Pobierz dokument

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
(96)
TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO
Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
(19)
PL
(11)
PL/EP 1697530
(13)
T3
(51) Int. Cl.
10.12.2004 04803729.5
(97)
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej
Polskiej
O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono:
C12P13/08
C07K14/225
C07K14/245
C12N15/31
C07K14/25
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
31.03.2010 Europejski Biuletyn Patentowy 2010/13
EP 1697530 B1
(54) Tytuł wynalazku:
Sposób wytwarzania L-aminokwasów z użyciem szczepów z rodziny Enterobacteriaceae
(30) Pierwszeństwo:
DE20031061268
24.12.2003
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
06.09.2006 Europejski Biuletyn Patentowy 2006/36
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
31.08.2010 Wiadomości Urzędu Patentowego 08/2010
(73) Uprawniony z patentu:
T3
Evonik Degussa GmbH, Essen, DE
(72) Twórca (y) wynalazku:
PL/EP 1697530
DUSCH Nicole, Werther, DE
(74) Pełnomocnik:
Polservice Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o.
rzecz. pat. Kawczyńska Marta
00-950 Warszawa
skr. pocz. 335
Uwaga:
W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw
dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą
wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
2
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania Llizyny,
L-waliny
rekombinowanych
i
szczepów
Enterobacteriaceae,
5
L-treoniny
w
przy
mikroorganizmów
których
ulega
z
użyciu
rodziny
nadekspresji
otwarta ramka odczytu (ORF) oznaczona jako yaaU, i tych
mikroorganizmów.
Stan techniki
L-aminokwasy,
10
używane
w
w
szczególności
medycynie
L-treonina,
człowieka
i
są
przemyśle
farmaceutycznym, w przemyśle spożywczym a szczególnie w
żywieniu zwierząt.
że
Wiadomo,
przez
15
L-aminokwasy
fermentację
szczególności
szczepów
Escherichia
marcescens.
Z
podejmowane
są
powodu
wysiłki
coli
mogą
przygotowane
Enterobacteriaceae,
(E.
dużego
mające
być
na
coli)
i
Serratia
znaczenia,
celu
w
ciągle
udoskonalenie
sposobów wytwarzania. Udoskonalenia metodologiczne mogą
dotyczyć aspektów związanych z technologią fermentacji,
20
takich jak mieszanie lub dostarczanie tlenu, lub składu
pożywek hodowlanych, takiego jak stężenie cukru podczas
fermentacji, lub przekształcania w postać produktu, na
przykład
przy
użyciu
metod
chromatografii
jonowymiennej, lub swoistych właściwości produkcyjnych
25
samego mikroorganizmu.
Do
udoskonalenia
właściwości
produkcyjnych
tych
mikroorganizmów stosuje się metody mutagenezy, selekcji
i
wyboru
mutanta.
Tym
samym
skutkuje
to
uzyskaniem
szczepów, które są oporne na antymetabolity, takie jak
30
kwas
α-amino-β-hydroksywalerianowy
(AHV)
będący
analogiem treoniny lub są autotroficzne w odniesieniu
3
do metabolitów o znaczeniu regulatorowym i produkują Laminokwasy, takie jak L-treonina.
Od kilku lat do udoskonalenia szczepów z rodziny
Enterobacteriaceae
5
metod
rekombinowanego
zwielokrotnieniu
biosyntezy
10
liczby
aminokwasów
produkcję.
Opracowane
komórki
biologii
i
Salmonella
L-aminokwasy
produkujących
można
DNA
polegających
kopii
i
używano
poszczególnych
obserwowaniu
informacje
na
na
genów
wpływu
temat
na
biologii
molekularnej
Escherichia
coli
znaleźć
Neidhardt
(red.):
w
i
Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular
Biology, wydanie drugie, ASM Press, Waszyngton, D.C.,
USA, (1996).
Dokumenty
15
D1-D3
ujawniają
sekwencje
aminokwasowe
polipeptydów, odpowiednio jak w SEK ID NR: 4, 6 i 8
niniejszego zgłoszenia.
D1
BAZA DANYCH UNI-PROT YAAU_ECOLI, 1 listopad 1997
(1997-11-01),
XP 002321166
20
Nr dostępu w bazie danych P31679
skrót
obejmuje hipotetyczne białko transportu metabolitów
yaaU z Escherichia coli
25
D2
BAZA DANYCH UNI-PROT Q83Q5_SHIFL
1 czerwiec 2003 (2003-06-01),
XP002321167
Nr dostępu w bazie danych Q83SQ5
skrót
30
obejmuje
przypuszczalne
Shigella flexneri
białko
transportowe
z
4
D3
BAZA DANYCH UNI-PROT Q8ZRW7_SALTY
1 październik 2003 (2003-10-01),
XP002321168
Nr dostępu w bazie danych Q8ZRW7
5
skrót
obejmuje
przypuszczalne
białko
transportowe
z
rodziny MFS z Salmonella typhimurium.
Dokumenty
10
ujawniają
D4
WO
sposoby
03/076637A
produkcji
i
(D5)
WO
L-treoniny
03/008600A
przy
użyciu
nadekspresji lub delecji określonych genów.
Uważa się, że problemem, który został rozwiązany w
(D4) jest dostarczenie sposobu wytwarzania L-treoniny
przez
15
mikroorganizm
fermentujący
Enterobacteriaceae,
który
z
zawiera
rodziny
ulegający
nadekspresji gen pepB.
Przedmiot wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie
20
nowych
środków
do
udoskonalenia
wytwarzania
L-
aminokwasów, w szczególności L-treoniny.
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy rekombinowanych mikroorganizmów z
25
rodziny Enterobacteriaceae, które zawierają ulegającą
nadekspresji yaaU-ORF kodującą polipeptyd opisany jako
przypuszczalny transporter cukru, i które produkują Llizynę, L-walinę lub L-treoninę w udoskonalony sposób.
W
30
każdym
rekombinowane
przypadku,
pod
mikroorganizmy,
względem
yaaU-ORF,
które
i
nie są
które
nie
zawierają żadnej yaaU-ORF ulegającej nadekspresji, są
5
używane jako punkt wyjściowy do porównania.
Te
rekombinowane
szczególności,
mikroorganizmy
mikroorganizmy
Enterobacteriaceae,
5
polinukleotyd
w
kodujący
których
obejmują,
z
rodziny
ulega
polipeptyd,
w
nadekspresji
którego
sekwencja
aminokwasowa jest przynajmniej w 90%, w szczególności
przynajmniej w 95%, korzystnie przynajmniej w 98%, są
przynajmniej w 99%, szczególnie korzystnie w 99,7% i
bardzo
10
szczególnie
korzystnie
w
100%,
identyczna
z
sekwencją aminokwasową wybraną z grupy SEK ID NR 4, SEK
ID NR 6 i SEK ID NR 8.
Preferowane
są
sekwencje
aminokwasowe,
które
są
identyczne do tych z SEK ID NR 4, SEK ID NR 6 lub SEK
ID NR 8.
15
Te
mikroorganizmy
zawierają
polinukleotydy
ulegające nadekspresji wybrane z grupy obejmującej:
a) polinukleotyd posiadający sekwencję nukleotydową SEK
ID NR 3, SEK ID NR 5 lub SEK ID NR 7;
b) polinukleotyd
20
posiadający
sekwencję
nukleotydową,
która jest zgodna z SEK ID NR 3, SEK ID NR 5 lub SEK
ID
NR
7
w
granicach
zdegenerowania
kodu
genetycznego;
c) sekwencja
polinukleotydowa
posiadająca
sekwencję,
która hybrydyzuje, w ostrych warunkach, z sekwencją,
25
która jest komplementarna do sekwencji SEK ID NR 3,
SEK ID NR 5 lub SEK ID NR 7;
d) polinukleotyd posiadający sekwencję SEK ID NR 3, SEK
ID NR 5 lub SEK ID NR 7, która zawiera funkcjonalnie
obojętne mutacje typu zmiany sensu,
30
z
polinukleotydami
transporter cukru.
kodującymi
przypuszczalny
6
Wynalazek
wytwarzania
użyciu
dotyczy
L-lizyny,
produkowały
te
sposobu
L-waliny
rekombinowanych
Enterobacteriaceae,
5
także
lub
fermentacyjnego
L-treoniny,
mikroorganizmów
które,
w
L-aminokwasy
z
przy
rodziny
szczególności,
i
w
których
już
ulega
nadekspresji przynajmniej jedna otwarta ramka odczytu
(ORF) oznaczona jako yaaU, lub sekwencja nukleotydowa
kodująca jej produkt genowy.
Preferowane jest użycie mikroorganizmów, które są
10
opisane.
Kiedy poniżej wspomniane jest o L-aminokwasach lub
aminokwasach
rozumie
się
aminokwasów,
włączając
przez
ich
to
sole,
jeden
lub
wybranych
więcej
z
grupy
składającej się z L-asparaginy, L-treoniny; L-seryny,
15
L-glutaminianu,
waliny,
L-glicyny,
L-metioniny,
L-alaniny,
L-proliny,
L-cysteiny,
L-izoleucyny,
LL-
leucyny, L-tyrozyny, L-fenyloalaniny, L-histydyny, Llizyny,
L-tryptofanu,
L-argininy
i
L-homoseryny.
L-
treonina jest szczególnie korzystna.
