ocena przydatności nowych enzymów restrykcyjnych sfaai oraz smii
advertisement
MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 133 - 142 Katarzyna Zacharczuk, Rafał Gierczyński OCENA PRZYDATNOŚCI NOWYCH ENZYMÓW RESTRYKCYJNYCH SFAAI ORAZ SMII DO RÓŻNICOWANIA IZOLATÓW YERSINIA ENTEROCOLITICA 4/O3 I 1B/O8 METODĄ ELEKTROFOREZY W ZMIENNYM POLU ELEKTRYCZNYM (PFGE) Zakład Bakteriologii NIZP – PZH w Warszawie Kierownik: prof. dr hab. M. Jagielski W pracy przeprowadzono ocenę przydatności wybranych enzymów restrykcyjnych: SfaAI, SfiI, SmaI oraz SmiI do różnicowania izolatów Yersinia enterocolitica 4/O3 i 1B/O8 metodą REA – PFGE. Wykazano użyteczność endonukleaz SfaAI oraz SfiI dla potrzeb genotypowania szczepów Y. enterocolitica Gram-ujemne pałeczki, należące do gatunku Yersinia enterocolitica są czynnikiem etiologicznym jersiniozy - ostrej, odzwierzęcej choroby występującej u ludzi oraz zwierząt. Do zakażenia dochodzi głównie drogą pokarmową w wyniku spożycia skażonych tymi bakteriami produktów spożywczych pochodzenia zwierzęcego, roślinnego a także wody. Za główny rezerwuar szczepów patogennych dla człowieka uznawane są świnie (1, 11). Jersinioza przybiera najczęściej charakter zatrucia pokarmowego, powodując stan zapalny jelita cienkiego oraz węzłów chłonnych krezki. W wyniku zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica mogą wystąpić również powikłania w postaci reaktywnego zapalenia stawów, zespołu Reitera, rumienia guzowatego i innych zmian skórnych lub w obrębie tkanki łączne j. Chorobotwórcze dla człowieka szczepy Y. enterocolitica należą do biotypów 1B, 2, 3, 4, 5 oraz niektórych, spośród blisko 60 grup serologicznych (O3; O:5,27; O8; O9), podczas gdy większość szczepów niechorobotwórczych należy do biotypu 1A (1, 5). W Europie, a w szczególności w Polsce, od chorych najczęściej izolowane są pałeczki z grupy O3 i biotypu 4 (bioserotyp 4/O3). Jednakże, od roku 2004 w kraju wykrywa się również zakażenia ludzi wywoływane przez pałeczki Y. enterocolitica z grupy O8 i biotypu 1B (bioserotyp 1B/O8) (13). Szczepy tego bioserotypu charakteryzuje wysoka chorobotwórczość, dotychczas występowały one głównie w Ameryce Północnej (na obszarze USA) i były izolowane sporadycznie w Japonii (1). Dla potrzeb identyfikacji oraz typowania chorobotwórczych szczepów Y. enterocolitica obok metod genotypowych (6), zastosowanie znajdują również techniki molekularne, w tym najpowszechniej wykorzystywane są: PCR oraz PFGE ( Pulsed-Field Gel Electrophoresis - elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym) (5, 17). Wyniki PFGE umożliwiają analizę polimorfizmu dużych fragmentów DNA generowanych poprzez trawienie kompletnego 134 Nr 2 K. Zacharczuk, R. Gierczyński chromosomu tzw. rzadko tnącymi enzymami restrykcyjnymi (przeważnie NotI i XbaI). Metoda ta w polskim piśmiennictwie jest również określana skrótem REA-PFGE (9) dla odróżnienia od analizy polimorfizmu kompletnych (nie trawionych enzymem restrykcyjnym) chromosomów. REA-PFGE uznawana jest za metodę referencyjną w genotypowaniu szczepów Y. enterocolitica, należących do tego samego bioserotypu (subtypowanie), ze względu na wysoką siłę dyskryminacji (potencjał różnicujący) oraz powtarzalność otrzymywanych wyników (2, 5, 6, 8, 11). Jednakże, ze względu na wysoki stopień podobieństwa genetycznego izolatów tego