Konserwatywna struktura C-końcowego fragmentu białka MyfA

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2010, 62: 331 - 336
Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński
Konserwatywna struktura C-końcowego fragmentu białka MyfA
stanowiącego strukturalny element fimbrii Myf u chorobotwórczych
pałeczek Yersinia enterocolitica
Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Państwowego
Zakładu Higieny w Warszawie
Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski
Badano polimorfizm fragmentu genu myfA kodującgo C-końcową część
białka MyfA stanowiącego główną podjednostkę strukturalną fimbrii Myf
u chorobotwórczych pałeczek Yersinia enterocolitica. Badaniami objęto
reprezentatywne szczepy europejskiej (bioserotyp: 2/O9; 3/O5,27; 4/O3)
i amerykańskiej (bioserotyp 1B/O8) linii filogenetycznej Y. enterocolitica. U wszystkich badanych szczepów stwierdzono jednakową sekwencję
aminokwasową C-końcowego fragmentu MyfA. Może to przemawiać za
stwierdzeniem, że fimbrie Myf pełnią bardzo ważną rolę u chorobotwórczych
pałeczek Y. enterocolitica, już od etapu poprzedzającego rozdział szczepów
tego gatunku na dwie główne linie filogenetyczne.
Fimbrie Myf (Mucoid Yersinia factor), będące powierzchniowym antygenem pałeczek
Yersinia enterocolitica, uznawane są za prawdopodobny czynnik chorobotwórczości tych
bakterii (1, 3, 7). Dotychczas ukazało się jedynie kilka publikacji opisujących budowę
fimbrii Myf, strukturę operonów odpowiedzialnych za ich biosyntezę oraz prawdopodobny mechanizm ich działania. Jednakże, gen myfA związany z wytwarzaniem tych fimbrii
wykrywany był u szczepów pałeczek Y. enterocolitica uznawanych za chorobotwórcze dla
człowieka i uważany jest za przydatny marker zjadliwości tych drobnoustrojów (4, 6, 8, 15).
Fimbrie Myf są białkowym homopolimerem złożonym z podjednostek o względnej
masie cząsteczkowej 21 kDa. Ich długość może osiągać około 2µm (1). W procesie biogenezy fimbrialnej struktury Myf uczestniczy 5 genów zlokalizowanych na chromosomie:
myfA, myfB, myfC, myfE i myfF, tworzących wspólny locus myf. Gen myfA (480 pz) koduje
białko MyfA, stanowiące główną podjednostkę budulcową tych fimbrii (1, 7, 8). Produktem
ekspresji genu myfA jest polipeptyd o długości 159 aa. Regulacja ekspresji antygenu Myf zachodzi na poziomie transkrypcji i jest zależna od fizykochemicznych parametrów środowiska
(37oC i pH 6) (8, 12). Badania przeprowadzone z zastosowaniem rekombinowanego białka
MyfA wykazały u osób ze zdiagnozowaną jersiniozą obecność swoistych przeciwciał dla
antygenu MyfA. Może to wskazywać, że fimbrie Myf są wytwarzane w procesie zakażenia
pałeczkami Y. enterocolitica i indukują swoistą odpowiedź humoralną u osób z klinicznie
332
K. Zacharczuk, R. Gierczyński
Nr 4
i bakteriologicznie potwierdzoną jersiniozą (13). Pozostałe geny występujące w locus myf
odpowiadają za wytwarzanie peryplazmatycznego białka opiekuńczego (MyfB), białka
błony zewnętrznej (MyfC) oraz regulatorowych białek: MyfE i MyfF (1).
Według piśmiennictwa antygen Myf oraz struktura fibrylarna CS3 enterotoksynogennych
pałeczek E. coli wykazują strukturalne podobieństwo (7). Wskazywać to może na udział
fimbrii Myf w kolonizacji jelita poprzez zwiększenie adhezyjnych zdolności bakterii do
komórek nabłonka jelitowego. Dodatkowo, oddziaływanie pomiędzy powierzchnią komórki
bakteryjnej a komórkami organizmu gospodarza prawdopodobnie stanowi sygnał aktywujący
sekrecję termostabilnej enterotoksyny YstA (1, 8). Ponadto, główne białko strukturalne MyfA
charakteryzuje się wysoką homologią sekwencji aminokwasowej (44%) do białka PsaA,
stanowiącego podjednostkę fimrbii pH6 pałeczek dżumy (8, 10, 12). Uważa się, że podobieństwo białka MyfA do CS3 i PsaA może wskazywać, że fimbrie Myf mogą wykazywać
podobne właściwości biologiczne. Na tej podstawie Iriarte i Cornelis (8) oraz Lindler i wsp.
