofotometrycznym odczycie barwnej reakcji redukcji soli tetrazoliowych
XTT w formazan pod wpływem działania komórkowej dehydrogenazy mitochondrialnej.
Na 1 dobę przed rozpoczęciem doświadczenia założono hodowlę komórkową w 96-dołkowej płytce z inokulum zawierającego 4x105 kom/ml, rozpipetowując po 100µl wyjściowej
zawiesiny komórek na dołek. Po 24h do hodowli dodano po 100µl/dołek uprzednio przygotowanego roztworu badanej substancji, tak aby uzyskać końcowy zakres stężeń 40–5000nM.
Każdy roztwór naniesiono na płytkę hodowlaną w trzech powtórzeniach. Jako kontrolę
zastosowano niezakażoną hodowlę komórkową Huh–7.5, do której nie dodano badanej
substancji. Cytotoksyczność zbadano w trzeciej dobie od dodania pochodnej antracyklinowej do hodowli komórkowej, w obecności soli tetrazoliowych– XTT. W celu optymalizacji
warunków eksperymentu, odczyt cytotoksyczności przeprowadzono po1-, 2-, 3-, 4- i 24godzinnej inkubacji z XTT. Zastosowanie testu XTT pozwoliło na oznaczenie toksyczności
związków na podstawie oceny aktywności metabolizmu mitochondrialnego przetrwałych
komórek linii Huh–7.5. Wynik otrzymano poprzez pomiar absorbancji (λ 450-500nm),
której wartość była proporcjonalna do ilości żywych i sprawnych metabolicznie komórek.
Badanie aktywności związku. Oznaczanie aktywności pochodnej antracyklinowej
przeprowadzono na podstawie zmian ilości RNA wirusa w zakażonej hodowli Huh–7.5 metodą Real-Time PCR (HCV Real-TM Quant, Sacace Biotechnologies). W celu opracowania
optymalnej metody oznaczenia aktywności związków, badaną substancję w końcowym
zakresie stężeń 20–400nM dodawano do zakażonej hodowli zaraz po lipofekcji, 4 godziny
oraz 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji, a HCV RNA oznaczano po trzech dobach od
dodania związku. RNA wirusa izolowano z supernatantu oraz komórek Huh–7.5 poddanych
wcześniej 3 cyklom zamrażania i rozmrażania. Jako kontrolę zastosowano zakażoną hodowlę
Huh–7.5, do której nie dodano związku hamującego replikację wirusa HCV.
WYNIKI
Badanie cytotoksyczności przeprowadzono metodą kolorymetryczną w niezakażonej
hodowli Huh–7.5, aby uniknąć oddziaływania wirusa na metabolizm komórek. Zgodnie
Nr 4
279
Aktywność inhibitorów helikazy HCV
z zaleceniami producenta testu XTT Cell Proliferation Assay Kit oraz wcześniejszymi doświadczeniami zdobytymi w Zakładzie Wirusologii NIZP–PZH, przeprowadzono badanie
cytotoksyczności dokonując pomiarów po 1, 2, 3, 4 oraz 24 godzinach od dodania XTT
do hodowli (tabela I). Po analizie wyników za najbardziej optymalny czas inkubacji z solami tetrazoliowymi, uznano przedział między drugą a czwartą godziną po dodaniu XTT.
W przypadku 24 godzin od dodania XTT do hodowli, wartości absorbancji przekroczyły
skalę odczytu.
Tabela I. Średnia wartość absorbancji w teście cytotoksyczności, w zależności od czasu inkubacji.
Czas inkubacji
Stężenie
1 godzina
2 godziny
3 godziny
4 godziny
24 godziny
badanego
Średnia absorbancji
związku
x
40 nM
0,86
80 nM
0,82
160 nM
0,80
400 nM
0,78
1000 nM
0,61
2000 nM
0,44
5000 nM
0,14
Kontrola
1,02
Out – wartość poza skalą odczytu
x
1,57
1,48
1,54
1,40
1,06
0,75
0,19
1,67
x
1,83
1,92
1,97
1,82
1,42
0,98
0,22
1,91
x
2,02
2,54
2,06
2,11
1,52
1,10
0,27
2,05
x
out
out
out
out
out
2,91
2,88
out
Badanie aktywności związku wykonano w hodowli Huh–7.5 zakażonej genotypem 2a
wirusa HCV. Zakażoną linię komórkową uzyskano poprzez jej transfekcję z zastosowaniem
transkryptu JFH1 oraz lipofektyny (13). Lipofekcję prowadzono w linii komórkowej, założonej na 96-dołkowej płytce z zawiesiny komórkowej zawierającej 4x105 kom/ml. Wartość
inokulum wyznaczono doświadczalnie, tak aby uzyskać 80% pokrycie powierzchni dołka
monowarstwą komórek po 24 godzinach prowadzenia hodowli komórkowej. Lipofekcję
wykonywano każdorazowo przed dodaniem badanych substancji do hodowli. W celu optymalizacji metody badania aktywności związków, badaną substancję dodawano do zakażonej
hodowli zaraz po lipofekcji, 4 godziny oraz 24 godziny po przeprowadzonej lipofekcji.