samego bioserotypu izolowanych od chorych z określonego obszaru (region geograficzny, kraj) przydatność REA-PFGE do subtypowania bywa często ograniczona. Ponadto występowanie profili (wzorów restrykcyjnych) składających się z dużej liczby nakładających się fragmentów DNA (prążków), z których jedynie kilka może być przydatnych do określenia genotypu, również ogranicza efektywność tej metody (5). Mimo podejmowanych prób dotychczas nie rozwiązano tego problemu (4, 5). Ponieważ liczba i wielkość fragmentów restrykcyjnych w metodzie REA-PFGE zależy od miejsca rozpoznawanego przez endonukleazę (długość i sekwencja nukleotydów) (16), celem prezentowanej pracy była ocena przydatności nowych enzymów restrykcyjnych SfaAI i SmiI do genotypowania pałeczek Y. enterocolitica. W świetle dostępnych danych piśmiennictwa oba te enzymy nie były dotychczas stosowane dla tych drobnoustrojów. Ponadto ocenie poddano również enzymy: SfiI i SmaI, które jedynie sporadycznie wykorzystywano w typowaniu Y. enterocolitica (5). MATERIAŁ I METODY S z c z e p y b a k t e r y j n e . W badaniach posłużono się reprezentatywnymi szczepami Yersinia enterocolitica (n=10) z kolekcji zagranicznych i kolekcji Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH, reprezentujących bioserotypy 4/O3 i 1B/O8. Szczegółowe informacje dotyczące pochodzenia badanych szczepów podano w Tabeli I. Tabela I. Charakterystyka szczepów Y. enterocolitica użytych w pracy do oceny przydatności wybranych endonukleaz Numer szczepu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Alternatywne oznaczenie szczepu WA-314 85/05 17451 IP 20232 IP 20175 IP 305/96 184/97 332/98 561/03 99/96 Kolekcja szczepów* Grupa serologiczna Biotyp MPI PZH IP IP IP PZH PZH PZH PZH PZH O8 O8 O8 O8 O8 O3 O3 O3 O3 O3 1B 1B 1B 1B 1B 4 4 4 4 4 * PZH – (Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny, Warszawa); MPI - (Max von Pettenkofer-Institut für Hygiene und Medizinische Mikrobiologie der Ludwig Maximilians Universität München, Monachium, Niemcy); IP - (Institut Pasteur, Paryż, Francja) Nr 2 Enzymy restrykcyjne w różnicowaniu Y. enterocolitica 135 REA - PFGE. P r z y g o t o w a n i e b l o c z k ó w . W celu uzyskania kompletnego DNA chromosomalnego, komórki bakteryjne immobilizowano w żelu agarozowym. Szczepy bakteryjne namnażano na podłożu stałym TSA przez 18 godz. w temp 27 ºC. Przygotowywano zawiesiny bakteryjne w buforze TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0), o gęstości 8-10 w skali McFarlanda. Do 0,20 ml rozpuszczonej, 1% agarozy (SeaKem Gold Agarose, Lonza) o temperaturze 45oC dodawano 0,25 ml zawiesiny bakteryjnej. Po wymieszaniu zawiesinę niezwłocznie przenoszono (0,1 ml) do form do przygotowywania bloczków (Bio-Rad). Bloczki agarozowe inkubowano w 5 ml buforu lizującego (50mM Tris-HCl, pH 8,0; 50mM EDTA, pH 8,0; 1% N-Laurylosarkozyl (Sigma) z dodatkiem 25µl proteinazy K (20 mg/ml) (Sigma) w temp. 55 ºC przez 2 h. Bufor usuwano i bloczki dwukrotnie płukano w łaźni wodnej z wytrząsaniem w temp. 50ºC w 10 ml wody dejonizowanej a następnie czterokrotnie w 10 ml buforu TE. Bloczki przechowywano w chłodni w 1 ml buforu TE do momentu użycia. Tr a w i e n i e i m m o b i l i z o w a n e g o D N A . Immobilizowane DNA bakteryjne (1/3 bloczka agarozowego) inkubowano przez okres 10-15 min w 0,16 ml odpowiedniego