(10) wskazują, iż obecność antygenu Myf zapewnia pałeczkom Y. enterocolitica ochronę
przed fagocytozą po uwolnieniu z wnętrza makrofagów.
Jak już wspomniano, gen myfA, odpowiedzialny za wytwarzanie podjednostki strukturalnej fimbrii Myf był wykrywany u zdecydowanej większości wyosobnionych z materiału
klinicznego pałeczek Y. enterocolitica należących do bioserotypu 4/O3, uznawanego za
dominujący czynnik etiologiczny zakażeń u ludzi (3, 6). Obecność tego genu stwierdzono
również u innych chorobotwórczych dla człowieka szczepów, należących zarówno do „amerykańskich” (1B/O8) jak i „europejskich” (2/O9; 3/O5,27) bioserotypów Y. enterocolitica
(1, 3, 4, 6). Jednakże obecność sekwencji nukleotydowej homologicznej do myfA stwierdzano także u niektórych szczepów należących do potencjalnie niepatogennego biotypu 1A.
Szczepy te wyosobniono od ludzi ze stanami biegunkowymi na terenie Indii i Europy (14,
15). Natomiast w Polsce były one izolowane od świń (9). Należy zwrócić jednak uwagę,
na fakt, iż wariant genu myfA pałeczek należących do biotypu 1A może znacząco różnić
się pod względem sekwencji nukleotydów od genu myfA chorobotwórczych szczepów Y.
enterocolitica (15).
W przedstawianej pracy oceniano stopień podobieństwa sekwencji nukleotydowych
genu myfA u chorobotwórczych szczepów Y. enterocolitica należących do różnych grup
serologicznych i linii filogenetycznych. Analizom poddano rejon C-końcowego fragmentu
genu myfA. Celem badań było sprawdzenie, czy gen ten jest w równym stopniu stabilizowany
przez dobór naturalny u amerykańskich jak i europejskich szczepów Y. enterocolitica oraz
ustalenie, czy analiza sekwencji nukleotydów tego genu może być przydatna jako metoda
w identyfikowaniu chorobotwórczych szczepów tego gatunku.
MATERIAŁ I METODY
Szczepy bakteryjne. W badaniach posłużono się szczepami pałeczek Y. enterocolitica
(n=10) z kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH, reprezentującymi bioserotypy: 2/O9
(96P; DM0193; DM0195), 3/O5,27 (0527), 4/O3 (305/96; DM0028; DM0047) i 1B/O8
(WAC; 89/07; 27/04). Preparaty genomowego DNA badanych szczepów przygotowywano
według procedury opisanej uprzednio Gierczyński i wsp. (2).
Nr 4
Białko MyfA Y. enterocolitica
333
Sekwencjonowanie DNA oraz analiza wyników. Analizie poddano sekwencję nukleotydową obu nici amplifikatu PCR (272 pz) uzyskanego ze staterami MfX (CAGATACACCTGCCTTCCATCT) i MfY (CTCGACATATTCCTCAACACGC) komplementarnymi
do genu myfA Y. enterocolitica oraz preparatem genomowego DNA poszczególnych szczepów
uzyskanym według metodyki podanej uprzednio (5). W łańcuchowej reakcji polimerazy
(PCR) użyto preparatu polimerazy DNA PAQ5000 firmy Stratagene, w ilości 0,75 jednostki
na reakcję, wraz z buforem reakcyjnym dostarczonym przez producenta. Reakcję chemiczną sekwencjonowania wykonywano przy użyciu zestawu BigDye cycle sequencing V3.1,
(Applied Biosystems, USA) zgodnie z zaleceniami producenta. Analizę wyników sekwencjonowania przeprowadzono z zastosowaniem programu FichTV (Geospiza, USA) i CLC
Sequence Viewer v.6.1. (CLC, Dania). Bazę danych GenBank przeszukiwano przy użyciu
programu BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
W trakcie przeprowadzonych badań określono nukleotydową sekwencję fragmentu
genu myfA o wielkości 256 pz, odpowiadającego odcinkowi 453-708 referencyjnej sekwencji locus myfABC (Z21953). Analizowany odcinek genu myfA, obejmował C-końcowy
fragment podjednostki strukturalnego białka MyfA. W przedstawionych badaniach ocenę
polimorfizmu genu myfA przeprowadzono w grupie chorobotwórczych szczepów Y. enterocolitica reprezentujących bioserotypy: 2/O9; 3/O5,27; 4/O3 i 1B/O8. Wykorzystując
informację o sekwencji nukleotydów obu nici amplifikatu PCR ustalono sekwencje consensus analizowanego odcinka genu myfA badanych szczepów. Stwierdzono, iż sekwencje
nukleotydowe analizowanego fragmentu genu myfA u wszystkich badanych w pracy
szczepów były identyczne. Następnie reprezentatywną dla badanych szczepów sekwencję
consensus porównywano z dostępnymi sekwencjami nukleotydowymi zdeponowanymi
w bazie danych GenBank, w tym z homologicznymi odcinkami genu myfA referencyjnych
sekwencji: Z21953, NC008800 i AY966879.