20
W
tym
kontekście
zwiększenie
w
określenie
„wzmacnia”
mikroorganizmie
opisuje
wewnątrzkomórkowej
aktywności lub stężenia jednego lub więcej enzymów lub
białek, które są kodowane przez odpowiadający im DNA,
poprzez, na przykład, zwiększenie przynajmniej o jedną
25
(1) kopię liczby kopii genu lub genów, lub ORF lub
ORFs;
użycie
silnego
promotora
funkcjonalnie
przyłączonego do tego genu lub genu lub allelu lub ORF,
które
kodują
posiadające
30
odpowiadający
wysoką
im
aktywność,
enzym
i,
lub
kiedy
białko
jest
to
właściwe, kombinację tych środków.
Segment sekwencji nukleotydowej, która koduje, lub
7
może
kodować,
białko
rybonukleinowy,
do
i/lub
którego
polipeptyd
stan
lub
techniki
kwas
nie
jest
zdolny przypisać jakiejkolwiek funkcji jest określony
jako
5
otwarta
ramka
odczytu
(ORF).
Po
przypisaniu
funkcji do omawianego segmentu sekwencji nukleotydowej,
segment ten jest powszechnie rozumiany jako gen. Allele
są powszechnie rozumiane jako alternatywne formy danego
genu.
Te
formy
są
rozróżniane
poprzez
różnice
w
sekwencji nukleotydowej.
10
Ogólnie,
białko
lub
kwas
rybonukleinowy
kodowane
przez sekwencję nukleotydową, tj. ORF, gen lub allel,
jest określane jako produkt genowy.
Środki wzmacniające, w szczególności nadekspresja,
ogólnie zwiększają aktywność lub stężenie odpowiedniego
15
białka o przynajmniej 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%,
200%, 300%, 400% lub 500%, maksymalnie do 1000% lub
2000%,
w
porównaniu
aktywnością
20
lub
lub
rekombinowany
pod
którego
względem
jest
są
dzikiego
białka
w
który
odpowiedniego
nierekombinowany
rozumiany
stosowane
typu
mikroorganizmie,
Mikroorganizm
rodzicielski
białkiem
stężeniem
rodzicielskim
białka.
z
jako
sposoby
lub
szczepie
nie
jest
enzymu
lub
lub
szczep
mikroorganizm,
według
do
niniejszego
wynalazku.
25
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania L-lizyny, Lwaliny
lub
L-treoniny
rekombinowanych
poprzez
mikroorganizmów
fermentację
z
rodziny
Enterobacteriaceae, polegającego na tym, że:
a) te
30
zastrzeżone
aminokwasy
są
mikroorganizmy
hodowane
w
pożywce
wytwarzające
w
warunkach,
Lw
8
których
pożądany
L-aminokwas
jest
wzbogacony
w
pożywce lub w komórkach, i
b) ten
L-aminokwas
składnikami
jest
pożywki
izolowany,
opcjonalnie
fermentacyjnej
i/lub
ze
biomasą
pozostającymi w całości lub w części (od ≥ do 100%)
5
w
izolowanym
produkcie
lub
będącymi
całkowicie
usuniętymi.
Mikroorganizmy,
które
posiadają
ulegającą
nadekspresji otwartą ramkę odczytu (ORF) oznaczoną jako
10
yaaU, i które w szczególności są rekombinowane, wchodzą
również w zakres niniejszego wynalazku, mogą wytwarzać
te
L-aminokwasy
z
glukozy,
sacharozy,
laktozy,
fruktozy, maltozy, melasy, ze skrobi, jeśli jest to
właściwe i z celulozy, jeśli jest to właściwe, lub z
15
glicerolu
lub
przedstawicielami
etanolu.
rodziny
Mikroorganizmy
Enterobacteriaceae
są
i
są
wybrane z rodzaju Escherichia, Erwinia, Providencia i
Serratia. Korzystne są rodzaje Escherichia i Serratia.
Wspomniany
20
może
być
gatunek
Escherichia
coli,
w
szczególności w przypadku rodzaju Escherichia, podczas
gdy gatunek Serratia marcescens może być wspomniany, w
szczególności, w połączeniu z rodzajem Serratia.
Ogólnie,
25
rekombinowane
otrzymywane
poprzez
koniugację,
lub
mikroorganizmy
transformację,
poprzez
są
transdukcję
połączenie
tych
metod,
lub
z
użyciem wektora, który zawiera pożądaną ORF, pożądany
gen, allel tej ORF lub tego genu, lub ich fragmenty,
i/lub promotor, który wzmacnia ekspresję ORF lub genu.
Ten
30
promotor
otrzymany
może
przez
być
promotorem,
wzmacniającą
mutację
który
z
został
endogennej
sekwencji regulatorowej zlokalizowanej na lewo od genu
9
lub
ORF;
alternatywnie,
gen
lub
ORF
został
poddany
fuzji z wydajnym promotorem.
Przykładami
odpowiednich
szczególności,
5
Escherichia,
wytwarzają
w
szczepów,
które,
L-treoninę,
szczególności
z
z
gatunku
w
rodzaju
Escherichia
coli, są:
−
Escherichia coli H4581
(EP0301572)
−
Escherichia coli KY10935
(Bioscience
Biotechnology
61(11):1877-1882
10
15
and
Biochemistry
(1997)
−
Escherichia coli VNIIgenetica MG422 (US-A-4278765)
−
Escherichia coli VNIIgenetica M1
−
Escherichia coli VNIIgenetica 472T23 (US-A-5631157)
−
Escherichia coli BKIIM B-3996
(US-A-5175107)
−
Escherichia coli cat 13
(WO 98/04715)
−
Escherichia coli KCCM-10132
(WO 00/09660)
(US-A-4321325)
Przykładami odpowiednich szczepów wytwarzających Ltreoninę z rodzaju Serratia, w szczególności z gatunku
Serratia marcescens, są:
20
−
Serratia
marcescens
HNr21
(Applied
and
Environmental Microbiology 38(6): 1045-1051 (1979))
−
Serratia marcescens TLr156 (Gene 57(2-3): 151-158
(1987))
−
25
Serratia
marcescens
T-2000
(Applied
Biochemistry
and Biotechnology 37(3): 255-265 (1992))
Szczepy
produkujące
L-treoninę
z
rodziny
Enterobacteriaceae korzystnie posiadają, między innymi,
jedną
lub
wybranych
30
więcej
z
cech
grupy:
genetycznych
oporność
na
lub
kwas
fenotypowych
α-amino-β-
hydroksywalerianowy, oporność na tializynę, oporność na
10
etioninę, oporność na α-metyloserynę, oporność na kwas
diaminobursztynowy, oporność na kwas α-aminobutyrowy,
oporność
na
borrelidynę,
cyklopentanokarboksylowy,
5
oporność
na
na
kwas
rifampicynę,
oporność na analogi waliny, takie jak hydroksaminian
waliny,
oporność
na
analogi
puryny,
dimetyloaminopuryna,
wymaganie
częściowe
się
i
izoleucyny,
10
oporność
dające
wymaganie
takie
L-metioniny,
skompensować
kwasu
jak
6-
możliwe
wymaganie
L-
mezodiaminopimelinowego,
autotrofia w odniesieniu do dwupeptydów zawierających
treoninę, oporność na L-treoninę, oporność na rafinat
treoniny,
oporność
na
L-homoserynę,
oporność
na
L-
lizynę, oporność na L-metioninę, oporność na kwas Lglutaminowy, oporność na L-asparaginian, oporność na L15
leucynę, oporność na L-fenyloalaninę, oporność na Lserynę, oporność na L-cysteinę, oporność na L-walinę,
wrażliwość
na
dehydrogenaza
treoniny,
wykorzystania
20
fluoropirogronian,
możliwa
sacharozy,
treoninowego,
wzmocnienie
defektywna
zdolność
wzmocnienie
kinazy
do
operonu
asparaginianowej
I
dehydrogenazy homoseryny I, korzystnie formy odpornej
na sprzężenie zwrotne, wzmocnienie kinazy homoseryny,
wzmocnienie
syntazy
treoniny,
wzmocnienie
kinazy
asparaginianu, możliwie formy odpornej na sprzężenie
25
zwrotne,
wzmocnienie
aspraraginianu,
dehydogenazy
wzmocnienie
fosfoenolopirogronianu,
sprzężenie
zwrotne,
fosfoenolopirogronianu,
30
możliwie
semialdehydu
karboksylazy
formy
wzmocnienie
wzmocnienie
odpornej
na
syntazy
transhydrogenazy,
wzmocnienie produktu genu RhtB, wzmocnienie produktu
genu RhtC, wzmocnienie produktu genu YfiK, wzmocnienie
11
karboksylazy pirogronianu i atenuacja tworzenia kwasu
octowego.
Stwierdzono, że po nadekspresji genu lub otwartej
ramki
5
odczytu
(ORF)
yaaU
lub
jego
alleli,
mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzają
w
sposób
udoskonalony
L-lizynę,
L-walinę
lub
L-
treoninę.
Sekwencje
odczytu
10
techniki
nukleotydowe
(ORFs)
i
u
mogą
genów
Escherichia
być
lub
coli
uzyskane
z
otwartych
należą
sekwencji
ramek
do
stanu
genomowej
Escherichia coli opublikowanej przez Blattner i wsp.
(Science 277:1453-1462 (1997)). Wiadomo, że endogenne
enzymy
(aminopeptydaza
metioniny)
są
zdolne
do
odcinania metioniny jako aminokwasu N-końcowego.
15
Sekwencje
nukleotydowe
dla
yaaU-ORF
z
Shigella
flexneri i Salmonella typhimurium, które również należą
do rodziny Enterobacteriaceae zostały także ujawnione.