Efektem dodania związku tuż po lipofekcji oraz 4 godziny po zakażeniu wirusem HCV
była całkowita degradacja komórek, co wykluczyło dalsze badania. W przypadku dodania
związków po 24 h nie zaobserwowano zmian degeneracyjnych w obrębie komórek.
Badanie aktywności związków przeprowadzono z wykorzystaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym. Początkowo nasilenie replikacji, mierzone ilością kopii RNA, oceniono
w supernatantach zebranych znad hodowli, do której dodano badanego związku. Następnie
dla porównania, oznaczenie wykonano w pełnej hodowli (w supernatantach i komórkach).
Badając obecność materiału genetycznego wirusa w supernatantach w połączeniu z komórkami uzyskano kilkukrotnie wyższą wartość RNA niż w samych supernatantach. Wyniki
pomiarów przedstawia tabela II.
280
A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński
Nr 4
Tabela II. Liczba kopii HCV RNA uzyskana w wyniku reakcji Real–Time PCR, przeprowadzonej
w 4 dobie inkubacji z potencjalnym inhibitorem HCV.
Liczba kopii HCV w 1 ml mieszaniny reakcyjnej (kopie/ml)
Lp. Numer próbki
Pełna hodowla
Supernatant
(supernatant i komórki)
1
Kontrola 0 nM
5,42 x 104
7,74 x 1014
4
2
Kontrola 0 nM
1,11 x 10
1,80 x 1014
5
3
Kontrola 0 nM
3,22 x 10
2,88 x 1014
4
4
20 nM
1,07 x 10
2,05 x 1014
4
5
20 nM
2,23 x 10
6,49 x 1014
4
6
20 nM
7,27 x 10
2,59 x 1014
3
7
40 nM
5,65 x 10
5,96 x 1014
4
8
40 nM
7,52 x 10
4,83 x 1014
4
9
40 nM
2,84 x 10
4,19 x 1014
4
10 80 nM
3,10 x 10
2,32 x 1014
5
11 80 nM
1,82 x 10
1,72 x 1014
4
12 80 nM
1,05 x 10
2,59 x 1014
4
13 160 nM
3,39 x 10
2,91 x 1014
4
14 160 nM
2,84 x 10
2,44 x 1014
3
15 160 nM
5,15 x 10
2,07 x 1014
4
16 200 nM
1,79 x 10
2,60 x 1014
3
17 200 nM
1,26 x 10
2,46 x 1014
5
18 200 nM
2,54 x 10
2,14 x 1014
3
19 400 nM
1,09 x 10
2,57 x 1014
4
20 400 nM
1,14 x 10
1,68 x 1014
4
21 400 nM
1,05 x 10
1,83 x 1014
DYSKUSJA
Jedne z pierwszych metod badania cytotoksyczności wymagały zastosowania materiałów
radioaktywnych oraz kosztownej aparatury, a procedury ich wykonania były skomplikowane
i długotrwałe. W latach 80-tych XX wieku po raz pierwszy wykorzystano testy kolorymetryczne w badaniach cytotoksyczności in vitro. Zastosowane w metodzie sole tetrazoliowe,
będące akceptorami elektronów, są przekształcane do barwnych związków formazanowych
przez żywe komórki. Obecnie dostępne są sole tetrazoliowe pierwszej (MTT) i drugiej (XTT)
generacji. W celu ustalenia optymalnej metody badania cytotoksyczności potencjalnych
inhibitorów wirusa HCV w hodowli Huh–7.5 wybrano test kolorymetryczny XTT, w którym
sole tetrazoliowe redukowane są do rozpuszczalnych w środowisku wodnym związków
formazanowych. W teście MTT formazany wytrącają się w postaci kryształów, co utrudnia
procedurę badania (6).