Przeprowadzone analizy porównawcze wykazały wysoki stopień podobieństwa (>93%)
sekwencji consensus genu myfA badanych szczepów z referencyjnymi sekwencjami Y. enterocolitica: (Z21953, NC008800 i AY966879) w obszarze kodującym C-końcową część białka
MyfA. Oprócz wymienionych powyżej sekwencji, w bazie GenBank odnaleziono jeszcze
tylko jedną, zlokalizowaną w genomie bakteriofaga ΦKZ (AF399011.1), która była homologiczna wyłącznie do krótkiego fragmentu (25 par zasad) sekwencji analizowanej w pracy.
Wyniki dalszych analiz wykazały, iż sekwencja consensus myfA jest identyczna z odcinkiem 453-708 pz sekwencji Z21953, jak również z odpowiadającą temu obszarowi
homologiczną sekwencją genomu szczepu 8081 Y. enterocolitica 1B/O8 (NC008800),
które to sekwencje odnoszą się do szczepów chorobotwórczych dla człowieka. Natomiast
porównawcza analiza sekwencji consensus genu myfA badanych szczepów z sekwencją
(AY966879) genu myfA potencjalnie chorobotwórczego szczepu Y. enterocolitica z biotypu
1A (15) wykazała obecność 18 mutacji punktowych. Mutacje te powodowały zmianę aż 13
aminokwasów w stosunku do sekwencji referencyjnej białka MyfA (Ryc.1.).
Udział fimbrii Myf w procesie patogenezy zakażeń chorobotwórczymi pałeczkami Y.
enterocolitica nie został dotychczas w pełni wyjaśniony ale wykazano, że białko struktu-
334
Ryc 1.
K. Zacharczuk, R. Gierczyński
Nr 4
Porównanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej C-końcowego odcinka białka MyfA
badanych szczepów (Consensus) z odpowiadającymi rejonami oczekiwanych sekwencji
aminokwasowych tego białka dla referencyjnych sekwencji genu myfA chorobotwórczych
pałeczek Y. enterocolitica (Z21953 i NC008800) oraz pałeczek tego gatunku należących do
biotypu 1A (AY966879). Analizowano fragment sekwencji aminokwasowej białka MyfA od
pozycji 75 do 159, przewidywany dla sekwencji nukleotydowej Z21953. Znak (-) oznacza
brak zmian względem sekwencji aminokwasów przedstawionej w wierszu oznaczonym
jako Z21953.
ralne tych fimbrii (MyfA) indukuje powstawanie swoistych przeciwciał u osób z klinicznie
potwierdzoną jersiniozą (13). Według piśmiennictwa antygen powierzchniowy Myf prawdopodobnie bierze udział w kolonizacji jelita cienkiego przez komórki bakteryjne oraz w ich
ochronie przed fagocytozą (1, 8). Uzyskane w przedstawianych badaniach wyniki wskazują
na silną stabilizację przez dobór naturalny C-końcowego odcinka białka strukturalnego MyfA
u chorobotwórczych dla człowieka pałeczek Y. enterocolitica. Należy zwrócić uwagę, że
zjawisko to stwierdzono zarówno u szczepów należących do europejskiej (2/O9; 3/O5,27;
4/O3) jak i amerykańskiej (1B/O8) linii filogenetycznej tych drobnoustrojów (odpowiednio
szczepy o średniej i wysokiej zjadliwości). Wysoki stopień konserwatywności sekwencji
aminokwasowej MyfA u obu linii filogenetycznych pałeczek Y. enterocolitica wskazuje na
ważną biologiczną funkcję tego białka, oraz może sugerować, że pełniło ono istotną rolę już
na etapie filogenezy poprzedzającym wyodrębnienie się tych linii. W tym świetle, szczególnie interesujące wydają się wyniki analizy in silico pokazujące, że jak dotychczas w bazie
GenBank nie zdeponowano sekwencji wykazujących choćby częściowe podobieństwo do
badanego odcinka genu myfA i jednocześnie pochodzących od innych mikroorganizmów
niż pałeczki Y. enterocolitica, z wyjątkiem wspomnianego krótkiego fragmentu faga ΦKZ.