dla danej endonukleazy buforu reakcyjnego dostarczonego przez producenta enzymu i zgodnie z jego zaleceniami. Bufor reakcyjny usuwano. Do próbówek z bloczkami dodawano 0,16 ml mieszaniny buforu reakcyjnego i odpowiedniego enzymu (SfaAI, SfiI, SmaI lub SmiI) w ilości odpowiadającej 20 jednostkom. Trawienie prowadzono przez 18 h w temperaturze zalecanej przez producenta enzymu (Fermentas, Litwa). Po zakończeniu trawienia usuwano bufor reakcyjny i do probówek dodawano 0,2 ml buforu (1x) Loading Dye Solution (Fermentas, Litwa), a następnie inkubowano nie krócej niż przez 15 min. Rozdział fragmentów restrykcyjnych genomowego DNA metodą P F G E . Rozdział elektroforetyczny fragmentów restrykcyjnych genomowego DNA badanych szczepów prowadzono w zmiennym polu elektrycznym (Clamped Homogeneous Electric Field) przy użyciu systemu CHEF-DR II (Bio-Rad, USA). Wybarwione bloczki zawierające imobilizowane fragmenty restrykcyjne umieszczano na zębach grzebienia do formowania dołków w żelu agarozowym, a następnie grzebień wstawiano do tacy do formowania żelu (Bio-Rad) i zalewano 1% roztworem agarozy (Agarose Prona Plus, E.U) w 0,5 x TBE (45 mM Tris, 45 mM kwas borowy, 1,0 mM EDTA pH 8,3) o temperaturze w zakresie 54-56oC. Po żelifikacji usuwano grzebień, a żel umieszczano w komorze elektroforetycznej i zalewano 1,7 l buforu elektroforetycznego (0,5 x TBE). Rozdział elektroforetyczny rozpoczynano niezwłocznie po schłodzeniu buforu do temperatury rozdziału wynoszącej 14 o C. Czas elektroforezy wynosił 24 h, okres pulsu oscylował w zakresie od 5 (initial) do 24 s (final switch time) przy natężeniu pola elektrycznego 6,0 V/cm. Jako marker masy molekularnej zastosowano Lambda Ladder PFGE Marker (New England, Biolabs). Po zakończeniu elektroforezy żel poddawano płukaniu z umiarkowanym wytrząsaniem w roztworze bromku etydyny 0,5 mg/l przez 30 min, a następnie w wodzie dejonizowanej przez okres nie krótszy niż 45 min i fotografowano w świetle UV (254 nm). WYNIKI W pracy oceniano przydatność enzymów restrykcyjnych: SmaI, SmiI, SfaAI, SfiI w analizie makrorestrykcyjnej genomowego DNA szczepów Y. enterocolitica z zastosowaniem elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (Ryc. 1A, 1B). 136 K. Zacharczuk, R. Gierczyński Nr 2 Ryc. 1A. Profile REA-PFGE uzyskane po trawieniu genomowego DNA szczepów Yersinia enterocolitica 1B/O8 i 4/O3 endonukleazami: SfiI i SfaAI . Numery ścieżek odpowiadają poszczególnym szczepom (Tabela I). M – marker wielkości DNA. Wielkość fragmentów DNA wyrażono w tysiącach par zasad (kpz). Ryc. 1B. Profile REA-PFGE uzyskane po trawieniu genomowego DNA szczepów Yersinia enterocolitica 1B/O8 i 4/O3 endonukleazami: SmiI i SmaI. Numery ścieżek odpowiadają poszczególnym szczepom (Tabela I). M – marker wielkości DNA. Wielkość fragmentów DNA wyrażono w tysiącach par zasad (kpz). Nr 2 Enzymy restrykcyjne w różnicowaniu Y. enterocolitica 137 Wyniki typowania metodą PFGE analizowano przy użyciu programu Gel Compar II Version 5.10 (Applied Maths, Saint-Matris-Latem, Belgium). Podobieństwo genetyczne szczepów przedstawiono w postaci dendrogramów utworzonych z wykorzystaniem metody klasteryzacji UPMGA (Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages) oraz współczynnika podobieństwa Dice (1.