ORF
yaaU
z
Escherichia
coli
K12
jest
opisana,
między innymi, przez następujące dane:
20
Oznaczenie:
otwarta ramka odczytu
Funkcja:
opisana
jako
przypuszczalne
transportujące,
(główna
członek
25
błonowych.
różnią
zawiera
30
się
białek
Transportowane
znacząco;
transportery
i
transportery
potasu
transportery
dla
MFS
transporterów
disacharydów
kwasów
rodziny
nadrodzina
wspomagających)
białko
substancje
rodzina
MFS
monosacharydów,
oligosacharydów,
i
aminokwasów,
intermediatów
trikarboksylowych
a
cyklu
także
12
transportery,
które
wypompowują
antybiotyki z komórek.
Opis:
otwarta
ramka
białko
5
o
odczytu
masie
izoelektryczny
yaaU
48,7
wynosi
koduje
kDa;
8,8,
punkt
gdy
yaaU
jest zlokalizowana na chromosomie, jest
obecna,
na
przykład,
w
przypadku
Escherichia coli K12 MG1655, w regionie
10
międzygenowym
genów
długi
łańcuch
karbamoilofosforanu
carB
kodującego
syntazy
i
kefC
kodującego
białko systemu wypływu potasu K(+)/H(+)
regulowanego glutationem;
Referencja:
Blattner
15
i
wsp.;
Science
277(5331):1453-1474 (1997)
Nr dostępu:
AE000114
Alternatywna nazwa genu: B0045
Sekwencje
20
danych
kwasu
należących
nukleinowego
do
można
Narodowego
uzyskać
Centrum
z baz
Informacji
Biotechnologicznej (National Center for Biotechnology
Information, NCBI) przy Narodowej Bibliotece Medycznej
(National Library of Medicine, Bethesda, MD, USA), bazy
danych
25
sekwencji
kwasów
nukleinowych
Europejskich
Laboratoriów Biologii Molekularnej (European Molecular
Biology
Laboratories,
EMBL,
Heidelberg,
Niemcy
lub
Cambridge, UK) lub japońskiej bazy danych DNA (DDBJ,
Mishima, Japonia).
Ze
30
względu
sekwencję
na
nukleotydową
większą
yaaU-ORF
przejrzystość,
z
Escherichia
znaną
coli
podano w SEK ID NR 3 a znane sekwencje yaaU-ORF z
13
Shigella flexneri (AE015041) i Salmonella typhimurium
(AE008697) podano odpowiednio w SEK ID NR 5 i SEK ID NR
7. Sekwencje aminokwasowe białek kodowanych przez te
ramki odczytu są przedstawione odpowiednio jako SEK ID
5
NR 4, SEK ID NR 6 i SEK ID NR 8.
Otwarte
ramki
odczytu
opisane
we
wskazanych
miejscach mogą być stosowane w zgodzie z wynalazkiem.
Ponadto, możliwe jest użycie alleli genów lub otwartych
ramek odczytu, które wynikają ze zdegenerowania kodu
10
genetycznego lub są wynikiem funkcjonalnie neutralnych
mutacji
typu
endogennych
zmiany
genów
sensu.
lub
Pierwszeństwo
endogennych
ma
otwartych
użycie
ramek
odczytu.
„Endogenne
15
geny”
lub
„endogenne
sekwencje
nukleotydowe” są rozumiane jako geny lub otwarte ramki
odczytu lub allele lub sekwencje nukleotydowe, które są
obecne w populacji gatunku.
Odpowiednie
funkcjonalnie
20
obejmują,
allele
yaaU-ORF,
neutralne
między
mutacje
innymi,
te,
które
typu
które
zawierają
zmiany
prowadzą
sensu,
do
nie
więcej niż 50 lub nie więcej niż 40 lub nie więcej niż
30 lub nie więcej niż 20, korzystnie do nie więcej niż
10 lub nie więcej niż 5, szczególnie korzystnie do nie
więcej niż 3 lub nie więcej niż 2, lub przynajmniej
25
jednej substytucji konserwatywnego aminokwasu w białku,
które kodują.
W przypadku aminokwasów aromatycznych, substytucje
są rozumiane jako konserwatywne, jeżeli fenyloalanina,
30
tryptofan
i
przypadku
aminokwasów
rozumiane
tyrozyna
jako
są
zamienione
hydrofobowych,
konserwatywne,
nawzajem.
W
substytucje
są
jeżeli
leucyna,
14
izoleucyna
i
przypadku
aminokwasów
rozumiane
jako
asparagina
5
walina
są
są
podstawione
polarnych,
konserwatywne,
podstawione
nawzajem.
substytucje
jeżeli
nawzajem.
glutamina
W
W
są
i
przypadku
aminokwasów zasadowych, substytucje są rozumiane jako
konserwatywne, jeżeli arginina, lizyna i histydyna są
podstawione
nawzajem.
W
przypadku
aminokwasów
kwasowych, substytucje są rozumiane jako konserwatywne,
jeżeli
10
kwas
podstawione
asparaginowy
nawzajem.
zawierających
grupę
i
kwas
W
glutaminowy
przypadku
hydroksylową,
są
aminokwasów
substytucje
są
rozumiane jako konserwatywne, jeżeli seryna i treonina
są podstawione nawzajem.
W
15
ten
sam
sposób
jest
również
możliwe
użycie
sekwencji nukleotydowych, które kodują warianty tych
białek,
które
wydłużenie
lub
to
warianty
skrócenie
dodatkowo
przynajmniej
o
zawierają
jeden
(1)
aminokwas na końcu N lub końcu C. To wydłużenie lub
skrócenie liczy nie więcej niż 50, 40, 30, 20, 10, 5,
20
3, lub 2 aminokwasy lub reszty aminokwasowe.
Odpowiednie allele także zawierają te, które kodują
białka,
w
których
przynajmniej
jeden
(1)
aminokwas
uległ insercji lub delecji. Maksymalna liczba takich
zmian, określanych jako „indel”, może dotyczyć 2, 3, 5,
25
10, 20, ale w żadnym wypadku więcej niż 30 aminokwasów.
Odpowiednie allele obejmują ponadto te, które mogą
być uzyskane technikami hybrydyzacji, w szczególności w
ostrych warunkach, przy użyciu SEK ID NR 3, SEK ID NR 5
lub SEK ID NR 7 lub ich fragmentów, w szczególności
30
regionów kodujących lub sekwencji, które są do nich
komplementarne.
15
Specjalista w tej dziedzinie znajdzie instrukcje do
identyfikacji
między
innymi,
Guide
5
sekwencji
for
i
„The
Hybridization”
Mannheim
wsp.
technikami
podręczniku
Filter
Boehringer
Liebl
w
DNA
GmbH
DIG
System
Users
dostarczonym
przez
(Mannheim,
(International
hybrydyzacji,
Niemcy,
Journal
of
1993)
i
Systematic
Bacteriology 41: 255-260 (1991)). Hybrydyzacja zachodzi
w ostrych warunkach, w których powstającymi hybrydami
są
10
te,
w
których
polinukleotydy
przynajmniej
sonda
i
sekwencja
traktowane
w
80%.
sondą,
że
Wiadomo,
docelowa,
są
tj.
identyczne
ostrość
warunków
hybrydyzacji, włączając etapy płukania, ulega wpływowi
lub
jest
determinowana
temperatury
15
i
przez
stężenia
zmianę
soli.
składu
buforu,
Ogólnie,
reakcja
hybrydyzacji jest przeprowadzana w warunkach, których
ostrość jest względnie niska w porównaniu z tą z etapów
płukania (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited,
Teddington, UK, 1996).
Na przykład, do reakcji hybrydyzacji w temperaturze
20
w
przybliżeniu
50ºC
-
68ºC
może
być
użyty
bufor
odpowiadający buforowi 5× SSC. W tych warunkach sondy
mogą
także
posiadają
hybrydyzować
mniej
niż
70%
z
polinukleotydami,
identyczności
z
które
sekwencją
sondy. Te hybrydy są mniej stabilne i są usuwane przez
25
płukanie w ostrych warunkach. Może to być osiągnięte,
na przykład, przez obniżenie stężenia soli do 2× SSC i,
kiedy jest to odpowiednie, następnie do 0,5× SSC (The
DIG
System
Boehringer
30
User’s
Guide
Mannheim,
for
Filter
Mannheim,
Hybridization,
Niemcy,
1995)
z
temperaturami ustawionymi do około 50ºC - 68ºC, około
52ºC - 68ºC, około 54ºC - 68ºC, około 56ºC - 68ºC,
16
około 58ºC - 68ºC, około 60ºC - 68ºC, 62ºC - 68ºC,
około 64ºC - 68ºC, około 66ºC - 68ºC. Korzystne są
zakresy temperatur około 64ºC - 68ºC lub 66ºC - 68ºC.
Jeżeli
5
jest
to
stosowne,
możliwe
jest
zmniejszenie
stężenia soli do stężenia odpowiadającego 0,2× SSC lub
0,1×
SSC.
Poprzez
stopniowe
zwiększanie
temperatury
hybrydyzacji, w krokach około 1 - 2ºC, od 50ºC do 68ºC,
możliwe jest wyizolowanie fragmentów polinukleotydów,
które,
10
na
przykład,
posiadają
przynajmniej
80%,
lub
przynajmniej 90%, przynajmniej 91%, przynajmniej 92%,
przynajmniej 93%, przynajmniej 94%, przynajmniej 95%,
przynajmniej 96%, przynajmniej 97%, przynajmniej 98%,
lub
przynajmniej
99%
z
identyczności
sekwencją
zastosowanej sondy, lub z sekwencjami nukleotydowymi
15
pokazanymi w SEK ID NR 3, SEK ID NR 5 lub SEK ID NR 7.
Dodatkowe instrukcje do hybrydyzacji mogą być uzyskane
komercyjnie
w
postaci,
która
jest
określana
jako
zestawy (np. DIG Easy Hyb z Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim,
20
Niemcy,
Nr
kat.
1603558).
Sekwencje
nukleotydowe, które są uzyskane w ten sposób, kodują
polipeptydy
posiadające
przynajmniej
90%,
w
szczególności przynajmniej 95%, korzystnie przynajmniej
98% lub przynajmniej 99%, szczególnie korzystnie 99,7%
identyczności z sekwencjami aminokwasowymi pokazanymi w
25
SEK ID NR 4, SEK ID NR 6 lub SEK ID NR 8.
W
celu
przykład,
otrzymania
zwiększenie
wzmocnienia
ekspresji
możliwe
genów
lub
jest,
na
otwartych
ramek odczytu lub alleli lub zwiększenie właściwości
katalitycznych
30
białka.
Obydwie
połączone, jeżeli jest to stosowne.
metody
mogą
być
17
W
celu
uzyskania
nadekspresji,
może
być,
na
przykład, zwiększona liczba kopii odpowiednich genów
lub
otwartych
ramek
odczytu
lub
zmutowany
region
promotorowy i region regulatorowy lub miejsce wiązania
5
rybosomu,
które
jest
zlokalizowane
na
lewo
od
genu
strukturalnego. Kasety ekspresyjne, które są włączone
na
lewo
od
sposób.
Możliwe
trakcie
10
genu
strukturalnego
jest
także
fermentacyjnej
działają
zwiększenie
produkcji
w
podobny
ekspresji
L-treoniny
w
przez
włączenie promotorów indukowalnych; ponadto, korzystne
może być zastosowanie promotorów, które pozwalają na
ekspresję
genu
zróżnicowaną
w
czasie.
Podobnie,
ekspresja genu jest polepszana poprzez stosowanie metod
pozwalających na wydłużenie okresu życia mRNA. Ponadto,
15
aktywność
enzymatyczna
jest
także
wzmacniana
przez
ochronę białka enzymatycznego przez zniszczeniem. ORFs,
geny
lub
konstrukty
genowe
mogą
być
obecne
albo
w
plazmidach posiadających różne liczby kopii albo być
zintegrowane,
20
i
namnożone,
w
chromosomie.
Alternatywnie, nadekspresja genów będących przedmiotem
zainteresowania może być także uzyskana przez zmianę
składu pożywek i sposobu prowadzenia hodowli.
Sposoby nadekspresji są odpowiednio opisane tle w
stanie
25
techniki,
na
przykład
w
Makrides
i
wsp.
(Microbiological Revies 60 (3), 512-538 (1996)). Użycie
wektorów zwiększa liczbę kopii przynajmniej o jedną (1)
kopię. Użyte wektory mogą być plazmidami, jak opisano,
na przykład, w patencie USA 5538873. Użyte wektory mogą
być również fagami, na przykład fagiem Mu, jak opisano
30
w EP 0332448, lub fagiem lambda (λ). Liczba kopii może
być również zwiększona przez dodanie dodatkowej kopii
18
do
innego
miejsca
miejsca
att
na
λ
faga
chromosomie,
(Yu
i
na
Court,
przykład
Gene
223,
do
77-
81 (1998)). Patent USA 5939307 podaje, że możliwe było
zwiększenie
5
ekspresji
przez
włączenie
kaset
ekspresyjnych lub promotorów, takich jak promotor tac,
promotor
trp,
promotor
lpp,
lub
promotor
PL
lub
promotor PR faga λ, na lewo od, na przykład, operonu
treoninowego
sposób
10
położonego
możliwe
promotorów
jest
gearbox
na
chromosomie.
użycie
lub
W
promotorów
promotora
nar.
ten
sam
faga
T7,
Takie
kasety
ekspresyjne lub promotory, mogą być także użyte, jak
opisano w EP 0593792, do nadekspresji genów położonych
na
plazmidzie.
Z
kolei
użycie
allelu
lacIQ
czyni
możliwym kontrolowanie ekspresji genów położonych na
15
plazmidzie
(Glascock
i
Weickert,
Gene
223,
221-231
(1998)). Ponadto możliwe jest, aby aktywność promotorów
była zwiększona przez modyfikację ich sekwencji poprzez
jedną
lub
większą
liczbę
substytucji
nukleotydów,
poprzez insercję(e) i/lub delecję(e). Zróżnicowana w
20
czasie ekspresja genu może być uzyskana, na przykład,
jak opisano w Walker i wsp. (Journal of Bacteriology
181:
1269-80
(1999),
poprzez
użycie
promotora
fis
zależnego od fazy wzrostu.
Specjalista
25
w
tej
dziedzinie
może
znaleźć
ogólne
instrukcje w tym zakresie, między innymi, w Chang i
Cohen (Journal of Bacteriology 134: 1141-1156 (1978)),
Hartley i Gregori (Gene 13: 347-353 1981)), Amann i
Brosius (Gene 40: 183-190 (1985)), de Broer i wsp.
(Proceedings of the National Academy of Sciences of the
30
United States of America 80: 21-25 (1983)), LaVallie i
wsp.
(BIO/TECHNOLOGY
11:
187-193
(1993))
w
19
PCT/US97/13359,
Llosa
(1991)),
i
Quandt
i
wsp.
Klipp
(Plasmid
(Gene
80:
26:
222-224
161-169
(1989)),
Hamilton i wsp. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622
(1989)),
5
Jensen
Bioengineering
i
Hammer
58:
(Biotechnology
191-195
(1998))
i
and
znanych
podręcznikach genetyki i biologii molekularnej.
Użyte mogą być wektory plazmidowe, które mogą być
namnożone w Enterobacteriaceae, takie jak wektory do
klonowania wywodzące się z pACYC184, (Bartolomé i wsp.;
10
Gene 102: 75-78 (1991)), pTrc99A (Amann i wsp.; Gene
69:
301-315
(1988))
lub
pochodne
pSC101
(Vocke
i
Bastia; Proceedings of the National Academy of Sciences
USA
80(21):
wynalazku
15
6557-6561
jest
możliwe
transformowany
(1983)).
użycie
wektorem
W
sposobie
szczepu,
według
który
plazmidowym
jest
niosącym
przynajmniej jedną sekwencję nukleotydową, lub allel,
który koduje yaaU ORF lub jej produkt genowy.
Określenie
„transformacja”
jest
rozumiane
jako
sposób pobrania wyizolowanego kwasu nukleinowego przez
20
gospodarza (mikroorganizm).
Możliwe jest także zastosowanie wymiany sekwencji
(Hamilton i wsp.; Journal of Bacteriology 171: 46174622 (1989)), koniugacji lub transdukcji do transferu
do
25
różnych
szczepów
mutacji,
które
wpływają
na
ekspresję danych genów lub otwartych ramek odczytu.
Bardziej szczegółowe wyjaśnienia pojęć genetyki i
biologii
molekularnej
podręcznikach
mogą
Birge
być
znalezione
(Bacterial
i
w
znanych
Bacteriophage
Genetics, 4-ta ed., Springer Verlag, Nowy Jork, (USA),
30
2000)
lub
podręczniku
(Biochemistry,
5-ta
ed.,
Berg,
Tymoczko
Freeman
and
i
Stryjer
Company,
Nowy
20
Jork,
(USA),
(Molecular
tomowy),
2002)
Cloning,
Cold
lub
A
Spring
podręczniku
Laboratory
Harbor
Sambrook
Manual,
Laboratory
i
wsp.
(zestaw
Press,
3-
Cold
Spring Harbor (USA), 2001).
5
Ponadto,
przy
użyciu
szczepów
z
rodziny
Enterobacteriaceae do produkcji L-lizyny, L-waliny lub
L-treoniny,
korzystna
może
być,
oprócz
nadekspresji
otwartej ramki odczytu yaaU, nadekspresja jednego lub
większej liczby enzymów ze znanej ścieżki biosyntezy
10
treoniny lub enzymów metabolizmu anaplerotycznego lub
enzymów
do
produkcji
dinukleotydu
zredukowanego
nikotynoamidoadeninowego
fosforanu
lub
enzymów
glikolitycznych lub enzymów PTS lub enzymów metabolizmu
siarki.
15
Ogólnie
korzystne
jest
endogennych
używanie
genów.
Zatem,
możliwa
nadekspresja,
jest,
jednego
na
lub
przykład,
większej
jednoczesna
liczby
genów
wybranych z grupy
•
20
przynajmniej
jeden
gen
operonu
thrABC
kinazę
asparaginianu,
dehydrogenazę
kinazę
homoseryny
syntazę
i
kodującego
homoseryny,
treoniny
(US-A-
4278765),
•
gen
pyc
z
Corynebacterium
glutamicum
kodujący
karboksylazę pirogronianu (WO 99/18228)
25
•
gen
pps
(Molecular
kodujący
and
syntazę
General
fosfoenolopirogronianu
Genetics
231(2):
332-336
(1992)),
•
gen
ppc
kodujący
fosfoenolopirogronianu (WO 02/064808),
karboksylazę
21
•
geny
pntA
i
transhydrogenazy
pntB
kodujące
pirydynowej
podjednostki
(European
Journal
of
Biochemistry 158: 647-653 (1986)),
•
5
gen rhtB kodujący białko pośredniczące w oporności
na homoserynę (EP-A-0994190),
•
gen rhtC kodujący białko pośredniczące w oporności
na treoninę (EP-A-1013765),
•
gen
thrE
z
Corynebacterium
glutamicum
kodujący
białko nośnikowe eksportu treoniny (WO 01/92545),
10
•
gen
gdhA
kodujący
dehydrogenazę
glutaminianu
(Nucleic Acids Research 11: 5257-5266 (1983); Gene
23: 199-209 (1983)),
•
gen pgm kodujący fosfoglukomutazę (WO 03/004598),
•
gen fba kodujący aldolazę bifosforanu fruktozy (WO
15
03/004664),
•
gen ptsH operonu ptsHIcrr kodujący fosfotransferazę
fosfohistydyna-białko-heksoza
z
systemu
fosfotranferazy PTS (WO 03/004674),
•
20
gen
ptsI
operonu
ptsHIcrr
kodujący
enzym
I
z
systemu fosfotransferazy PTS (WO 03/004674),
•
gen
crr
operonu
ptsHIcrr
kodujący
glukozo-
specyficzny składnik IIA z systemu fosfotransferazy
PTS (WO 03/004674),
•
25
gen ptsG kodujący glukozo-specyficzny składnik IIBC
(WO 03/004670),
•
gen lrp kodujący regulator regulonu leucynowego (WO
03/004665),
•
gen
fadR
03/038106),
kodujący
regulator
regulonu
fad
(WO
22
•
gen iclR kodujący regulator centralnego metabolizmu
pośredniczącego (WO 03/038106),
•
gen ahpC operonu ahpCF kodujący małą podjednostkę
reduktazy
5
wodoronadtlenków
alkilowych
(WO
03/004663),
•
gen ahpF operonu ahpCF kodujący dużą podjednostkę
reduktazy
wodoronadtlenków
alkilowych
(WO
03/004663),
•
10
gen
cysK
kodujący
syntazę
cysteiny
A
(WO
cys
(WO
03/006666),
•
gen
cysB
kodujący
regulator
regulonu
03/006666),
•
gen
cysJ
operonu
cysJIH
kodującego
flawoproteinę
reduktazy NADPH-siarczyn (WO 03/006666),
15
•
gen
cysI
operonu
cysJIH
kodującego
hemoproteinę
reduktazy NADPH-siarczyn (WO 03/006666),
•
cysH
gen
operonu
cysJIH
kodującego
reduktazę
adenylan-siarczan (WO 03/006666),
•
20
gen rseA operonu rseABC kodującego błonowe białko,
które posiada aktywność anty-sigmaE (WO 03/008612),
•
gen
rseC
operonu
rseABC
kodującego
globalny
regulator czynnika sigmaE (WO 03/008612),
•
gen
sucA
operonu
sucABCD
kodującego
podjednostkę
dekarboksylazy z dehydrogenazy 2-ketoglutaranu (WO
25
03/008614),
•
gen sucB operonu sucABCD kodującego podjednostkę E2
sukcynylotransferazy dihydrolipoilu z dehydrogenazy
2-ketoglutaranu (WO 03/008614),
•
30
gen sucC operonu suc ABCD kodujący podjednostkę β
syntazy sukcynylo-CoA (WO 03/008615),
23
•
gen
sucD
operonu
sucABCD
kodujący
podjednostkę
α
syntazy sukcynylo-CoA (WO 03/008615),
•
gen
aceE
kodujący
składnik
E1
kompleksu
dehydrogenazy pirogronianu (WO 03/076635),
5
•
gen
aceF
kodujący
składnik
E2
kompleksu
dehydrogenazy pirogronianu (WO 03/076635),
•
gen
rseB
SigmaE
regulator
kodujący
(Molecular
aktywności
Microbiology
czynnika
24(2):
355-371
(1997)),
10
•
produkt genowy otwartej ramki odczytu (ORF) yodA z
Escherichia
Narodowym
coli
(Numer
Centrum
Dostępu
Informacji
AE000288
w
Biotechnologicznej
(NCBI, Bethesda, MD, USA, DE10361192.4)).
Ponadto,
15
w
celu
produkcji
L-aminokwasów,
w
szczególności L-treoniny, korzystna może być, oprócz
wzmocnienia otwartej ramki odczytu yaaU, atenuacja, w
szczególności
eliminacja
lub
zmniejszenie
ekspresji
jednego lub więcej genów wybranych z grupy obejmującej:
•
20
gen tdh kodujący dehydrogenazę treoniny (Journal of
Bacteriology 169: 4716-4721 (1987)),
•
gen
mdh
kodujący
1.1.1.37)
dehydrogenazę
(Archives
in
jabłczanu
Microbiology
(E.C.
149:36-42
(1987)),
•
25
produkt genowy otwartej ramki odczytu (ORF) yjfA z
Escherichia
Narodowym
coli
Centrum
(Numer
Dostępu
Informacji
AAC77180
w
Biotechnologicznej
(NCBI, Bethesda, MD, USA, (WO 02/29080)),
•
produkt genowy otwartej ramki odczytu (ORF) ytfP z
Escherichia
coli
(Numer
Dostępu
AAC77179
w
24
Narodowym
Centrum
Informacji
Biotechnologicznej
(NCBI, Bethesda, MD, USA, (WO 02/29080)),
•
gen
pckA
kodujący
enzym
karboksykinazę
fosfoenolopirogronianu (WO 02/29080),
5
•
gen
poxB
oksydazę
kodujący
pirogronianu
(WO
02/36797),
•
gen dgsA (WO 02/081721), który jest także znany pod
nazwą
gen
mlc,
kodujący
regulator
DgsA
systemu
fosfotransferazy,
10
•
gen fruR (WO 02/081698), który jest także znany pod
nazwą gen cra, kodujący represor fruktozy,
•
gen rpoS (WO 01/05939), który jest znany także pod
nazwą gen katF, kodujący czynnik sigma38, i
•
15
gen
aspA
kodujący
liazę
asparaginian-amoniak
(WO
03/008603).
W
tym
obniżenie
kontekście,
lub
określenie
zniesienie
„atenuacja”
w
opisuje
mikroorganizmie
wewnątrzkomórkowej aktywności lub stężenia jednego lub
większej ilości enzymów lub białek, które są kodowane
20
przez
odpowiedni
DNA
poprzez,
na
przykład,
użycie
promotora słabszego niż ten w szczepie rodzicielskim
lub
mikroorganizmie
nie
rekombinowanym
pod
względem
odpowiedniego genu lub białka, lub genu lub allelu,
który koduje odpowiedni enzym lub białko posiadające
25
mniejszą aktywność, lub inaktywację odpowiedniego genu
lub białka, lub otwartej ramki odczytu lub genu, i,
jeśli jest to stosowne, poprzez połączenie tych metod.
Ogólnie, metody atenuacji zmniejszają aktywność lub
stężenie odpowiedniego białka do poziomu od 0 do 75%,
30
od 0 do 50%, od 0 do 25%, od 0 do 10% lub od 0 do 5%
aktywności
lub
stężenia
białka
typu
dzikiego
lub
25
stężenia
białka
w
mikroorganizmie,
szczepie
który
nie
rodzicielskiem
jest
lub
rekombinowany
pod
względem odpowiedniego enzymu lub białka. Przez szczep
5
rodzicielski
lub
mikroorganizm,
rekombinowany
rozumie
się
który
nie
mikroorganizm,
na
jest
którym
wykonywane są metody według wynalazku.
W celu uzyskania atenuacji, na przykład, ekspresja
genów
lub
otwartych
ramek
odczytu,
lub
katalityczne
właściwości białek enzymatycznych, mogą być zmniejszone
10
lub zniesione. Jeżeli jest to właściwe, obie metody
mogą być połączone.
Ekspresja
traktowanie
genetyczną
15
genu
może
hodowli
w
zmianę
regulujących
regulującymi
genu
RNA.
ekspresję
zmniejszona
odpowiedni
(zmutowanie)
ekspresję
antysensownego
być
sposób,
struktur
lub
są,
na
przez
sygnałowych
stosując
Strukturami
genu
przez
technikę
sygnałowymi
przykład,
geny
represorowe, geny aktywatorowe, operatory, promotory,
atenuatory,
20
miejsca
wiążące
rybosom,
kodon
start
i
terminatory. Specjalista w tej dziedzinie może znaleźć
informacje w tym względzie, między innymi, w Jensen i
Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195
(1998)), w Carrier i Keasling (Biotechnology Progress
15: 58-64 (1999)), w Franch i Gerdes (Current Opinion
25
in Microbiology 3: 159-164 (2000)) i w dobrze znanych
podręcznikach genetyki i biologii molekularnej, takich
jak podręcznik autorstwa Knippers („Molekulare Genetik
[Molecular
Verlag,
30
Winnacker
Genetics]”,
Stuttgart,
(Gene
und
wydanie
Niemcy,
Klone
6-te,
1995)
[Genes
and
Georg
lub
Thieme
autorstwa
Clones]”,
Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy, 1990).
VCH
26
Mutacje,
które
właściwości
znane
ze
prowadzą
katalitycznych
stanu
do
zmiany
białek
techniki.
lub
redukcji
enzymatycznych
Przykładami,
które
są
można
wymienić są artykuły autorstwa Qiu and Goodman (Journal
5
of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano i
wsp. (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 95: 5511-5515 (1998))
oraz
Wente
and
Schachmann
(Journal
of
Biological
Chemistry 266: 20833-20839 (1991)). Podsumowania można
10
znaleźć
w
znanych
molekularnej,
podręcznikach
takich
("Allgemeine
Genetik
jak
genetyki
ten
i
biologii
autorstwa
[General
Hagemann
Genetics]",
Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Mutacje, które mogą być rozważone są tranzycjami,
15
transwersjami,
jednej
(1)
insercjami
pary
zasad
i
lub
delecjami
przynajmniej
nukleotydu.
Zależnie
od
wpływu substytucji aminokwasowej wywołanej mutacją na
aktywność enzymu, odniesieniem są mutacje typu zmiany
sensu
20
lub
prowadzi
typu
do
nonsens.
zastąpienia
Mutacja
danego
typu
zmiany
aminokwasu
w
sensu
białku
innym aminokwasem, szczególnie, gdy zamiana aminokwasu
nie
jest
konserwatywna.
funkcjonalnej
zdolności
Powoduje
lub
to
uszkodzenie
aktywności
białka
i
prowadzi do obniżenia jej do wartości od 0 do 75%, od 0
25
do 50%, od 0 do 25%, od 0 do 10%, lub od 0 do 5%.
Mutacja typu nonsens prowadzi do pojawienia się kodonu
stop w regionie kodującym genu i w konsekwencji do
przedwczesnej
terminacji
translacji.
Insercje
lub
delecje przynajmniej jednej pary zasad w genie prowadzą
30
do
mutacji
prowadzi
do
typu
zmiany
włączenia
ramki
odczytu,
niewłaściwych
co
z
kolei
aminokwasów
lub
27
przedwczesnej
konsekwencji
mutacji
prowadzi
następnie
to
translacji.
5
terminacji
translacji.
utworzony
Delecje
do
jest
Jeżeli
kodon
przedwczesnej
przynajmniej
w
stop,
terminacji
jednego
(1)
lub
większej liczby zazwyczaj prowadzą także do całkowitej
utraty aktywności enzymatycznej.
Wskazówki do tworzenia tych mutacji należą do stanu
techniki i mogą być uzyskane ze znanych podręczników
genetyki i biologii molekularnej, takich jak podręcznik
10
autorstwa
Knippers
Genetics]”,
(„Molekulare
wydanie
6-te,
Genetik
Georg
[Molecular
Thieme
Verlag,
Stuttgart, Niemcy, 1995), autorstwa Winnacker „Gene und
Klone, [Genes and Clones]”, VHC Verlagsgesellschaft,
Weinheim,
15
Niemcy,
(„Allgemeine
1990)
Genetik
lub
[General
autorstwa
Hagemann
Genetics]”,
Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Odpowiednie mutacje w genach mogą być wprowadzone
do
odpowiednich
szczepów
poprzez
wymianę
genów
lub
alleli. Tradycyjnym sposobem jest sposób, opisany przez
20
Hamilton i wsp. (Journal of Bacteriology 171: 4617-4622
(1989)),
wymiany
genów
przy
użyciu
ulegającego
warunkowej replikacji wektora pSC101 wywodzącego się z
pMAK705. Mogą być także użyte inne sposoby, takie jak
ten z Martinez-Moralez i wsp. (Journal of Bacteriology
25
181: 7143-7148 (1999)) lub ten z Boyd i wsp. (Journal
of Bacteriology 182: 842-847 (2000)).
Podobnie,
mutacji
w
możliwe
odpowiednich
jest
również
genach,
lub
przeniesienie
mutacji,
które
wpływają na ekspresję odpowiednich genów lub otwartych
30
ramek odczytu przy użyciu koniugacji lub transdukcji.
28
Ponadto, w celu produkcji L-lizyny, L-waliny lub Ltreoniny,
korzystne
otwartej
ramki
może
być,
odczytu
oprócz
yaaU,
wzmocnienia
wyeliminowanie
niepożądanych reakcji ubocznych (Nykayama: „Breeding of
5
Amino Acid Producing Microorganisms” w: Overproduction
of
Microbial
Products,
Krumphanzl,
Sikyta,
Vanek
(red.), Academic Pres, Londyn, UK, 1982).
Mikroorganizmy,
wynalazku
10
mogą
które
być
są
hodowane
wytwarzane
w
procesie
według
okresowym,
procesie okresowym z zasilaniem, w odnawialnym procesie
okresowym
z
zasilaniem
(DE102004028859.3
lub
i
w
patent
procesie
USA
ciągłym
5763230).
Znane
sposoby hodowli są podsumowane w podręczniku autorstwa
Chmiel
15
(Bioprozesstechnik
Bioverfahrenstechnik
1.
Einführung
[Bioprocess
in
die
technology
1.
Introduction to bioprocess technology] (Gustav Fisher
Verlag, Stuttgart, 1991)) lub w podręczniku autorstwa
Storhas
(Bioreaktoren
[Bioreactors
20
and
und
periphere
peripheral
Einrichtungen
installations]
(Vieweg
Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).
Zastosowana
pożywka
hodowlana
musi
zaspokajać
potrzeby danych szczepów we właściwy sposób. Podręcznik
Amerykańskiego Towarzystwa Bakteriologii (ang. American
25
Society
for
General
Bacteriology”
zawiera
Bacteriology)
opisy
„Manual
(Washington
pożywek
do
of
Methods
D.C.
USA,
hodowli
for
1981)
różnych
mikroorganizmów.
Jako
źródło
węglowodany,
30
węgla
takie
jak
mogą
być
glukoza,
użyte
sacharoza,
cukry
i
laktoza,
fruktoza, maltoza, melasy, skrobia i, jeżeli jest to
właściwe, celuloza, oleje i tłuszcze, takie jak olej
29
sojowy, olej słonecznikowy, olej z orzechów ziemnych i
olej
kokosowy,
kwasy
tłuszczowe,
takie
jak
kwas
palmitynowy, kwas stearynowy, kwas linolowy, alkohole,
takie jak glicerol i etanol, i kwasy organiczne, takie
5
jak
kwas
octowy.
Substancje
te
mogą
być
użyte
pojedynczo lub jako mieszanina.
Jako
źródło
zawierające
azotu
azot
mogą
organiczny,
być
użyte
takie
związki
jak
peptony,
ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, ekstrakt słodowy,
10
Corn Steep Liquor, mąka sojowa i mocznik, lub związki
nieorganiczne,
takie
jak,
siarczan
amonu,
chlorek
amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu.
Źródła
azotu
mogą
być
użyte
pojedynczo
lub
jako
mieszanina.
Jako źródło fosforu może być użyty kwas fosforowy,
15
diwodorofosforan
lub
potasu
odpowiadające
pożywka
hodowlana
im
lub
sole
musi
wodorofosforan
zawierające
zawierać
dipotasu,
sód.
wymagane
do
Ponadto,
wzrostu
sole metali, takie jak siarczan magnezu lub siarczan
20
żelaza. W końcu, oprócz wyżej wymienionych substancji,
użyte mogą być niezbędne stymulatory wzrostu, takie jak
aminokwasy i witaminy. Do pożywki hodowlanej mogą być
także dodane odpowiednie prekursory. Składniki te mogą
być
25
dodane
do
hodowli
w
postaci
raz
przyrządzonej
mieszaniny lub być dodawane podczas hodowli stosownie
do potrzeb.
Na ogół fermentacja jest prowadzona przy pH od 5,5
do 9,0, w szczególności od 6,0 do 8,0. Do kontroli pH
hodowli używane są w razie potrzeby związki zasadowe,
30
takie
amoniak
jak
lub
wodorotlenek
woda
sodu,
amoniakalna,
wodorotlenek
lub
związki
potasu,
kwasowe,
30
takie jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Do kontroli
spienienia
estry
mogą
być
poliglikolu
użyte
i
antyspieniacze,
kwasu
takie
jak
W
celu
tłuszczowego.
utrzymania stabilności plazmidów do pożywki mogą być
5
dodane odpowiednie selektywnie działające substancje,
na
przykład
antybiotyki.
W
celu
utrzymania
warunków
aerobowych przez hodowle może być przepuszczany tlen
lub
mieszaniny
gazów
zawierające
tlen,
takie
jak
powietrze. Temperatura hodowli wynosi zazwyczaj od 25ºC
10
do 45ºC i korzystnie od 30ºC do 40ºC. Hodowla jest
prowadzona dopóki nie zostanie wytworzona maksymalna
ilość
L-aminokwasów
lub
L-treoniny.
Ten
cel
jest
zazwyczaj osiągnięty w ciągu 10 do 160 godzin.
L-aminokwasy
15
chromatografii
mogą
być
analizowane
jonowymiennej,
po
przy
której
użyciu
następuje
derywatyzacja ninhydryną, jak opisano w Spackman i wsp.
(Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)), lub przy
użyciu HPLC w odwróconych fazach, jak opisano w Lindoth
i wsp. (Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979)).
20
Sposób
według
wynalazku
może
być
użyty
do
fermentacyjnego wytwarzania L-aminokwasów, takich jak
L-treonina,
L-walina
i
L-lizyna,
w
szczególności
L-
treoniny.
Zgodnie z Traktatem Budapesztańskim do Niemieckiej
25
Kolekcji
Mikroorganizmów
i
Hodowli
Komórkowych
(Deutsche Sammlung für Mikroorganizmen und Zellkulturen
[German
collection
of
microorganisms
and
cell
cultures]) zdeponowano następujące mikroorganizmy:
•
30
Escherichia
16574.
coli
szczep
E.
coli
MG422
jako
DSM
31
Niniejszy
wynalazek
jest
bardziej
szczegółowo
wyjaśniony poniżej przy pomocy przykładów realizacji.
Pożywki
minimalna
(M9)
i
pełna
(LB)
używane
do
hodowli Escherichia coli są opisane przez J.H. Miller
5
(A
short
course
in
bacterial
genetics
(1992),
Cold
Spring Harbor Laboratory Press). Izolacja plazmidowego
DNA z Escherichia coli, a także inne techniki trawienia
enzymami
restrykcyjnymi,
ligacji
i
traktowania
fosfatazą Klenowa i alkaliczną fosfatazą, są wykonywane
10
jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning – A
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
Press).
nie
Jeżeli
wskazano
inaczej,
bakterie
Escherichia coli są transformowane jak opisano w Chung
i wsp. (Proceeding of the National Academy of Sciences
15
of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)).
Temperaturą
inkubacji
podczas
przygotowywania
szczepów i transformacji jest 37ºC.
Przykład 1
20
Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pTrc99AyaaU
ORF
yaaU
z
E.
coli
K12
namnożono
przy
użyciu
łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i syntetycznych
oligonukleotydów.
Biotech,
25
Startery
Ebersberg,
PCR
Niemcy)
na
zsyntetyzowano
podstawie
(MWG
sekwencji
nukleotydowej ORF yaaU w E. coli K12 MG1655 (Numer
Dostępu AE000114), Blattner i wsp. (Science 277: 14531474 (1997)). Sekwencje starterów zmodyfikowano tak,
aby
tworzyły
miejsca
rozpoznawane
przez
enzymy
restrykcyjne. Dla startera yaaU-ex1 wybrano sekwencję
30
rozpoznawaną
przez
EcoRI
a
dla
startera
yaaU-ex2
wybrano sekwencję rozpoznawaną przez BamHI, sekwencje
32
te
są
podkreślone
w
sekwencjach
nukleotydowych
pokazanych poniżej:
yaaU-ex1:
5’-GATCTGAATTCTAAGGAATAACCATGCAACCGTC-3’ (SEK ID NR 1)
5
yaaU-ex2:
5’-GATCTAGGATCCCAATTTACCCCATTCTCTGC-3’
Chromosomowy
DNA
z
E.
coli
K12
(SEK ID NR 2)
MG1655
użyty
do
reakcji PCR wyizolowano przy użyciu “Qiagen Genomictips 100/G” (QIAGEN, Hilden, Niemcy) według wskazówek
10
producenta. Fragment DNA o długości w przybliżeniu 1371
pz (SEK ID NR 3) może być namnożony w standardowych
warunkach
reakcji
Protocols.
A
PCR
Guide
(Innis
to
i
Methods
wsp.
and
(1990)
PCR
Applications,
Academic Press) przy użyciu polimerazy DNA Vent (New
15
England
Biolabs
GmbH,
Frankfurt,
Niemcy)
i
specyficznych starterów.
Namnożony fragment yaaU poddano ligacji z wektorem
pCR-Blunt
Invitrogen,
20
II-TOPO
(Zero
Groningen,
TOPO
Holandia)
TA
Cloning
według
Kit,
wskazówek
producenta i transformowano do szczepu E. coli TOP10.
Komórki niosące plazmid wyselekcjonowano na pożywce LB
Agar zawierającej kanamycynę w stężeniu 50 µg/ml. Po
wyizolowaniu plazmidowego DNA wektor pocięto enzymami
EcoRV i EcoRI i, po sprawdzeniu cięcia w 0,8% żelu
25
agarozowym, oznaczono jako pCRBluntyaaU.
Wektor
pCRBluntyaaU
następnie
pocięto
enzymami
EcoRI i BamHI a fragment yaaU rozdzielono w 0,8% żelu
agarozowym;
następnie
wyizolowano
go
z
żelu
(zestaw
QIAquick Gel Extraction Kit, QIAGEN, Hilden, Niemcy) i
30
poddano ligacji z wektorem pTrc99A (Pharmacia Biotech,
Upsala, Szwecja), który pocięto enzymami BamHI i EcoRI.
33
Szczep E. coli XL1Blue MRF’ (Stratagene, La Jolla, USA)
transformowano mieszaniną ligacyjną a komórki niosące
plazmid
wyselekcjonowano
na
pożywce
LB
agar
zawierającej ampicylinę w stężeniu 50 µg/ml.
To, że klonowanie zakończyło się pomyślnie może być
5
wykazane,
po
wyizolowaniu
plazmidu,
przez
wykonanie
kontrolnego trawienia przy użyciu enzymów EcoRI/BamHI i
EcoRV.
Plazmid oznaczono jako pTrc99AyaaU (Fig. 1).
10
Przykład 2
Wytwarzanie
L-treoniny
przy
użyciu
szczepu
MG422/pTrc99AyaaU
Szczep
15
E.
coli MG442
produkujący
L-treoninę
jest
opisany w zgłoszeniu patentowym US-A-4278765 i złożony
w
Rosyjskiej
Przemysłowych
Narodowej
(Russian
Kolekcji
Mikroorganizmów
national
collection
of
industrial microorganisms, VKPM, Moskwa, Rosja) jako
CMIM B-1628 i w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i
20
Hodowli
Komórkowych
(Deutsche
Sammlung
für
Mikroorganismen und Zellkulturen [German collection of
microorganisms
and
cell
cultures],
DSMZ,
Brunswick,
Niemcy), zgodnie z Traktatem Budapesztańskim, jako DSM
16574.)
25
Szczep MG422 transformowano plazmidem ekspresyjnym
pTrc99AyaaU
opisanym
w
przykładzie
1,
oraz
wektorem
pTrc99A, a komórki niosące plazmid wyselekcjonowano na
pożywce LB Agar zawierającej ampicylinę w stężeniu 50
µg/ml. W wyniku tego powstały szczepy MG422/pTrc99AyaaU
30
i MG422/pTrc99A. Wybrane pojedyncze kolonie następnie
namnożono
na
pożywce
minimalnej
posiadającej
34
następujący skład: 3,5 g Na2HPO4*2H2O/l, 1,5 g KH2PO4/l,
1
g
NH4Cl/l,
0,1
MgSO4*7H2O/l,
2
g
glukozy/l,
20
g
agaru/l, 05 mg ampicyliny/l.
Powstawanie
5
L-treoniny
sprawdzono
w
hodowlach
okresowych o objętości 10 ml, które są prowadzone w 100
ml kolbach typu Erlenmeyer. W tym celu, 10 ml pożywki
prehodowlanej o następującym składzie: 2 g ekstraktu z
drożdży/l,
10
MgSO4*7H2O/l,
10
g
15
(NH4)2SO4/l,
g
CaC03/l,
1
20
g
g
KH2PO4/l,
0,5
glukozy/l,
50
g
mg
ampicyliny/l, zaszczepiono i inkubowano w 37ºC i 180
obr./min przez 16 godzin w inkubatorze Kühner AG ESR
(Birsfelden, Szwajcaria). W każdym przypadku 250 µl tej
wstępnej
hodowli
produkcyjnej
15
(25
zaszczepiono
g
(NH4)2SO4/l,
do
2
10
g
ml
pożywki
KH2PO4/l,
1
g
MgSO4*7H2O/l, 0,03 g FeSO4*7H2O/l, 0,018 g MnSO4*1H2O/l,
30 g CaCO3/l, 20 g glukozy/l, 50 mg ampicyliny/l) i
inkubowano
w
37ºC
przez
48
godzin.
Powstawanie
L-
treoniny przez wyjściowy szczep MG442 sprawdzono w ten
sam sposób, jednakże bez ampicyliny dodanej do pożywki.
20
Po inkubacji oznaczono gęstość optyczną (OD) zawiesiny
hodowlanej za pomocą pomiaru przy długości fali 660 nm
z
użyciem
fotometru
Dr.
Lange
LP2W
(Düsseldorf,
Niemcy).
Następnie,
25
treoniny
w
do
oznaczenia
supernatancie
stężenia
hodowlanym,
powstałej
który
L-
został
wysterylizowany przez filtrację, zastosowano analizator
aminokwasów
wykorzystujący
Eppendorf-BioTronik
chromatografię
(Hamburg,
jonowymienną
Niemcy)
i
post-kolumnową obejmującą wykrywanie ninhydryny.
30
Wynik eksperymentu pokazano w tabeli 1.
reakcję
35
Tabela 1
Szczep
OD
L-treonina
(660 nm)
g/l
MG422
5,6
1,4
MG422/pTrc99A
3
1,3
MG422/pTrc99AyaaU
4,1
2,7
Krótki opis rysunku:
Fig.
5
1:
Mapa
plazmidu
pTrc99AyaaU
zawierającego
gen
yaaU.
Podane
długości
przybliżone.
powinny
Zastosowane
być
skróty
traktowane
i
oznaczenia
jako
mają
następujące znaczenia:
10
•
bla:
gen kodujący oporność na ampicylinę
•
lac Iq:
gen białko represorowe promotora trc
•
trc:
region
promotora
trc,
indukowany
za
pomocą IPTG
15
•
yaaU:
•
5S:
region 5S rRNA
•
rrnBT:
region terminatora rRNA
region kodujący gen yaaU
Skróty dla enzymów restrykcyjnych mają następujące
znaczenia:
•
BamHI:
endonukleaza
restrykcyjna
z
Bacillus
amyloliquefaciens H
20
•
EcoRI:
endonukleaza restrykcyjna z Escherichia
coli RY13
•
EcoRV:
coli B946
25
endonukleaza restrykcyjna z Escherichia
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
Zastrzeżenia patentowe
1.
Rekombinowany
Enterobacteriaceae,
5
mikroorganizm
który
z
zawiera
rodziny
ulegającą
nadekspresji ORF yaaU kodującą polipeptyd opisany jako
przypuszczalny transporter cukru, przez co sekwencja
aminokwasowa
tego
peptydu
jest
przynajmniej
w
90%
identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy SEK
ID NR 4, SEK ID 6 i SEK ID NR 8.
10
2.
Mikroorganizm
według
zastrz.
1,
znamienny
tym, że zawiera ulegający nadekspresji polinukleotyd,
który jest wybrany z grupy obejmującej:
a)
polinukleotyd
posiadający
sekwencję
nukleotydową wybraną z SEK ID NR 3, SEK ID NR 5 lub SEK
15
ID NR 7;
b)
polinukleotyd
posiadający
sekwencję
nukleotydową, która jest zgodna z SEK ID NR 3, SEK ID
NR 5 lub SEK ID NR 7 w granicach zdegenerowania kodu
genetycznego;
20
c)
sekwencja
sekwencję,
która
polinukleotydowa
hybrydyzuje
w
ostrych
posiadająca
warunkach
z
sekwencją, która jest komplementarna do sekwencji SEK
ID NR 3, SEK ID NR 5 lub SEK ID NR 7.
3.
25
że
Mikroorganizm według zastrz. 1 znamienny tym,
polipeptyd
posiada
sekwencję
aminokwasową,
która
jest przynajmniej w 95% identyczna z jedną z sekwencji
wybranych z grupy SEK ID NR 4, SEK ID NR 6 i SEK ID NR
8.
4.
30
Mikroorganizm
według
zastrz.
1,
znamienny
tym, że polipeptyd posiada sekwencję, która jest w 100%
50
identyczna z tą z SEK ID NR 4, SEK ID NR 6 lub SEK ID
NR 8.
5.
Mikroorganizm według zastrz. 1 do 4 znamienny
tym, że jest otrzymany przez transformację, transdukcję
5
lub koniugację, lub kombinację tych metod, z użyciem
wektora, który zawiera tę ORF yaaU, allel tej ORF, lub
jej części, i/lub promotor.
6.
liczba
10
Mikroorganizm według zastrz. 1 do 5, w którym
kopii
ORF
lub
alleli
yaaU
jest
Mikroorganizm
według
zastrz.
zwiększona
przynajmniej o 1.
7.
6,
znamienny
tym, że wzrost liczby kopii tej ORF yaaU przynajmniej o
1 jest osiągnięty przez integrację tej ORF lub jej
alleli do chromosomu mikroorganizmu.
15
8.
Mikroorganizm
według
zastrz.
6,
znamienny
tym, że wzrost liczby kopii tej ORF yaaU o przynajmniej
1 jest osiągnięty przy użyciu wektora, który replikuje
się w poza chromosomem.
9.
20
Mikroorganizm
według
zastrz.
1
albo
2,
charakteryzujący się tym, że:
a)
promotor i region regulatorowy lub miejsce
wiązania rybosomu na lewo od ORF yaaU jest zmutowane,
lub
b)
25
na lewo od ORF yaaU są wprowadzone są kasety
ekspresyjne lub promotory.
10. Mikroorganizm
znamienny
tym,
że
ten
według
zastrz.
polinukleotyd
1
albo
2,
yaaU
jest
pod
kontrolą promotora zwiększającego ekspresję genu.
11. Mikroorganizm
30
znamienny
stężenie
tym,
lub
że
według
wzmocnienie
aktywność
produktu
zastrz.
ORF
genu
1
yaaU
do
10,
zwiększa
(białka)
yaaU
51
przynajmniej
o
10%
w
porównaniu
do
aktywności
lub
stężenia produktu genowego w szczepie rodzicielskim lub
mikroorganizmie
nie
rekombinowanym
pod
względem
ORF
yaaU.
5
12. Mikroorganizm
według
zastrz.
1
do
11,
znamienny tym, że inne geny ścieżki metabolicznej dla
biosyntezy
pożądanego
aminokwasu
są
także
obecne
w
postaci ulegającej nadekspresji.
13. Mikroorganizm
10
tym,
że
według
mikroorganizm
zastrz.
jest
12,
znamienny
z
rodzajów
wybrany
Escherichia, Erwinia, Providencia i Serratia.
14. Mikroorganizm
według
zastrz.
1
do
13,
znamienny tym, że produkuje L-treoninę.
15. Sposób wytwarzania L-aminokwasów wybranych z
15
grupy L-treoniny, L-waliny i L-lizyny przez fermentację
rekombinowanych
mikroorganizmów
z
rodziny
Enterobacteriaceae, znamienny tym, że
a)
mikroorganizmy
według
zastrz.
1-14
produkujące ten L-aminokwas są hodowane w pożywce w
20
warunkach, w których ten L-aminokwas jest wzbogacany w
pożywce lub w komórkach, oraz
b)
składniki
ten
L-aminokwas
pożywki
jest
izolowany,
fermentacyjnej,
przez
i/lub
co
biomasa
pozostają w całości lub w części (od ≥ 0 do 100%) w
25
izolowanym produkcie lub są usunięte całkowicie.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że
do
wytwarzania
L-treoniny
w
poddawanych
fermentacji
mikroorganizmach z rodziny Enterobacteriaceae jeden lub
większa liczba genów wybranych z grupy obejmującej:
52
a)
przynajmniej
kodującego
jeden
kinazę
gen
operonu
asparaginianu,
thrABC
dehydrogenazę
homoseryny, kinazę homoseryny i syntazę treoniny,
b)
5
gen pyc z Corynebacterium glutamicum kodujący
karboksylazę pirogronianu,
c)
gen
pps
kodujący
syntazę
fosfoenolopirogronianu,
d)
gen
ppc
kodujący
karboksylazę
fosfoenolopirogronianu,
10
e)
geny
pntA
i
pntB
kodujące
podjednostki
transhydrogenazy pirydynowej,
f)
gen
rhtB
kodujący
białko
pośredniczące
w
białko
pośredniczące
w
oporności na homoserynę,
g)
15
gen
rthC
kodujący
oporności na treoninę,
h)
gen
thrE
z
Corynebacterium
glutamicum
kodujący białko nośnikowe eksportu treoniny,
20
i)
gen gdhA kodujące dehydrogenazę glutaminianu,
j)
gen pgm kodujący fosfoglukomutazę,
k)
gen
fba
kodujący
aldolazę
bifosforanu
fruktozy,
l)
gen
ptsH
kodujący
fosfotransferazę
fosfohistydyna-białko-heksoza,
m)
25
gen
ptsI
kodujący
enzym
I
z
systemu
fosfotransferazy,
n)
gen crr kodujący glukozo-specyficzny składnik
o)
gen
IIA,
ptsG
kodujący
glukozo-specyficzny
składnik IIBC,
30
p)
gen
leucynowego,
lrp
kodujący
regulator
regulonu
53
q)
gen fadR kodujący regulator regulonu fad,
r)
gen
iclR
kodujący
regulator
centralnego
metabolizmu pośredniczącego,
s)
5
gen ahpC kodujący małą podjednostkę reduktazy
wodoronadtlenków alkilowych,
t)
gen ahpF kodujący dużą podjednostkę reduktazy
wodoronadtlenków alkilowych,
10
u)
gen cysK kodujący syntazę cysteiny A,
v)
gen cysB kodujący regulator regulonu cys,
w)
gen
cysJ
kodujący
flawoproteinę
reduktazy
kodujący
hemoproteinę
reduktazy
NADPH-siarczyn,
x)
gen
cysI
NADPH-siarczyn,
y)
15
gen
cysH
kodujący
reduktazę
adenylan-
siarczan,
z)
gen
rseA
kodujący
błonowe
białko,
które
posiada aktywność anty-sigmaE,
a1) gen rseC kodujący globalny regulator czynnika
sigmaE,
20
b1) gen sucA kodujący podjednostkę dekarboksylazy
z dehydrogenazy 2-ketoglutaranu,
c1) gen
sucB
kodujący
podjednostkę
E2
podjednostkę E2 sukcynylotransferazy dihydrolipoilu z
dehydrogenazy 2-ketoglutaranu,
25
d1) gen sucC kodujący podjednostkę β z syntazy
sukcynylo-CoA,
e1) gen sucD kodujący podjednostkę α z syntazy
sukcynylo-CoA,
f1) gen
30
aceE
kodujący
dehydrogenazy pirogronianu,
składnik
E1
kompleksu
54
g1) gen
aceF
kodujący
składnik
E2
kompleksu
dehydrogenazy pirogronianu,
h1) gen
rseB
kodujący
regulator
aktywności
czynnika SigmaE,
5
i1) produkt genowy otwartej ramki odczytu (ORF)
yodA z Escherichia coli,
ulega/ulegają
dodatkowo,
w
tym
samym
czasie,
nadekspresji.
17. Sposób
10
według
zastrz.
15
do
16,
znamienny
tym, że stosowane są mikroorganizmy, w których ścieżki
metaboliczne,
które
zmniejszają
tworzenie
tego
L-
aminokwasu są przynajmniej częściowo atenuowane.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że
do
15
wytwarzania
L-treoniny
poddawane
są
fermentacji
mikroorganizmy z rodziny Enterobacteriaceae, w których
jeden
lub
większa
liczba
genów
wybranych
z
grupy
obejmującej:
20
a)
gen tdh kodujący dehydrogenazę treoniny,
b)
gen mdh kodujący dehydrogenazę jabłczanu,
c)
produkt genowy otwartej ramki odczytu (ORF)
yjfA z Eschericha coli,
d)
produkt genowy otwartej ramki odczytu (ORF)
ytfP z Eschericha coli,
e)
25
gen
pckA
kodujący
karboksykinazę
fosfoenolopirogronianu,
f)
gen poxB kodujący oksydazę pirogronianu,
g)
gen
dgsA
kodujący
regulator
DgsA
systemu
fosfotransferazy,
30
h)
gen fruR kodujący represor fruktozy,
i)
gen rpoS kodujący czynnik sigma38, i
j)
gen aspA kodujący liazę asparaginian-amoniak,
55
jest/są
dodatkowo,
w
tym
samym
czasie,
atenuowane, w szczególności jest/są wyeliminowane, lub
ich ekspresja jest zmniejszona.
5
Evonik Degussa GmbH
Pełnomocnik:
56
1/1