W odróżnieniu od badanych szczepów, pałeczki Y. enterocolitica należące do biotypu
1A uznawane są powszechnie za niepatogenne, ze względu na brak klasycznych czynników
wirulencji, takich jak białka Yop oraz adhezyny YadA i Ail (6). Jednakże, pałeczki z biotypu
1A izoluje się niekiedy też od osób ze stanami biegunkowymi (14). Zdaniem niektórych
autorów obecność genu myfA u tych pałeczek może sugerować jego udział w determinowaniu
właściwości chorobotwórczych, gdyż gen ten rzadko wykrywany jest u pałeczek z biotypu
1A, izolowanych z próbek materiału ze środowiska (14, 15).
Wyniki analizy in silico wskazują, że sekwencja kodująca C-końcowy fragment MyfA
u pałeczek Y. enterocolitica 1A może być w znacznym stopniu zmieniona w stosunku do
aminokwasowej sekwencji tego białka wytwarzanego przez wysoce i średnio zjadliwe
Nr 4
Białko MyfA Y. enterocolitica
335
pałeczki tego gatunku. Wysoka konserwatywność C-końcowego fragmentu białka MyfA
u pałeczek Y. enterocolitica, wytwarzających czynniki wirulencji, warunkujące średnią
i wysoką chorobotwórczość może przemawiać za stwierdzeniem, że zmiany sekwencji
aminokwasów tego fragmentu mogą prowadzić do utraty jego biologicznej funkcji. W tym
świetle, wyniki przeprowadzonych badań mogą wskazywać, że gen myfA występujący u
pałeczek z biotypu 1A może kodować produkt pełniący inną funkcję niż produkt tego genu
u średnio i wysoce chorobotwórczych pałeczek Y. enterocolitica. Niestety, dotychczas sekwencję genu myfA określono tylko dla jednego izolatu Y. enterocolitica 1A (15). Ponadto nie
sprawdzono, czy gen ten ulegał ekspresji mimo, że u pałeczek Y. enterocolitica 1A opisano
już występowanie niefunkcjonalnego genu wirulencji (inv), związanego z wytwarzaniem
Inwazyny. Gen ten, był wykrywany w teście PCR u pałeczek z biotypu 1A, które nie były
jednak zdolne do adhezii do komórek nabłonkowych, gdyż kodujący Inwazynę gen inv nie
ulegał ekspresji (11).
Na podstawie wyników uzyskanych w przedstawianej pracy oraz danych piśmiennictwa,
można stwierdzić, że ze względu na zaobserwowaną znaczną częstość występowania genu
myfA u chorobotwórczych dla człowieka pałeczek Y. enterocolitica oraz wysoką konserwatywność sekwencji nukleotydowej, C-końcowy fragment genu myfA może być stosowany
jako jeden z molekularnych markerów wirulencji tych bakterii.
Zdolność pałeczek Y. enterocolitica do wywoływania zakażeń u ludzi jest wypadkową
działania wielu złożonych mechanizmów, uwarunkowanych posiadaniem ściśle określonego zestawu czynników wirulencji. W oparciu o wyniki badań własnych i innych autorów
uzasadnione wydaje się być stwierdzenie, iż fimbrie Myf mogą być jednym z elementów
uczestniczących w przebiegu zakażeń ludzi pałeczkami Y. enterocolitica. Jednakże precyzyjne określenie roli antygenu Myf w patogenezie jersiniozy wymaga przeprowadzenia
dalszych badań.