%) (10) (Ryc. 2). Ryc. 2. Porównanie topologii dendrogramów genetycznego podobieństwa szczepów Yersinia enterocolitica 1B/O8 i 4/O3 uzyskanych w wyniku analizy profili REA-PFGE otrzymanych dla ocenianych endonukleaz: SfiI, SfaAI, SmiI i SmaI. Numery gałęzi dendrogramów odpowiadają poszczególnym szczepom (Tabela I). Oś rzędnych przedstawia skalę podobieństwa genetycznego wyrażonego w procentach. Przeprowadzone badania wykazały występowanie dwóch głównych grup wzorów restrykcyjnych (profili) genomowego DNA badanych izolatów. Podział ten dotyczył profili otrzymanych z każdym z użytych w badaniach enzymów restrykcyjnych. Każda grupa odpowiadała jednemu z dwóch użytych w badaniach bioserotypów Y. enterocolitica (1B/ O8 i 4/O3). Stopień zróżnicowania profili PFGE szczepów obu bioserotypów mieścił się w zakresie 34-54% w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego odpowiednio: 34% (SmiI) > 36% (SfaAI) >42% (SfiI) > 54% (SmaI) (Ryc. 2). 138 K. Zacharczuk, R. Gierczyński Nr 2 Rozkład i liczba fragmentów restrykcyjnych DNA (prążków) w uzyskanych profilach PFGE zależała od użytej endonukleazy. Uzyskane profile PFGE badanych izolatów Y. enterocolitica składały się z fragmentów DNA o wielkości nie przekraczającej 400 kpz. Obserwowano dużą liczbę fragmentów DNA o wielkości poniżej 50 kpz, które charakteryzowało bardzo bliskie położenie względem siebie (nakładanie się prążków). Fragmenty te nie były przydatne w analizie podobieństwa. Analizie poddano jedynie prążki o drodze migracji krótszej niż ta jaką przebył najmniejszy prążek markera wielkości DNA (48.5 kpz) (Ryc.1A i B). Użycie enzymu SfaAI do restrykcyjnej analizy genomowego DNA badanych szczepów pozwoliło na uzyskanie złożonych profili PFGE, które charakteryzowały się obecnością od 16 do 20 (grupa serologiczna O8) oraz 17-18 (grupa serologiczna O3) prążków (Ryc. 1A) Wielkość uzyskanych fragmentów restrykcyjnych mieściła się w zakresie od 50 do 350 kpz. W przypadku kolejnego użytego enzymu - SfiI dla badanych szczepów z grupy serologicznej O3 otrzymano 11-12 prążków, natomiast dla grupy O8 liczba ta wyniosła 13-14 (Ryc. 1A). Zakres wielkości uzyskanych fragmentów restrykcyjnych wynosił od 50 do 250 kpz. Trawienie SmiI i SmaI prowadziło do uzyskania profili składających się z od 8 do11 prążków w obu grupach badanych szczepów, przy czym zakres wielkości uzyskanych fragmentów restrykcyjnych dla obu tych enzymów wynosił 50-250 kpz (Ryc. 1B). Profile PFGE otrzymane po użyciu enzymów SmiI oraz SmaI charakteryzowały się nierównomiernym rozkładem prążków. Większość fragmentów DNA (ok.70%) tworzących te profile, miała wielkość od 50 do 100 kpz, co prowadziło do kumulowania się prążków, które były położone blisko siebie, a nawet się nakładały. Pozostałe, pojedyncze prążki mieściły się w przedziale 100-250 kpz i były wyraźnie rozdzielone (Ryc. 1B). Natomiast, profile uzyskane w wyniku trawienia endonukleazami SfaAI lub SfiI charakteryzował względnie równomierny rozkład prążków (Ryc. 1A). Zastosowanie enzymu SfiI umożliwiło zróżnicowanie wszystkich badanych szczepów, pozwalając na wyróżnienie 10 genotypów. Stwierdzony stopień zróżnicowania uzyskanych profili PFGE dla powyższego enzymu wynosił odpowiednio 17% dla grupy serologicznej O8 oraz 20% Y. enterocolitica O3 (Ryc. 2). Najwyższy stopień różnicowania (26%) w obrębie grupy serologicznej O8 stwierdzono dla enzymu SfaAI. Jednak w przypadku