Zasada działania testu kolorymetrycznego opiera się na wprost proporcjonalnej zależności pomiędzy ilością żywych komórek, a ich aktywnością metaboliczną. Dodana do hodowli
komórkowej żółta sól tetrazoliowa redukowana jest przez dehydrogenazę mitochondrialną
żywych komórek do pomarańczowego formazanu. Natężenie zabarwienia mierzone spek-
Nr 4
Aktywność inhibitorów helikazy HCV
281
trofotometrycznie koreluje z ilością wytworzonego formazanu, co oznacza, że im większa
ilość żywych komórek, tym wyższa wartość absorbancji. Zastosowanie testu do badania
cytotoksyczności w konkretnej linii komórkowej należy poprzedzić doświadczeniem wstępnym, w celu optymalizacji warunków eksperymentu. Poszczególne linie komórkowe różnią
się aktywnością metabolizmu komórkowego, a co za tym idzie aktywnością dehydrogenazy
mitochondrialnej. Należy w sposób doświadczalny ustalić wpływ czasu inkubacji na intensywność redukcji soli XTT. Zgodnie z instrukcją producenta testu odczyt należy wykonać
po 4-24 godzinach od dodania XTT. W celu optymalizacji badania cytotoksyczności w linii
Huh-7.5 dokonano pomiaru absorbancji po 1, 2, 3, 4 i 24 godzinach. Po godzinnej inkubacji
uzyskano niską wartość absorbancji dla kontroli, co może świadczyć o niedostatecznym
czasie inkubacji hodowli z solami tetrazoliowymi. Zadowalające wyniki uzyskano po 2-,
3- i 4-godzinnej inkubacji. W tych przypadkach zaobserwowano spadek absorbancji skorelowany ze wzrostem stężenia badanego związku, jak również uzyskano zbliżone wartości dla
trójkowych powtórzeń. Pomiar wartości absorbancji po 24-godzinnej inkubacji dla kontroli
i stężeń w zakresie 40-1000nM był niemożliwy ze względu na uzyskanie wyników poza
skalą odczytu. XTT był metabolizowany aż 24 godziny przez żywe komórki, a wysokie
wartości absorbancji były spowodowane kumulacją związków formazanowych.
W celu opracowania odpowiedniej metodyki oznaczenia aktywności pochodnych
antracyklinowych metodą lipofekcji, przygotowano hodowlę Huh–7.5 zakażoną wirusem
HCV. Transfekcję wykonywano każdorazowo przed dodaniem badanych substancji do
hodowli, ponieważ próby bankowania zakażonej linii Huh–7.5 prowadziły do degradacji
komórek. Optymalizacja badania polegała na doświadczalnym ustaleniu odpowiedniego
czasu dodania potencjalnego inhibitora do hodowli zakażonej HCV. W tym celu badaną
substancję dodawano do zakażonej hodowli zaraz po lipofekcji, 4 godziny oraz 24 godziny
po przeprowadzonej lipofekcji. Tylko w przypadku dodania związku po 24 h nie zaobserwowano degradacji komórek. Dodanie pochodnej antybiotyku antracyklinowego w czasie
lipofekcji oraz 4 godziny po niej prowadziło do śmierci komórek, prawdopodobnie na
skutek nadmiernego osłabienia błon komórkowych, poprzez jednoczesne działanie lipofektyny i antybiotyku. W zakażonej HCV hodowli Huh–7.5 potomne wiriony są częściowo
wydzielane do supernatantu, część z nich natomiast pozostaje w komórkach. Wykonano
ilościowe badanie HCV RNA metodą Real–Time PCR w podłożu znad hodowli. Następnie
dla porównania, oznaczenie powtórzono w pełnej hodowli (w supernatancie i komórkach).
Wykazano, że ilość RNA izolowana z supernatantów jest znacząco niższa od ilości w pełnej
hodowli. Dodatkowo zaobserwowano różnice w ilości RNA w supernatantach w kolejnych
powtórzeniach, co może wynikać z nierównomiernego uwalniania wirusa do podłoża. Natomiast w przypadku badania w pełnej hodowli uzyskano powtarzalność wyników. Ten wariant
uznano za najbardziej efektywny w badaniu aktywności związków przeciwwirusowych.
Podsumowując, przeprowadzenie badań in vitro w kierunku aktywności oraz cytotoksyczności związków przeciwwirusowych wymaga optymalizacji warunków eksperymentu.
WNIOSKI
1. Badanie cytotoksyczności wymaga przeprowadzenia wstępnych doświadczeń, umożliwiających opracowanie optymalnych warunków eksperymentu.