K. Zacharczuk, R. Gierczyński
C-terminal region of MyfA, the major subunit of Yersinia enterocolitica Myf fimbriae, is
conserved among pathogenic strains
SUMMARY
In our study we analyzed the nucleotide sequence of the C- terminal 256 bp fragment of the myfA
gene encoding MyfA protein, the major subunit of Yersinia enterocolitica Myf fimbriae. We examined
ten representative strains of major Y. enterocolitica pathogenic bioserotypes belonging to European
(4/O3; 2/O9; 3/O5,27) and American (1B/O8) phylogenetic lineages. DNA sequencing revealed that
consensus nucleotide sequences of the tested myfA fragment were indistinguishable in all the tested
strains. The resulting common consensus sequence found in our study was identical to the corresponding
fragment of reference sequences Z21953 and NC008800 deposited in GenBank database for pathogenic Y. enterocolitica strains. In contrast, 18 point mutations leading to 13 amino acid substitutions
were found when the common consensus sequence was aligned to sequence AY966879 determined
for the myfA homologue detected by PCR in Y. enterocolitica 1A strain. The strong conservation of
the nucleotide and amino acid sequence of myfA gene among virulent bioserotypes of Y. enterocolitica
336
K. Zacharczuk, R. Gierczyński
Nr 4
indicate that fimbriae MyF could play important role in pathogenesis, even before the divergence of
European and American lineages.
PIŚMIENNICTWO
1. Brzostek K. Mechanizmy regulacji czynników wirulencji Yersinia enterocolitica. Post. Mikrobiol
2004; 43: 7-38.
2. Gierczyński R. Ocena przydatności wybranych markerów wirulencji do identyfikowania chorobotwórczych szczepów pałeczek Yersinia enterocolitica. II. Genotypowe markery związane
z plazmidem pYV. Med Dośw Mikrobiol 2000; 52: 35-49.
3. Gierczyński R, Jagielski M, Rastawicki W. Ocena przydatności wybranych markerów wirulencji
do identyfikowania chorobotwórczych szczepów pałeczek Yersinia enterocolitica. IV. Geny myfA
i ureC. Med Dośw Mikrobiol 2002; 54: 347-55.
4. Gierczyński R, Jagielski M, Rastawicki W. Molecular virulence attributes and occurrence of pYV
bearing strains among human isolates of Yersinia enterocolitica in Poland. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis 2002; 21: 158-9.
5. Gierczyński R, Kałużewski S, Rakin A i inni. Intriguing diversity of Bacillus anthracis in eastern
Poland – the molecular echoes of the past outbreaks. FEMS Microbiol Letters 2004; 239: 235-40.
6. Grant T, Benntt-Wood V, Robinson-Brown RM. Identification of virulence-associated characteristic
in clinical isolates of Yersinia entrocolitica lacking classical virulence markers. Infect Immun
1998 66: 1113-20.
7. Iriarte M, Vanooteghem JC, Declor I. The Myf fibrillae of Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol
1993; 9: 507-20.
8. Iriarte M, Cornelis GR. MyfF, an element of the network regulating the synthesis of fibrillae in
Yersinia enterocolitica. J Bacteriol 1995; 177: 738-44.
9. Kot B, Trafny EA. The application of PCR to the identification of selected virulence markers of
Yersinia genus. Pol J Vt Sci 2004; 7: 27-31.
10. Lindler LE, Tall BD. Grant T, Bennett-Wood V, Robins-Brown RM. Identification of Yersinia pestis
pH6 antigen forms fimbriae and is induced by intracellular association with macrophages. Mol
Microbiol 1993; 8: 311-24.
11. Pierson DE, Falkov S. Nonpathogenic isolates of Yersinia enterocolitica do not contain functional
inv- homologous sequences. Infect Immun 1990; 58: 1059-64.
12. Price SB, Frejman MD, Yeh KS. Transcriptional analysis of the Yersinia pestis pH 6 antigen gene.
J Bacteriol 1995; 177: 5997-6000.
13. Rastawicki W, Gierczyński R. Expression, purification, and characterization of the humoral immune
response to recombinant MyfA protein of Yersinia enterocolitica. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
2009; 28: 1491-4.
14. Tennant SM, Grant TH, Robins-Browne RM. Pathogenicity of Yersinia enterocolitica biotype 1A.
FEMS Immunol Med Microbiol 2003; 38: 127-37.
15. Virdi JS, Bhagat N. Distribution of virulence-associated genes of Yersinia enterocolitica biovar
1A correlates with clonal groups and not the source of isolation. FEMS Microbiol Lett 2007;
266: 177-83.
Otrzymano: 3 XI 2010 r.
Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii, NIZP-PZH, e-mail:
[email protected]