szczepów Y. enterocolitica O3 obserwowane zróżnicowanie było znacząco niższe (8%), wśród 5 izolatów wyodrębniono 4 profile wykazujące od 92 do 100% podobieństwa genetycznego (Ryc. 2). Dwa szczepy oznaczone numerami: 6 oraz 9 reprezentowały ten sam profil PFGE. Użycie enzymu SmiI, pozwoliło na wyróżnienie 9 profili PFGE pośród 10 badanych szczepów. Stopień zróżnicowania szczepów wynosił 9% i 18% odpowiednio dla grupy serologicznej O3 i O8 (Ryc.2). Dwa szczepy Y. enterocolitica O3 o numerach 6 i 7, charakteryzowały się identycznym wzorem restrykcyjnym. Typowanie badanych szczepów z użyciem enzymu SmaI umożliwiło zróżnicowanie wszystkich szczepów Y. enterocolitica O8 na poziomie 86% podobieństwa genetycznego (14% zróżnicowania) (Ryc. 2). Natomiast wśród 5 szczepów O3 wyróżniono 4 profile DNA stwierdzając niższy poziom zróżnicowania (11%). DYSKUSJA Restrykcyjna analiza immobilizowanego, chromosomalnego DNA i rozdział uzyskanych fragmentów w zmiennym polu elektrycznym (REA-PFGE) uważana jest za ‘’złoty standard’’ Nr 2 Enzymy restrykcyjne w różnicowaniu Y. enterocolitica 139 w genotypowaniu molekularnym wielu drobnoustrojów, np.: Escherichia coli, Campylobacter sp., Salmonella sp., Shigella sp., Streptococcus sp. jak również Y. enterocolitica (9, 12). Istotnym elementem decydującym o efektywności metody REA-PFGE jest dobór odpowiedniego enzymu restrykcyjnego. Większość laboratoriów dla potrzeb genotypowania izolatów Yersinia enterocolitica stosuje endonukleazy: NotI oraz XbaI. Używano również enzymów: XhoI, ApaI, SpeI, BlnI, SstI, NheI (3, 4, 6, 11). Jednakże enzymy te okazały się mało przydatne w genotypowaniu Y. enterocolitica, zwłaszcza izolatów należących do bioserotypu 4/O3. Szczepy Y. enterocolitica 4/O3 występują endemicznie w Polsce i są głównym etiologicznym czynnikiem jersiniozy. Ponadto stosunkowo niedawno pojawiły się w kraju zakażenia pałeczkami Y. enterocolitica należącymi do bioserotypu 1B/O8 (14). Szczepy z tego bioserotypu charakteryzują się wysoką chorobotwórczością. Obecnie wzrost liczby zakażeń u ludzi wywoływanych przez Y. enterocolitica 1B/O8 stanowi narastający problem w kraju. Dla pełnego poznania dróg szerzenia się zakażeń powodowanych przez te dwie grupy pałeczek Y. enterocolitica konieczne jest określenie stopnia pokrewieństwa izolatów wyosobnianych od chorych oraz prawdopodobnie pochodzących z jednego źródła. Metoda REA-PFGE, polecana do typowania tych drobnoustrojów posiada jednak ograniczoną zdolność różnicowania izolatów należących do tego samego bioserotypu, wyosobnianych w tym samym regionie geograficznym (5). Aby zwiększyć siłę różnicowania REA-PFGE zalecany jest dobór odpowiedniego (generującego profile zawierające powyżej 9 rozróżnialnych prążków (15)) enzymu restrykcyjnego, lub wykorzystanie łącznej siły różnicującej 2 lub 3 różnych enzymów (4,5), co wiąże się z koniecznością wykonania odpowiednio 2 lub 3 odrębnych analiz dla każdego badanego izolatu. To zaś znacząco podnosi koszt i pracochłonność analiz. Z tych przyczyn, wariant ten został pominięty w podjętych badaniach. Ograniczono się do poszukiwania optymalnego enzymu restrykcyjnego. W tym celu dokonano doboru i oceny efektywności innych niż wyżej wspomniane endonukleaz w genotypowaniu szczepów Y. enterocolitica 4/O3 i 1B/O8 metodą REA-PFGE. Ocenie poddano następujące endonukleazy: SfaAI, SfiI, SmaI i SmiI. Głównym kryterium przy wyborze enzymu była długość sekwencji rozpoznawanej przez daną endonukleazę. Autorzy większości prac w których typowano izolaty Y. enterocolitica metodą REA-PFGE stosowali enzymy, które rozpoznawały sekwencje nukleotydów o długości 6 pz (XbaI) lub 8 pz (NotI). Jednak mimo stosowania tych tzw. „rzadko-tnących” (16) endonukleaz, uzyskiwano profile o bardzo dużej liczbie prążków, co utrudniało interpretację wyników (5). Ponieważ występuje odwrotna zależność pomiędzy długością sekwencji rozpoznawanej przez endonukleazę a liczbą generowanych fragmentów restrykcyjnych, dlatego do badań własnych wybrano endonukleazy, których długość sekwencji rozpoznawanej wynosiła: 13 (SfiI), 8 (SmiI, SfaAI) oraz w pojedynczym przypadku 6 (SmaI) par zasad (16). Dendrogramy uzyskane w wyniku analizy podobieństwa wzorów restrykcyjnych wszystkich ocenianych endonukleaz pokazują obecność dwóch głównych grup profili PFGE odpowiadających dwóm obecnie wyróżnianym podgatunkom: Y. enterocolitica subsp. paleartica (szczepy 4/O3) i Y. enterocolitica subsp. enterocolitica (szczepy 1B/O8). Jest to zgodne z obserwacjami innych autorów świadczącymi o istnieniu korelacji pomiędzy profilem REA-PFGE a przynależnością szczepów Y. enterocolitica izolowanych z materiału klinicznego do określonej grupy serologicznej, biotypu bądź bioserotypu (2, 7, 11, 12). W tym świetle, uzyskane w badaniach własnych wyniki wskazują, że wszystkie 140 K. Zacharczuk, R. Gierczyński Nr 2 z ocenianych w pracy endonukleaz mogą służyć do różnicowania szczepów Y. enterocolitica obu podgatunków. Według zaproponowanych przez Tenovera i wsp. (15) kryteriów oceny pokrewieństwa szczepów bakteryjnych, rzetelna interpretacja profili PFGE jest możliwa tylko wtedy, gdy zawierają one co najmniej 10 rozróżnialnych prążków. Powyższy wymóg został spełniony dla enzymów SfiI oraz SfaAI, które generowały profile składające się odpowiednio z 11-14 oraz 16-20 prążków w zależności od grupy serologicznej. W przypadku użycia restryktazy SfiI mniejsza liczba prążków może wynikać z długości sekwencji rozpoznawanej przez ten enzym, która jest znacznie dłuższa niż ta rozpoznawana przez SfaAI. Odpowiednia liczba oraz równomierny rozkład fragmentów restrykcyjnych jest parametrem pozwalającym na analizę profili PFGE zgodnych z powyższymi zaleceniami. Natomiast powstała po enzymatycznym trawieniu SmaI bądź SmiI duża liczba nakładających się prążków o wielkości poniżej 100 kpz, powodowała występowanie profili PFGE, przy analizie których decydującą rolę miały jedynie pojedyncze, dobrze rozdzielone fragmenty restrykcyjne. Z tego względu efektywność SmiI, a zwłaszcza SmaI w procesie subtypowania jest ograniczona. Jak już wspomniano, zlewanie się ze sobą prążków o zbliżonej wielkości znacznie utrudnia interpretację wyników REA-PFGE. W odróżnieniu od innych drobnoustrojów (Klebsiella sp., Salmonella sp.) wzory restrykcyjne szczepów Y. enterocolitica, charakteryzują się dużą ilością fragmentów DNA. Dla NotI uzyskiwano ponad 40 prążków (7, 11), z których zdaniem Saken i wsp. (12) do dalszych analiz nadają się jedynie te o wielkości powyżej 100 kpz. Jak wynika z elektroforegramu przedstawionego przez tych autorów, wzory restrykcyjne badanych szczepów Y. enterocolitica zawierały mniej niż 15 prążków