282
A. Kołakowska, P. Godzik, K. Madaliński
Nr 4
2. W przypadku linii komórkowej Huh–7.5 odpowiedni czas inkubacji z solami tetrazoliowymi (XTT) w badaniu cytotoksyczności to 2-4 godziny.
3. Dodanie pochodnej antybiotyku antracyklinowego do hodowli Huh–7.5 w czasie lipofekcji, jak również 4 godziny po zakażeniu wirusem HCV powoduje degradację komórek.
4. Badanie aktywności związków skierowanych przeciwko wirusowi HCV in vitro, metodą
Real-Time PCR należy wykonywać w pełnej hodowli (komórki i supernatant).
Podziękowanie: Praca została wykonana w ramach realizacji grantu MNiSW NN405
132539 (2010–2014)
Acknowledgement: This study was supported by grant NN405 132539 from the Ministry
of Science and Higher Education (2010–2014)
PIŚMIENNICTWO
1. Buckman B, Kossen K, Nicholas J i inni. NS3 protease non-covalent inhibitors. W: Hepatitis C.
Antiviral drug discovery and development. Red. Tan S-L, He Y. Norfolk (UK): Caister Academic
Press; 2011, 194-214.
2. Boguszewska-Chachulska AM, Krawczyk M, Stankiewicz A i inni. Directfluorometric measurement of hepatitis C virus helicase activity. FEBS Letters 2004; 567(2-3): 253-8.
3. Boguszewska-Chachulska AM, Krawczyk M, Najda A i inni. Searching for a new anti-HCV therapy:
Synthesis and properties of tropolone derivatives. 2006. Biochem.Biophys. Res. Commun. 341,
641-7.
4. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ i inni. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A,
non-B viral hepatitis genome. Science 1989; 244: 359-62.
5. Clifford BD, Donahue D, Smith L i inni. High prevalence of serological markers of autoimmunity
in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 1995; 21: 613-9.
6. Dzitko K, Dudzińska D, Grzybowski M i inni. Ocena przydatności testów kolorymetrycznych
MTT i XTT do badań prowadzonych in vitro na tachyzoitach Toxoplasmagondii. Wiadomości
Paratytologiczne 2010; 56: 145-52.
7. Fargion S, Piperno A, Cappellini MD i inni. Hepatitis C virus and porphyria cutaneatarda: evidence of a strong association. Hepatology 1992; 16: 1322-6.
8. Ferri C, Sebastiani M, Giuggioli D i inni. Mixed cryoglobulinemia: demographic, clinical, and
serologic features and survival in 231 patients. Semin Arthritis Rheum. 2004; 33: 355-74.
9. Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR i inni. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis
C virus infection. N Engl J Med. 2002; 347: 975-82.
10. Hadziyannis S. Nonhepatic manifestations and combined diseases in HCV infection. Digest Dis
Sci 41, No. 12 (1996 suppl): 63-74.
11. Halota W, Flisiak R, Boroń-Kaczmarska A i inni. Standardy leczenia wirusowych zapaleń wątroby
typu C Rekomendacje Polskiej Grupy ekspertów HCV – 2011. Przegl Epidemiol 2012; 66: 83-8.
12. Jabłońska J, Ząbek J, Madaliński K, Godzik P. Pozawątrobowe objawy zakażenia wirusem
zapalenia wątroby typu C. Reumatologia 2009; 47: 364-7.
13. Komorowski M, Godzik P, Kołakowska A i inni. Replikacja wirusa HCV w linii komórkowej
Huh-7.5. Med. Dośw. Mikrobiol. 2012; 64: 239-44.
14. Lohmann V, Korner F, Koch JO i inni. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in
a hepatoma cell line. Science 1999; 285: 110-3.
15. Madaliński K, Godzik P, Zimmermann-Górska I i inni. Anty-HCV oraz HCV-RNA u chorych
z pierwotnym zespołem Sjögrena. Przegl Epidemiol 2009; 63: 299-304.
Nr 4
Aktywność inhibitorów helikazy HCV
283
16. Manns M, McHutchison J, Gordon S i inni. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with
interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial.
The Lancet 2001; 358: 958-65.
17. Mercer D, Schiller D, Elliott J i inni. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human
livers. Nat Med 2001; 7: 921-33.
18. Wakita T, Pietschmann T, Kato T i inni. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture
from cloned viral genome. Nat Med 2005; 11: 791-6.
19. WHO. Hepatitis C. Wkly. Epidemiol. Rec 2011; 86: 445-7.
Otrzymano: 31 X 2013 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Wirusologii Narodowego Instytutu
Zdrowia Publicznego – Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie