Protein arrays
advertisement
Mikromacierze, mikrochipy, biosensory - prawdziwe czy zludne nadzieje? JAKUB GOLAB -OMICS w biologii i medycynie: Genomics Proteomics Glycomics Transcriptomics Lipidomics Metabolomics Jaka jest skala? DNA: (3 miliardy par zasad) mRNA: (23 500 genów + ???? niekodujacych sekwencji) Bialka: (200,000 - 500,000) Podwójna helisa DNA Typowy przebieg analizy Start z dwoma zestawami próbek – badana i kontrolna Liza komórek i izolacja mRNA Odwrotna transkrypcja i znakowanie fluorochromami Hybrydyzacja i analiza Zasada dzialania biosensorów DNA (Target Sequence) (Hybridization) ssDNA (Probe) (Stable dsDNA) Assign each box a score based on this relative expression level x10 Represse d 1:1 x10 Induced Normal vs. Normal Normal vs. Tumor Ten sam genom – dwa odmienne proteomy Czipy bialkowe Trzy rózne typy Curr Opin Chem Biol. 2001, 5, p40–45 Microarray Spotting Cele analizy proteomicznej: • Jednoczasowa analiza i charakterystyka wszystkich bialek w badanej próbce • Identyfikacja bialek i okreslenie ich ilosci • Charakterystyka zmian posttranslacyjnych w bialkach • Okreslenie budowy przestrzennej bialka • Identyfikacja interakcji miedzy bialkami lub bialkami i innymi strukturami Mikromacierze bialkowe a mikromacierze DNA • Znacznie trudniejsza izolacja bialek (uzycie detergentów wplywajacych na konformacje) • Wiele bialek ma tendencje do agregacji, moga sie wytracac • Bialka sa zróznicowane chemicznie (moga byc lipofilne lub hydrofilne, moga wiazac metale) • W przeciwienstwie do DNA bialka sa bardziej heterogenne i trudniej wyznakowac je fluorochromami • Znakowanie bialek fluorochromami moze wplywac na ich interakcje z przeciwcialami Obecne metody wykorzystywane w komponowaniu mikromacierzy bialkowych Rózne fluorochromy nature genetics 2002, suppl., 32, p528 Problemy wynikajace z tendencji bialek do tworzenia kompleksów i agregatów nature genetics 2002, suppl., 32, p529 Przyklad: „Chip bialkowy” utworzony jest z 6,566 próbek reprezentujacych 5,800 unikatowych bialek, które sa nalozone w dwóch powtórzeniach na pokrytym niklem szkielku mikroskopowym. Science 2001, 293, p2101 Jak to dziala? Sygnaly falszywie dodatnie i falszywie ujemne Specyficzna interakcja Interakcja falszywie dodatnia Niespecyficzny sygnal Improving performance Secondary signal amplifier Highly specific detection Magnectic bead, fluorecent dye, enzyme etc Inert background vv v Mikromacierze tkankowe (TMA) Tissue Microarray • Setki bardzo malych (0.6 mm srednicy) cylindrycznych fragmentów badanej tkanki – gesto i precyzyjnie wtloczonych w blok parafinowy • Mozliwosc wykrojenia do 300 seryjnych skrawków o grubosci 4-8 µm Co nam to daje? W przyszlosci • Analiza proteomiczna z kropli krwi, ze sliny, z moczu, z potu, z wydychanego powietrza, z kaluzy, • Szybkie testy przy lózku chorego • Natychmiastowa odpowiedz i podpowiedz dotyczaca najskuteczniejszego leczenia • Badanie przesiewowe calej populacji i okreslenie chorób przyszlosci • Analiza zmian w pojedynczej komórce • Inne pomysly?