spełniających powyższe kryterium. Podobnie ograniczoną liczbę prążków przydatnych w typowaniu REA-PFGE autorzy ci stwierdzili dla endonukleaz: XbaI, SstI oraz NheI (12). W przeprowadzonych badaniach własnych stwierdzono, że najlepsze rezultaty różnicowania szczepów Y. enterocolitica 1B/O8 uzyskano stosując enzym restrykcyjny SfaAI. Stopień zróżnicowania wynosił 26%, co w porównaniu z pozostałymi enzymami ocenianymi w tej pracy, wskazuje, iż endonukleaza SfaAI może być szczególnie przydatna w typowaniu szczepów Y. enterocolitica 1B/O8. Natomiast, dla potrzeb określenia pokrewieństwa genetycznego szczepów 4/O3 wskazane wydaje się być stosowanie enzymu SfiI (stopień zróżnicowania - 20%). Celowość stosowania odrębnych endonukleaz w genotypowaniu izolatów Y. enterocolitica należących do różnych podgatunków uzasadniają też wyniki innych autorów wskazujące, że szczepy z bioserotypu 4/O3 są bardziej genetycznie homogenne niż szczepy 1B/O8 (2, 5, 11, 12). REA-PFGE jest metodą pracochłonną i czasochłonną, wymaga kosztownej aparatury oraz specjalistycznego oprogramowania komputerowego do analiz otrzymanych wyników. Mimo tych wad jest ona polecana jako standard w genotypowaniu Y. enterocolitica (4, 7, 11). Wyniki badań własnych wskazują, że endonukleazy SfaAI i SfiI mogą być użyteczne w różnicowaniu izolatów Y. enterocolitica. Enzymy te mogą być przydane, gdy zachodzi konieczność potwierdzenia genetycznej homogenności badanych izolatów - np. w epidemiologicznym dochodzeniu rozproszonych ognisk zakażeń pokarmowych, co wymaga użycia kilku różnych endonukleaz. Uznanie enzymów restrykcyjnych: SfaAI oraz SfiI za przydatne dla celów typowania izolatów Y. enerocolitica metodą REA-PFGE stanowi podstawę do dalszych badań mających na celu optymalizację parametrów rozdziału elektroforetycznego. Nr 2 Enzymy restrykcyjne w różnicowaniu Y. enterocolitica 141 Autorzy pracy dziękują pani dr n. med. Jolancie Szych z Zakładu Bakteriologii NIZP – PZH w Warszawie za udostępnienie szczepów Y. enterocolitica. K Za c h a r c z u k , R Gi e rc z yński ASSESSMENT OF NEW RESTRICTION ENZYMES: SFAAI AND SMII FOR THE DIFFERENTIATION OF Y. ENTEROCOLITICA BIOSEROTYPE 4/O3 AND 1B/O8 CLINICAL ISOLATES BY PULSED – FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) SUMMARY Endonucleases SfaAI and SmiI have not been yet applied for Y. enterocolitica genotyping. Our goal was to evaluate usefulness of these endonucleases and two other rarely used (SfiI and SmaI) ones for the differentiation of Y. enterocoilitica clinical isolates by PFGE. Reference strains used in this study belong to the major agents of human yersiniosis in Poland, the bioserotype 4/O3 (n=5), and to the highly pathogenic bioserotype 1B/O8 (n=5) that has recently emerged in Poland. Our data indicated that all the tested enzymes are useful for distinguishing Y. enterocolitica strains of bioserotypes 4/O3 and 1B/O8 which are the most common representatives of the two Y. enterocolitica subspecies: palearctica and enterocolitica, respectively. Hovewer, only two enzymes: SfaAI and SfiI completely differentiated strains belonging to the same bioserotype. The discrimination power of these two enzymes varied depending on the bioserotype. SfaAI and SfiI were found to be the most discriminatory for Y. enterocolitica 1B/O8 and 4/O3, respectively. In conclusion, SfaAI and SfiI appear to be useful for the PFGE-subtyping of Y. enetrocolitica isolates to aid epidemiological investigations of foodpoisoning or dispersed-outbreaks. PIŚMIENNICTWO 1. Bottone EJ. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates. Microb Infect 1999; 1: 323-33. 2. Buchrieser C, Weagant SD, Kaspar CW. Molecular characterization of Yersinia enterocolitica by pulsed - field electrophoresis and hybrdization of DNA fragments to ail and pYV probes. Appl Environ Microbiol 1994; 60: 4371- 9. 3. Filetici E, Anastasio MP, Pourshaban M, Fantasia M. Genotypic and phenotypic characteristic of Yersinia spp. Isolates from food and man. Food Microbiol 2000; 17: 261- 7. 4. Fredriksson-Ahoma M, Autio T, Korkeala H. Efficient subtyping of Yersinia enterocolitica bioserotype 4/O:3 with pulsed field electrophoresis. Lett Appl Microbiol 1999; 29: 308- 12. 5. Fredriksson-Ahoma M, Stolle A, Korkeala H. Molecular epidemiology of Yersinia enterocolitica infections. FEMS Immunol Med Microbiol 2006; 47: 315- 29. 6. Gierczyński R. Ocena przydatności wybranych markerów wirulencji do identyfikowania chorobotwórczych szczepów pałeczek Yersinia enterocolitica I. Fenotypowe markery związane z plazmidem pYV. Med Dośw Mikrobiol 2000; 52: 25-34. 7. Iteman I, Guiyoule A, Carniel E. Comparison of three molecular methods for typing and subtyping pathogenic Yersinia enterocolitica. J Med Microbiol 1996; 45: 48-56. 8. Jones TF, Bukingham SC, Bopp ChA, Ribot E i inni. From pig to pacifier: chitterling – associated yersiniosis outbreak among black infants. Emerg Infect Dis 2003; 9: 1007- 9. 9. Krawczyk B, Kur J. Diagnostyka molekularna w mikrobiologii. Rozdział 11.3. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk 2008: 79-81. 142 K. Zacharczuk, R. Gierczyński Nr 2 10. Krawczyk B, Kur J. Diagnostyka molekularna w mikrobiologii. Rozdział 15. Statystyczna analiza danych typowania genetycznego. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk 2008: 13642. 11. Nadjenski H, Iteman I, Carniel E. Efficient subtyping Yersinia enterocolitica strains by pulsed field electrophoresis. J Clin Microbiol 1994; 32: 2913- 20. 12. Saken E, Roggenkamp A, Aleksic S, Heesemann J. Characterisation of pathogenic Yersinia enterocolitica serogroups by pulsed-field gel electrophoresis of genomic NotI restriction fragments. J Med Microbiol 1994; 41: 329- 38. 13. Schubert S, Bockemuhl J, Brendler U, Heesemann J. First isolation of virulent Yersinia enterocolitica O8, biotype 1B in Germany. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003; 22: 66- 8. 14. Rastawicki W, Szych J, Gierczyński R, Rokosz N. A dramatic increase of Yersinia enterocolitica serogrup O:8 infections in Poland. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2009, 47: 1225 – 8. 15. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA i inni. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33: 2233- 9. 16. Węgleński P i inni. Genetyka molekularna. Rozdział 6.2. Enzymy restrykcyjne. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1995: 159- 60. 17. Wojciech L, Staroniewicz Z, Jakubczak A, Ugorski M. Typing of Yersinia enterocolitica isolates by ITS profiling, REP- and ERIC-PCR. J Vet Med B 2004; 51: 238-144. Otrzymano: 1 VI 2009 r. Adres Autora: 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH
