Slajd 1

Metody bioinformatyki
Podstawy inżynierii
genetycznej
prof. dr hab. Jan Mulawka
Czym jest inżynieria
genetyczna
• Zbiór technik rekombinowania i
klonowania DNA
• Wydzielanie i charakteryzowanie
pojedyńczych genów
• Poznaje się strukturę i działanie
genów
Fragmentowanie DNA
• Gdy poszukujemy pojedynczych
genów w genomie danego
organizmu
• Narzędziem są na ogół enzymy
restrykcyjne
• Można też użyć ultradźwięków
przepuszczając DNA przez
wąską kapilarę
Enzymy restrykcyjne
endonukleazy
• (restryktazy)
• Enzymy klasy II
• Tną dwuniciowe DNA w specyficznym miejscu
wyznaczonym przez charakterystyczny dla tego
enzymu ciąg nukleotydów. Np. enzym EcoRI
wytwarzany przez E. coli tnie pomiędzy G oraz A
(w nici wiodącej) oraz pomiędzy A oraz G (w nici
opóźniającej), jeśli napotka następującą
sekwencję:
5' : : : GAATTC : : : 3'
3' : : : CTTAAG : : : 5'
• Rekombinowanie DNA in vitro to
łączenie fragmentów DNA
• Enzym ligazy DNA wytwarza
wiązania fosfodiestrowe
• Wektory to niewielkie cząsteczki
DNA mające zdolność do
samodzielnej replikacji w
komórce
Klonowanie DNA
• Podłączony do wektora fragment DNA
będzie po wprowadzeniu
zrekombinowanej cząsteczki do
komórki ulegał powielaniu
• Podczas klonowania strawione przy
pomocy enzymów restrykcyjnych
fragmenty DNA ligujemy z wektorami
a następnie wprowadzamy je do
komórek w procesie transformacji
Wektory plazmidowe
• Plazmid to mała kolista cząstka DNA, która
nie jest związana z żadnym chromosomem.
• Może być wprowadzona do komórki
bakterii, od której się wywodzi. Często
używa się plazmidów E. coli.
• Plazmid musi zawierać miejsce startu
replikacji (aby mógł się replikować, gen lub
kilka genów odpowiedzialnych za
odporność na pewne anybiotyki.
• Pozostaje jeszcze pewna część w DNA
plazmidu, w którą można wstawić fragment
obcego DNA (o długości do 15-20 kbp)
• Następnie hoduje się bakterie, dodając
antybiotyk. Te bakterie, które zawierają
plazmidy z genem odporności na ten
antybiotyk przeżywają
• Powstaje w ten sposób kolonia klonów
Wektory fagów
• Fagi są wirusami atakującymi bakterie E.coli
• Ich genom ma rozmiar 50 kbp, z czego 25 kpb
można usunąć, wymieniając na obcy DNA, bez
wpływu na proces infekowania bakterii
• Fag namnaża się w zainfekowanej komórce,
produkując nawet więcej niż 100 kopii w jednej
komórce
• Zabija przy tym bakterię, uwalniając
zreplikowane nowe kopie wirusa
• Przygotowanie zmutowanych fagów można
przeprowadzać in vitro
Inne wektory
• Kosmidy: połączenie techniki
wykorzystania plazmidów z techniką
fagów
• Tworzy się duże plazmidy, które są
wprowadzane do bakterii przy pomocy
„obudowy" od fagów
• Dzięki temu pomysłowi można tworzyć
wstawki o długości 45 kbp
• Wektory P1: 100 kbp
Mapa restrykcyjna
Jest to obraz cząsteczki DNA,
na którym zaznaczone są
miejsca rozpoznawane przez
różne enzymy restrykcyjne z
uwzględnieniem odległości
między nimi wyrażonej w
nukleotydach.
Elektroforetogram dla wektorów
pUC19 i pMS02
Mapa restrykcyjna wektora
pMS02
Mapa plazmidu pBR322
• Podkreślono symbole enzymów
przecinających cząsteczkę tylko
w jednym miejscu
• Liczby oznaczają numer kolejny
nukleotydu od EcoRI
Zastosowanie plazmidu
pBR322 do klonowania DNA
• Wyróżnianie klonów zawierających
zrekombinowane wektory
Mapa restrykcyjna plazmidowego wektora
pUC19
Wytwarzanie krótkich delecji i insercji
w sklonowanych genach
Wytwarzanie serii delecji
genowych
Metody sekwencjonowania
• Metoda chemiczna Maxama-Gilberta (1977)
• Przeprowadza się cztery reakcje chemiczne, które
tną nić DNA w miejscach A+G (puryny), C+T
(pirymidyny), C
• Reakcja jest tak przeprowadzana, aby każdą nić
przeciąć tylko w jednym miejscu
• Używając elektroforezy na żelu, porównuje się
długości pociętych fragmentów(radioaktywnie
zaznacza się jeden koniec nici i przeprowadza
autoradiografię prążków powstałych w żelu). Ta
metoda jest pracochłonna i kosztowna
Sekwencjonowanie DNA metodą Maxama i
Gilberta
Metoda enzymatyczna
Sangera (1977)
• Matrycą jest jednoniciowe DNA. Do niej dołącza się
starter (tzw. primer)
• Jest on syntetycznie wyprodukowany. Jego koniec 5'
jest oznakowany radioaktywnie
• Proces przeprowadza się w 4 probówkach. W każdej
z nich znajduje się matryca ze starterem,
nukleotydy A, C, G, T oraz jeden z czetrech
rodzajów nukleotydów pozbawiony grupy 3'hydroksylowej (tzw. dideoksy ATP, CTP, GTP, TTP)
• Do tego dodaje się enzym DNA polimerazy, który
powoduje wydłużanie nici zaczynającej sie starterem
• Dołączenie w danym momencie dideoksy powoduje, że
proces wydłużania zostaje zatrzymany (bo nie ma
końca 3')
• Następnie denaturuje się podwójne nici, wykonuje
elektroforezę dla porównania długości i przeprowadza
autoradiografię prążków powstałych w żelu
Sekwencjonowanie DNA metodą
Sangera
Technika PCR
• PCR (Polimerase Chain Reaction) reakcja
łańcuchowa polimerazy odkryta przez
Kary Mullisa (1985)
• Jest używana do szybkiego kopiowania
materiału genetycznego
• Proces ma charakter wzrostu
wykładniczego
Podstawowe kroki procesu
PCR
• Chcemy powielić materiał genetyczny
zawarty w pewnym regionie DNA
• Wytwarzamy syntetycznie startery (dwa
rodzaje), których pozycje będą
ograniczały ten region z obu stron
• Dajemy bardzo dużo starterów oraz
wolnych nukleotydów do materiału,
który mamy powielić
• Dodajemy enzym polimerazy (Taq
polimerazę z bakterii Thermus
aquaticus, żyje w 72C)
Powtarzamy cyklicznie trzy
kroki:
1. Podgrzewamy roztwór do temperatury 95C.
Następuje denaturacja nici materiału genetycznego
2. Ochładzamy do 60C. Wówczas startery łączą się z
pojedynczymi nićmi
Ponieważ materiału genetycznego jest mało w
porównaniu z liczbą starterów, to szansa połączenia
nici materiału genetycznego ze sobą jest mała
3.Następuje faza budowania nowych
(komplementarnych) nici przez enzym
polimerazy. Po zakończeniu tej fazy cykl
powtarzamy tak długo aż uzyskamy
odpowiednią ilość materiału genetycznego.
Po każdym cyklu PCR ilość materiału
genetycznego podwaja się. W ten sposób
można powielać (amplifikować) fragmenty o
długości do 20 kbp
• Przykładowe zastosowanie: wykrywanie
wirusa HIV w bardzo wczesnym stadium
zarażenia (przed wystąpieniem objawów)
Biblioteki genomowe
• Pobiera się genomowe DNA, tnie na kawałki
20 kbp przy pomocy enzymu, którym się
również tnie genom faga
• Następnie tworzy się zrekombinowane fagi po
czym zaraża nimi bakterie, aby wytworzyć
dużą liczbę kopii
• Tak otrzymane kolonie nazywają się
bibliotekami genomowymi
• Zamiast faga używa się również plazmidów
czy też sztucznych chromosomów
Historia poznawania
sekwencji genomów
Zsekwencjonowanych jest ponad 180 genomów
różnych organizmów. Poniżej przedstawiono
chronologię najważniejszych wydarzeń
związanych z projektami sekwencjonowania:
• Bakteriofag X174 (5,4 kbp) pierwszy całkowicie
zsekwencjonowany w całości materiał
genetyczny (Sanger, 1972)
• Fag (48,5 kbp), Sanger 1982
• Bakteria Haemophilus influenze (1 830 kbp),
Venter 1995
• Bakteria Mycoplasma genitalium (580 kbp),
Venter 1995
• Drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae (13
500 kbp) { pierwszy genom eukariota,
(współpraca międzynarodowa), 1996
• Bakteria Escherichia coli (4600 kbp), 1997
• Nicień Caenorhabditis elegans (100600 kbp) 1998
• Człowiek, chromosom 22, (35600 kbp)
1999
• Człowiek, chromosom 21, (34ó00 kbp)
2000
• Muszka owocowa Drosophila
melanogaster (160600 kbp) 2000.
• Rzodkiewnik Arabidopsis thaliana
(100600 kbp), 2000
• Człowiek, cały genom Homo sapiens
(3500600 kbp), 2001
• Mysz Mus musculus (3600600 kbp),
2002
• Kurczak Gallus gallus (1 300600
kbp), 2004
• Ryż Oryza sativa (390600 kbp),
2005
• Szympans Pan troglodytes (3
100600 kbp), 2005
Genom człowieka (Human
Genome
Project)
• Zapis całego genomu zajmie (używając alfabetu
A,C,G,T) około 750 Mb pamięci
• Inicjatywa projektu powstała w USA pod koniec 1984
• Uruchomienie projektu nastąpiło w 1988
• Główną rolę przy realizacji przewidziano dla NIH
(National Institutes of Health) ale również mocno
zaangażowany jest Departament Energii
Główny udział w
odkodowaniu ludzkiego
genomu mają:
• Francis Collins
• Craig Venter
• Projekt zaplanowano na 15 lat i łączny
budżet 3 mld USD (po 200 mln USD na rok)
• Jest to obecnie bardzo duże
międzynarodowe przedsięwzięcie, w którym
udział biorą m.in.: USA, Francja, Japonia,
Niemcy, Rosja, Wielka Brytania
• W lutym 2001 zaanonsowano ukończenie
pierwszego szkicu całego genomu
człowieka
Francis Collins i Craig Venter
na spotkaniu 26.06.2000
u prezydenta Billa Clintona
• Spotkaliśmy się , żeby obejrzeć mapę o
jeszcze większym znaczeniu dla ludzkości
• Otwiera się dla nas nowa era
• Posiedliśmy moc uzdrawiania
• Genetyka zrewolucjonizuje medycynę
• Genetyka wyleczy nas z większości, choć nie
ze wszystkich chorób
Przewidywania Collinsa na rok
2010
• Genetyczne testy diagnostyczne na co
najmniej 12 różnych chorób będą
powszechnie dostępne
• Będziemy mogli zmniejszyć ryzyko
zachorowania na kilka z tych chorób
• Wielu lekarzy pierwszego kontaktu
będzie korzystało z medycyny opartej na
genetyce
• Diagnostyka preimplantacyjna będzie
powszechnie dostępna
Nie sprawdziły się
przewidywania
• Odnośnie powstania nowych leków dzięki
inżynierii genetycznej (zarzuca się koncernom,
że często tworzą leki bez zrozumienia biologii)
• Nie osiągnięto zbyt wiele w dziedzinie genetyki
raka, mimo że poświęcono na to wiele czasu i
ogromne fundusze
• Chociaż koszt odczytywania materiału
genetycznego spada, to jednak zalewa
uczonych fala informacji, która przeciąża ich
umysły i dyski komputerów
Osiągnięcia w inżynierii
genetycznej dokonane przez
ostatnie 10 lat
• Nastąpił ogromny postęp w technologiach
odczytujących DNA
• Drastyczny spadek ceny za te usługi –
zmniejszyły się one 14 tysięcy razy!
• Odczytano pełną informację genetyczną wielu
organizmów w tym 14 gatunków ssaków
• Rozwój genetyki zmienił prace ewolucjonistów
• Udostępniono już genomy 13 osób
Dzisiejsza genetyka rozwija
się w dwóch kierunkach
• Odczytywanie jak największej
ilości materiału genetycznego,
by mieć bazę do porównań
• Poszukiwanie odpowiedzi na
pytanie, jakie jeszcze funkcje
pełni w organizmie ludzkim DNA
Rola ciemnej materii DNA
• Nasze skłonności do chorób w
większości wcale nie znajdują się w
genach
• Przypuszcza się, że zapisane są one w
tzw. ciemnej materii DNA (introny)
• Materiał ten na pierwszy rzut oka jest
śmietnikiem i nie koduje niczego
• Jak mamy szukać informacji, jeśli nie
wiemy, co jest śmieciem, a co nie
Sztuczne życie
• W maju 2010 Craig Venter poinformował o
stworzeniu pierwszej komórki, której kod
genetyczny został w całości wyprodukowany
przez człowieka w laboratorium
• Opracowanie technologii syntetycznej
bakterii
• Bakteria ta ma przetwarzać dwutlenek węgla
na paliwo
• Venter postanowił opatentować swoją
metodę naukową
Dalszy postęp inżynierii
genetycznej upatruje się w:
• Ogólnym postępie technologicznym
• Użyciu superkomputerów
działających z szybkością tysiąc razy
szybciej do porównań tysięcy DNA
• Odczytaniu informacji zawartych w
bakteriach